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关键词： β-烟酰胺单核苷酸   枯草芽孢杆菌   基因工程   发酵工程  

摘要： β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide,NMN）也被称为烟酰胺单核苷酸和β-烟酰胺D-核糖核苷酸。作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）合成的关键前体之一,NMN可通过提高NAD+水平治疗心血管疾病和糖尿病等退行性疾病,在医药保健等领域市场前景广阔。目前的NMN生产工艺较为复杂,且需要添加价格昂贵的前体底物,进而提高了NMN的生产成本上升,导致NMN售价昂贵,限制了其大规模推广应用。 本论文针对目前NMN生产成本偏高的问题,为了降低生产成本,以食品安全菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为底盘,以pMA5为载体,通过强化葡萄糖-色氨酸/烟酸-NMN途径中多个关键基因。构建高产工程菌株。 本研究过表达了从头合成途径和烟酸通路至NMN路径中的基因PncB、NadC等,构建了17株枯草芽孢杆菌基因工程菌株。对构建的基因工程菌株通过卡那霉素抗性初筛、PCR测序验证和摇瓶发酵复筛。摇瓶发酵结果表明:基因工程菌株的菌体生长曲线与出发菌株随时间变化类似且生物量高于出发菌株,各工程菌株NMN产量较出发菌株*** WB600分别提高了20%-110%。对添加转运蛋白的菌株*** PncB-PnuC和*** NadC-PnuC进行胞内外NMN产量对比,发现过表达PnuC菌株的胞外NMN产量均占到总细胞含量80%以上,证明转运蛋白具有将NMN转运至胞外的能力。将摇瓶发酵NMN产量较高的基因工程菌株*** FtNadE-PncB、*** PncB-PnuC与出发菌*** WB600分别进行5L发酵罐分批发酵和补料分批发酵,补料分批发酵产生的NMN产量较分批发酵NMN产量均有不同程度提高。高产工程菌株*** FtNadE-PncB和*** PncB-PnuC 5L发酵罐补料分批发酵NMN产量最终达到3.59g/L和3.39g/L。生物量和较原始菌株分别增长31.22%和35.48%,产量同比增长111%和122%。 以上结果说明,对上FtNadE、PncB和PnuC基因表达的加强均对枯草芽孢杆菌合成NMN具有积极影响,成功构建了利用葡萄糖、蛋白胨等廉价原料直接发酵生产NMN的工程菌株。

关键词： 鸽圆环病毒   Cap蛋白   间接ELISA   原核表达   免疫原性  

摘要： 鸽圆环病毒（PiCV）自1993年于美国首次被发现,随后在世界各地相继报道,表明PiCV感染呈现全球分布趋势。PiCV主要感染2～12月龄的青年鸽,引起机体免疫抑制,增加机体继发感染其他病原体的风险,已成为危害养鸽产业发展的重要病原之一,因此,建立有效预防PiCV的防控措施刻不容缓。目前,PiCV缺乏合适的体外培养细胞系,难以分离,鸽圆环病毒病灭活疫苗和减毒疫苗的研究受到一定程度的阻碍,相关疫苗的研究仅仅局限在以Cap蛋白为基础的亚单位疫苗上。Cap蛋白作为PiCV唯一的结构蛋白和免疫原蛋白,是血清学诊断抗原和基因工程疫苗研制的首选蛋白。本研究通过大肠杆菌系统表达Cap重组蛋白构建鸽圆环病毒病亚单位疫苗候选株,并对其免疫原性进行初步评价。 本研究利用原核表达载体pGEX-4T-1成功表达了可溶的全长PiCV Cap重组蛋白,以其为包被抗原,建立了适用于检测候选疫苗免疫效果的PiCV抗体间接ELISA方法。结果显示,最佳抗原包被浓度为0.25 mg/L,5%BSA作为封闭液37℃孵育2h,待检血清最佳稀释度为1∶800,孵育时间为45 min,家兔抗鸽Ig G-HRP二抗最佳稀释度为1∶8000,孵育时间为30 min,最佳显色时间为15 min,当检测样品OD450nm≥0.34则判定其为阳性。经测定,该方法与鸽腺病毒、鸽疱疹病毒、鸽Ⅰ型副黏病毒和轮状病毒的阳性血清均无交叉反应;对稀释至1∶12800的血清仍可检测出阳性,批内和批间变异系数均小于10%。 通过在线软件对鸽圆环病毒Cap基因序列进行分析后,发现Cap蛋白N端存在核定位信号区域（NLS）,通过PCR分别扩增删除核定位信号区域的Cap基因片段（ΔNLS-Cap）和全长Cap基因片段（FL-Cap）,将两者克隆至p ET-28a载体中。在37℃条件下进行诱导表达,结果表明,重组蛋白ΔNLS-Cap表达量高,大部分以包涵体形式存在;重组蛋白FL-Cap表达量很低,大部分为可溶性表达。经优化试验表明,25℃为两种重组蛋白可溶性表达的最适温度。经镍柱亲和层析纯化和Western Blot鉴定验证后,将两种重组蛋白分别与白油佐剂和GEL 01水佐剂联用制备成亚单位疫苗免疫鸽子,结果表明,三种疫苗免疫组均能诱导机体产生特异性抗体;且都能刺激外周血中的淋巴细胞增殖;ΔNLS-Cap+白油组、FL-Cap+白油组和FL-Cap+GEL 01组的IFN-γ、TNF-α和IL-4含量均高于PBS组,表明三种疫苗能激活Th1型和Th2型细胞免疫反应。其中,FL-Cap重组蛋白与GEL 01水佐剂联用后诱导鸽子产生了较好的免疫原性。 综上所述,本研究基于可溶的全长Cap重组蛋白成功建立了一种检测PiCV抗体的间接ELISA方法,可用于PiCV候选疫苗免疫效果的评估。利用大肠杆菌表达系统成功构建了具有良好免疫原性的鸽圆环病毒病亚单位疫苗候选株,为制备鸽圆环病毒病亚单位疫苗及相关生物制品奠定了基础。

关键词： PRC1   CBX蛋白   CBX7C   相分离   胚胎干细胞   表观遗传调控  

摘要： 多细胞生物的生长发育需要通过分化获得形态和功能各异的细胞类群,并维持其正常的生物学特性。在特定的细胞类型中,特异性基因的表达对于细胞正常生物学功能的发挥至关重要,而其它细胞类型相关的基因则被稳定抑制。多梳蛋白家族Pc G(Polycomb group,Pc G)介导的表观遗传调控使其靶基因在分化过程中以细胞类型特异的表达模式被抑制,在发育和维持特定细胞状态中发挥重要作用,是调控细胞命运决定和发育过程中诸多重要细胞生物学过程的关键机制之一。Pc G蛋白家族中主要包括了两类多梳蛋白抑制复合体,PRC1和PRC2(Polycomb group repressive complex 1/2),它们彼此协同抑制基因表达并维持部分基因的沉默状态。PRC1蛋白复合体识别并结合目标染色质主要依赖于含有染色质结合结构域(Chromodomain,CD)的染色质同源框蛋白(Chromobox homolog protein,CBX)家族蛋白对组蛋白甲基化修饰标签的特异性识别并结合。CBX7蛋白是哺乳动物胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)中PRC1蛋白复合体的核心组分之一,介导对H3K27me3的识别和结合,进而在靶基因上装配PRC1并执行转录抑制调控。 本论文基于真核生物基因转录的选择性剪接现象,通过多种生理生化、细胞生物学及分子生物学方法探究了CBX7的三种不同蛋白亚型(CBX7A、CBX7B和CBX7C)的表达模式差异、参与复合体组装基因调控的分子机制、相分离性质及在小鼠ESC(m ESC)分化过程中的独特生物学功能。 首先,研究发现CBX7C蛋白亚型主要在m ESC和小鼠脾脏组织中特异性表达。与CBX7A和CBX7B相比,仅保留了介导染色质结合的N端CD结构域,而缺失了与RING1B互作并介导参与cPRC1复合体组装的C端PC结构域,并由于基因转录的选择性剪接而产生独特的C端区域。 其次,cPRC1复合体组装的分子机制具有复杂性和多样性。本论文研究发现丧失了RING1B结合活性的CBX7C能够通过与PHC2之间的互作而参与完整的功能性cPRC1复合体在染色质上的组装,并作为表观遗传调控因子参与靶基因的转录抑制调控。利用独特的复合体组装机制研究实验系统(HTM介导的异位靶向系统),证实了CBX7能够作为“点火装置”招募并促进其它复合体组分在靶基因位点的组装起始。在复合体组装过程中,CBX7C能够作为CBX7A的竞争者与PHC2互作并替代其结合靶基因参与转录调控。 再次,在m ESC中,表达水平相对较低的CBX7C对维持细胞正常生长具有重要作用。CBX7C蛋白的敲低能够导致严重的m ESC生长缺陷。与维持m ESC干性的CBX7A/B不同,CBX7C作为促进因子在m ESC分化为类胚体(Embryoid body,EB)的过程中,其表达水平与PHC2协同显著增加,与EB的生长速率及状态呈正相关。 最后,研究发现含有IDRs基序的CBX7C能够驱动相分离的发生。CBX7C·PHC2凝集体的固有性质因其细胞剂量而异。在正常浓度下,形成了具有催化活性的Pc小体。而当浓度高于阈值时,发生了液-固相分离,形成致密的排斥染色质的水凝胶状结构。CBX7C的N端主要介导CBX7C·PHC2的二聚体形成,而C端主要在促进具有水凝胶性质的CBX7C·PHC2凝集体的形成中发挥作用。 此外,在m ESC中共表达的CBX2和CBX7通过ATH或ATHL结构域而发生相互作用,并以此为分子基础共同结合至靶基因而发挥生物学功能。 综上所述,本论文揭示了CBX7C与PHC2的互作在PRC1在染色质上的组装及Pc小体形成过程中的独特作用和分子基础,强调了CBX7C在m ESC分化中的重要作用,并开辟了一条通过调节其相分离性质来控制PRC1活性的新途径,揭示了含有CBX7C的cPRC1复合体执行表观抑制的新机制。研究结果不仅为进一步阐明相分离在转录调控中的功能提供了重要信息,而且为深入解析m ESC中共存的不同CBX-PRC1复合体协同调控靶基因转录抑制的分子机制提供精确的分子生化证据。

关键词： 糖原合成激酶3α   糖原合成激酶3β   神经干细胞   命运决定   神经分化  

摘要： 背景 神经元损伤是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中一种常见且难以修复的病理损伤,对人类健康造成严重威胁,也给社会带来沉重的负担。神经干细胞(neural stem cells,NSC)具有自我更新和向神经谱系分化的潜能,NSC的发现和研究为神经元修复再生提供了新思路。然而NSC的命运决定(fate determination),包括自我更新(NSC自我复制增殖,维持原始状态)和多向分化(NSC向神经元、神经胶质细胞等神经系统细胞的分化),其影响因素和机制尚未明确,而且诱导其定向分化的技术也尚未成熟,严重限制了 NSC在临床治疗中的应用。糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)是一种广泛存在于各种细胞的丝/苏氨酸激酶,由两种已知的基因GSK3A和GSK3B编码产生两种同工酶GSK3α和GSK3β。GSK3与许多临床疾病密切相关,成为治疗多种疾病的靶点。在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的命运决定中,GSK3发挥着重要的作用,抑制GSK3的活性可以促进ESC自我更新并抑制其分化。GSK3也参与调控NSC的命运,大多数观点认为抑制GSK3的活性有助于促进NSC的自我增殖,而GSK3的激活则促使NSC向神经元分化。然而,也存在一些研究结果与此相反,导致现有研究结果不一致的原因是未考虑到GSK3的两个同工酶可能发挥不同作用。因此,研究GSK3α和GSK3β对NSC命运决定的影响及其潜在机制将有助于促进NSC在临床应用中的发展。 目的 探究GSK3α和GSK3β对小鼠NSC命运决定的影响及其潜在机制。 方法 利用CRISPR/Cas9技术构建自C57BL/6N小鼠来源的Gsk3a和Gsk3b分别敲除的ESC,在体外对其进行神经诱导分化,并通过转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)分析ESC和NSC阶段的基因表达差异。 结果 Gsk3a-/-或Gsk3b-/-ESC仍然具有多能性,并且能够分化成NSC。然而,Gsk3b-/-无法形成神经花环,其NSC也不能进一步分化成神经元和胶质细胞。检测三胚层标志物的mRNA表达发现,Gsk3a-/-神经外胚层标志物的表达略高于WT组,而Gsk3b-/-内胚层标志物的表达远高于WT组和Gsk3a-/-,神经外胚层标志物的表达较低。RNA-seq结果显示,与ESC阶段相比,NSC阶段差异基因进一步增多,涉及 PI3K-Akt、Rap1、Wnt 等信号通路以及Atoh1、Neurog1、Hes1、Casz1、Sox2、Elf5等基因的变化 结论 Gsk3a-/-ESC或Gsk3b-/-ESC均能分化成NSC,但Gsk3b-/-NSC无法分化成神经元。Gsk3a-/-可能有利于促进神经分化,而Gsk3b-/-则抑制神经分化并促进向内胚层分化。其机制可能与PI3K-Akt、Rap1、Wnt等信号通路,以及Atoh1、Neurog1、Hes1、Casz1、Sox2、Elf5 等基因有关。

关键词： 肺类器官   传统卷烟   加热卷烟   胚胎干细胞   毒性评价  

摘要： 大部分毒理学研究主要依赖于动物模型或细胞模型。然而,由于实验动物具有种属差异。同时,常用的体外细胞系可能在生理学等方面存在差异。与此相对,人群实验则面临着重大的伦理挑战。而肺类器官是由干细胞或特异性祖细胞通过3D培养形成的一种能够更加真实地在体外条件下模拟肺的结构和功能的组织类似物,与人体肺组织具有较高的同源性。肺类器官的培养方法根据来源主要分为三种:肺部成体干细胞来源的肺类器官、人类多能干细胞(human pluripotent stem cells,h PSCs)来源的肺类器官和肺癌类器官。作为一种新的体外研究模型,肺类器官能够在体外条件下实现对于机体发育过程、组织内稳态和复杂生理病理状况的评价。而肺类器官被广泛应用于研究和医学实验中,为了解烟草制品诱导的肺部毒性提供了重要工具。 加热卷烟的气溶胶中依然存在可导致细胞毒性、遗传毒性和氧化应激的成分。这些成分能够引发炎症反应,损伤肺部组织,甚至可能诱发免疫系统的过度反应。这种炎症反应不仅会导致肺部组织的损伤,还可能激发免疫系统的过度反应,加剧炎症的程度。研究表明,长期吸烟会导致肺部炎症的持续存在,从而增加了患上慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、支气管炎等呼吸系统疾病的风险。因此,有必要建立基于肺类器官的加热卷烟毒性评价体系。 为了探究肺类器官模型的构建以及加热卷烟制品(Heated tobacco products,HTPs)在内的烟草制品体外毒性评价,本研究首先通过免疫荧光确定了h ESCs的分化潜能,随后利用人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,h ESCs)成功诱导了人源肺类器官(Airway organoids,AOs),免疫荧光鉴定显示AOs中成功表达纤毛细胞标志物Acetylatedα-Tubulin、分泌细胞标志物MUC5AC、气道类器官标志物NKX 2.1。随后利用小鼠成体干细胞成功诱导了小鼠肺类器官(Mouse airway organoids,MAOs)。此外,对MAOs进行转录组测序发现,MAOs与亲源肺组织高度相似,同时免疫荧光鉴定结果显示,MAOs成功表达肺组织相关细胞的分子标志物,如纤毛细胞(Acetylatedα-tubulin)、基底细胞(P63)及分泌细胞(MUC5AC)。利用MAOs对加热卷烟进行体外毒性评价体系的构建,包括对细胞模型及动物模型中常见指标,如细胞毒性、遗传毒性、氧化应激、炎症因子分泌等指标进行评价。并添加了类器官特有评价指标,如类器官直径、黏液蛋白分泌及细胞种类变化等。这进一步丰富了加热卷烟制品毒性评价体系,能够作为细胞模型及动物模型的替代方法。随后通过结合LTβR表达、Caspase 3表达以及炎症因子分泌实验数据发现LTβR信号通路可能参与了加热卷烟制品诱导的炎症反应。 综上所述,本研究构建并验证了一种AOs及MAOs模型,并基于MAOs利用加热卷烟及传统卷烟成功构建体外毒性评价体系。

关键词： 人胚胎干细胞   子宫内膜上皮样细胞   子宫内膜基质样细胞   子宫内膜类器官   激素反应性  

摘要： 【背景与目的】随着社会经济发展和人们生活方式的改变,我国不孕率逐年攀升。辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)作为不孕症的有效治疗手段,其总体成功率约40%。子宫内膜是影响ART结局的重要因素,因此了解子宫内膜容受性和蜕膜化机制对胚胎成功植入至关重要。受限于伦理和动物模型,我们缺乏能够精确模拟体内真实环境的研究模型。随着类器官技术的发展,子宫内膜类器官已成为研究子宫内膜疾病和探索胚胎植入机制的重要手段。目前大多数子宫内膜类器官来源于不同个体的原代组织或者永生化的细胞,但是存在个体异质性或细胞核型改变等问题,使其无法准确模拟体内正常子宫内膜的结构与功能。因此,探索新的子宫内膜类器官培养体系尤为重要。本研究使用细胞因子和小分子化合物将人胚胎干细胞定向诱导生成子宫内膜上皮样细胞(Endometrial Epithelium like cell,EPLC)和子宫内膜基质样细胞(Endometrial Stromal like cell,ESLC),再利用诱导的细胞构建子宫内膜类器官,为深入探索子宫内膜容受性机制和早期胚胎植入的复杂过程提供新型的体外研究模型。 【实验方法】1.对人胚胎干细胞(hESC-3)进行复苏、培养、传代,并用免疫荧光技术对其进行多能性的检测;2.通过细胞因子和小分子化合物将hESC-3分别诱导至定向内胚层(Definitive endoderm,DE)和中间中胚层(Intermediate Mesoderm,IM),再进一步定向诱导生成EPLC和ESLC,通过免疫荧光、实时定量PCR和转录组测序鉴定诱导细胞;3.将诱导的EPLC用基质胶组装成子宫内膜上皮类器官(Endometrial Epithelium Organoids,E-EO),再与蜕膜化后的ESLC混合培养构建子宫内膜类器官(Endometrial Organoids,EO),并对类器官进行激素处理。使用实时荧光定量PCR、免疫荧光、HE染色、PAS染色等技术验证类器官的结构和功能。 【结果】1.免疫荧光结果显示hESC-3表达多能性标志蛋白(OCT4、TRA-1-60),表明该干细胞具有多能性;***-3从DE向EPLC的诱导过程中,实时荧光定量PCR结果显示多能性标志基因表达量逐渐降低,上皮谱系标志基因(FOXA2、KRT17、Ecadherin)的表达量逐渐升高,转录组测序数据结果显示EPLC在分子特征与功能特征上与体内的子宫内膜上皮细胞相类似,证明hESC-3成功诱导成具有上皮特征的EPLC;***-3从IM向ESLC的诱导过程中,ESLC细胞形态与原代子宫内膜基质细胞相似,实时荧光定量PCR和免疫荧光结果显示ESLC表达子宫内膜基质标记基因(HOXA11、Vimentin)。ESLC蜕膜化诱导后高表达蜕膜化相关标志基因(ESR、PRL、IGFβ-1),转录组测序结果进一步证明ESLC具有基质相关特征;***与ESLC通过基质胶混合培养构建的EO,并进行激素处理。q PCR结果显示在激素处理过程中上皮标志基因(KRT17、FOXA2)和蜕膜化标志基因(RPL、OLFM4)表达量逐渐升高,激素受体基因(ESR、PGR)在诱导增生期表达量最高,在诱导分泌期略下降,证明EO具有激素反应性,能模拟体内增生期和分泌期特征;5.免疫荧光结果显示该类器官能够表达上皮类标志蛋白(FOXA2、E-cadherin、KRT17)、蜕膜化标志蛋白(ESR、PGR、PAEP)以及标志极性的蛋白(α-tubulin、laminin),HE染色和糖原染色结果表明EO具有腺体结构和分泌粘液的功能,证明EO在结构与功能上与体内相似。 【结论】hESC-3能成功定向诱导生成具有上皮特征的EPLC和具有基质特征的ESLC,对这两种细胞混合构建的EO进行激素处理后,EO具有激素反应性,能模拟子宫内膜的增生期和分泌期特征,在结构与功能上与体内子宫内膜相似,可作为新型的子宫内膜体外研究模型。