关键词：
唐氏综合征
人胚胎干细胞
染色质空间构象
转录调控
基因表达
摘要：
背景:唐氏综合征(Down’s syndrome,DS),世界范围内发病率在1/600-1/800之间,是人类最常见的染色体非整倍体疾病。多数于孕早期自然流产或孕中期产前诊断后行人工流产,而少数活产者主要临床症状表现为特殊面容,生长、智力发育迟缓,合并多发脏器畸形。DS作为严重的出生缺陷病之一,目前在临床上缺乏有效的治疗方式,不只严重降低了患者生活质量,同时给家庭造成巨大的经济负担,导致因病返贫。既往研究表明唐氏综合征关键区域(Down’s syndrome critical region,DSCR)上基因的长期过度表达与DS典型症状密切相关,但导致基因表达和功能的改变及随后相关表型发生的复杂转录调控机制仍未阐述清楚,另外关键基因的作用机制因疾病模型的缺乏也未得到充分的验证。随着三维基因组学及干细胞技术的快速发展及在临床医学领域的应用,将为探究DS发病机制及治疗方式提供新的视角。
目的:
(1)本课题将利用染色质构象捕获技术DLO Hi-C(Digestion-ligation-only High-throughput chromosome conformation capture),绘制DS患者三维基因组图谱,并联合全基因组测序(Whole genome sequencing,WGS)及转录组测序(RNA-seq),整合多个单倍体组学解析DS致病机制,破译一维基因组变异与三维空间构象间关系,并进一步找寻DS的靶基因及阐释空间构象改变对基因转录调控和表达的影响。
(2)建立人胚胎干细胞系(Human embryonic stem cells,hESCs),并定向分化为神经祖细胞(Neural progenitor cells,NPCs),从细胞水平进一步验证靶基因在DS发生发展中的作用机制,为临床提供新的DS诊疗策略。
方法:
(1)从本院妇产中心收集引产的DS胎儿及正常胎儿样本,脑区取材并提取DNA,进行WGS,比较DS组与正常对照组之间基因拷贝数变异(Copy number variation,CNV)及单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)差异;采集DS胎儿父母外周血,进行WGS,比较DS胎儿与父母本之间的CNVs及SNPs差异及构建单倍体水平CNVs及SNPs。
(2)对DS组及正常对照组脑组织样本进行RNA-seq,比较转录组学差异及构建DS胎儿父母本单倍体水平基因表达。
(3)对DS组及正常对照组脑组织样本进行DLO Hi-C测序,解析染色体内部发生的交互事件;构建DS胎儿父母本单倍体Hi-C,联合单倍体CNVs、特异性SNPs、单倍体基因表达,进行整合分析。
(4)分析染色质空间构象改变对基因转录调控的影响,联合CNVs及SNPs预测三体基因的表达。
(5)分析DS组与正常对照组之间空间构象差异区域基因表达的变化,联合数据库DNA甲基化、组蛋白修饰数据,找寻靶基因并分析其转录调控的机制。
(6)利用本中心胚胎植入前遗传学检测技术收集DS胚胎及正常胚胎,采用激光辅助机械法获取囊胚内细胞团(Inner cell mass,ICM),建立整倍体及三体hESCs细胞系。
(7)对自主建立的hESCs细胞系进行鉴定,并诱导分化为NPCs,建立DS神经细胞模型,在细胞水平验证靶基因的作用机制。
结果:
(1)DS组CNVs主要发生于人类21号染色体(Human chromosome 21,HSA21)长臂,是正常对照组1.5倍,母本单倍体CNVs高于父本,母本SNPs及特异性SNPs数量均高于父本。
(2)DS组母本单倍体基因表达水平高于父本,另外观察到DS相关基因的可变剪切事件。
(3)DS组母本单倍体交互事件及交互强度高于父本,低单倍体Hi-C相似性显示出高单倍体基因表达差异。
(4)染色质空间构象动态区域更多的参与了基因调控表达,加入空间结构单元作为预测因子,提高了基因表达预测的准确性。
(5)发现DS组HSA21上RCAN1基因上游空间构象改变,该区域发生了拟制转录调节致基因表达水平未达到理论预期的1.5倍。
(6)成功建立1株整倍体hESCs细胞系(TH-SZ),目前已传至28代。
(7)自建TH-SZ细胞系增殖良好,核型稳定,高表达干细胞标记物,定向分化流程已开始。
结论:
(1)对单倍体组学整合分析发现母源性因素是导致DS发生的主要原因。
(2)一维基因组序列变异与染色质空间构象变异密切相关,染色质空间构象变化可引起基因转录调控的改变,单倍体内染色质交互事件促进基因表达,参与DS的发生。
(3)DS患者中RCAN1基因发生了转录调控改变,是DS发生的相关基因。
(4)建立了鄂西北地区首株hESCs细胞系,搭建了干细胞
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