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关键词： 人胚胎干细胞   神经干细胞   自我更新   分化   小分子化合物  

摘要： 人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)是一种可以在体外稳定自我更新,并具有分化为成人机体任何一种细胞潜能的多能干细胞(Pluripotent Stem Cells,PSCs)。通过hESCs定向分化可以得到通常情况下难以获得,但对疾病治疗具有重要价值的细胞。因此,多能干细胞在再生医学中具有重要的应用价值。对神经系统而言,许多神经退行性疾病通常涉及神经元的死亡和缺失,如中脑多巴胺神经元死亡与帕金森病(Parkinson's Disease,PD)密切相关,而阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease,AD)患者存在前脑基底胆碱能神经元(Basal Forebrain Cholinergic Neurons,BFCNs)的缺失。细胞移植有望改善神经退行性疾病的病理状态,对其产生重要的治疗作用,而通过人多能干细胞(Human Pluripotent Stem Cells,hPSCs)的定向分化获得特定类型的神经元将为神经退行性疾病的细胞治疗提供重要支持。目前利用化学生物学手段,即用活性小分子化合物调控干细胞命运已经成为干细胞研究中的热点领域。小分子化合物通过靶向特定分子在调控细胞信号转导,细胞能量代谢和表观遗传学机制等方面具有显著的优势:如其功能具有可逆性、其作用强度可以通过自身浓度进行调节等。课题组前期研究发现用小分子化合物同时抑制GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3)以及TGFβ(Transforming Growth Factorβ)和Notch信号通路,可高度特异的将人胚胎干细胞在一周时间内诱导分化为原始神经干细胞。但是,通过该方法获得的神经上皮通常具有后端化的表型,这可能与抑制GSK3导致Wnt信号通路的激活有关。本课题拟在前期研究的基础上,利用化学生物学手段诱导hESCs分化获得具有前脑表型的神经干细胞。本课题以人胚胎干细胞系H1和HUES9为研究对象,用无血清无饲养层的培养体系培养和传代。在光镜下hESCs边缘清晰,排列紧密,细胞核大而细胞质少;细胞免疫荧光染色OCT4(Octamer-binding Transcription Factor 4)阳性,表明hESCs处于未分化状态。通过联合使用TGFβ抑制剂SB431542和Notch抑制剂RO4929097高效率的将人胚胎干细胞诱导分化为PAX6(Paired Box Protein 6)和Nestin阳性的神经上皮。进一步,利用低浓度GSK3抑制剂CHIR99021和SB431542,可维持神经上皮的长期自我更新,该细胞表达前脑标志FOXG1(Forkhead Box Protein G1)、OTX2(Orthodenticle Homeobox 2),神经干细胞标志PAX6、早期神经细胞标志Nestin,和细胞增殖标志分子Ki67,表明该细胞是具有前脑表型的前脑神经干细胞(Forebrain Neural Stem Cells,fNSCs)。该细胞可以响应SHH(Sonic Hedgehog)诱导的腹侧化作用,得到MAP2(Microtubule-Associated Protein 2)、NKX2.1(NK2Homeobox 1)和GABA(Gamma-Aminobutyric Acid)阳性的腹侧前脑中间神经元。然而,值得注意的是,上述神经干细胞PAX6阳性,提示其在背腹轴上可能偏向背侧定位。随后研究中,我们尝试在神经诱导过程中加入腹侧诱导因子SHH是否可以获得具有腹侧表型的神经干细胞。通过使用腹侧诱导因子SHH及其激活剂SAG(Smoothened Agonist)、TGFβ抑制剂SB431542等诱导hESCs神经分化,得到腹侧标志NKX2.1和前脑标志FOXG1阳性的腹侧前脑神经干细胞(Ventral Forebrain Neural Stem Cells,vfNSCs)。该细胞可在GSK3抑制剂CHIR99021,TGFβ受体抑制剂SB431542和SHH存在的条件下自我更新,并表达前脑神经细胞标志FOXG1、OTX2,早期神经细胞标志Nestin和细胞增殖标志分子Ki67;此外,该细胞还表达腹侧标志NKX2.1,表明其具有腹侧前脑神经干细胞的表型。进一步通过联合使用Wnt抑制剂XAV-939、Notch抑制剂RO4929097和SHH,可将上述腹侧前脑神经干细胞快速诱导分化为神经元。分化后的神经元表达腹侧标志NKX2.1、ISL1(Insulin Gene Enhancer Protein 1),神经元特异骨架蛋白MAP2,大多数神经元为GABA能神经元,表达GAD65(Glutamic Acid Decarboxylase65),且GABA呈阳性;只有少部分细胞表达胆碱

关键词： 合成生物学   藏红花酸   玉米黄质   基因工程   酿酒酵母  

摘要： 为了实现微生物异源合成天然类胡萝卜素藏红花酸,以一株产β-胡萝卜素的酿酒酵母为底盘细胞,利用合成生物学技术构建人工酵母细胞。通过在染色体整合藏红花酸生物合成关键酶β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ),并以质粒的形式导入玉米黄质裂解双加氧酶(CCD)和醛脱氢酶(ALD)。由于酵母内源含有醛脱氢酶,所以首先对8种来源CrtZ和4种CCD进行组合表达并筛选,由欧文氏菌来源的CrtZ和藏红花来源的CCD形成组合的菌株获使得藏红花的最高产量约为231μg/L。之后继续对3种不同来源的ALD进行筛选,来自集胞藻来源的ALD效果最好,使得藏红花酸的产量提高了1.88倍(从231μg/L提高到434μg/L),最终筛选出了合成藏红花酸最优的基因来源。为了提升藏红花酸的产量,通过竞争路径的敲除及提高基因表达量进一步提高前体玉米黄质的产量。法尼基焦磷酸(FPP)作为合成萜烯类天然产物的重要前体,通过敲除Lpp1和Dpp1基因,削减法尼基焦磷酸向法呢醇的转化,为玉米黄质的合成提供更多的前体,使前体玉米黄质的产量提高了1.27倍。在此基础上,通过增加欧文氏菌来源CrtZ的基因拷贝数及调节其启动子的强弱来增强β-胡萝卜素羟化酶的表达强度,使得玉米黄质的摇瓶产量达到96.2 mg/L,通过多拷贝表达藏红花来源的CCD,藏红花酸的产量提高至1.17mg/L,这是目前公开报道异源合成藏红花酸中产量最高的。

关键词： 胚胎干细胞   细胞疗法   心力衰竭   心肌梗死   心脏细胞   心肌细胞   基因疗法   心衰患者  

摘要： 目前全世界有心力衰竭患者1.17亿,其中我国有2 997.1万,占全世界总数的25.6%。随着人口老龄化进程的加快和高血压、冠心病等心血管病发病率的上升,心力衰竭的发病率逐年增高,65岁以上可达6%-10%,心衰正在成为21世纪危害人类健康最主要的疾病之一。

关键词： Bioethics--MethodologyMedical ethics--MethodologyNormativity (Ethics)  

摘要： This dissertation is motivated by the hunch that current treatments of methodology in bioethics rest on inaccurate and one-sided pictures of the social practices of moral reasoning, in part because of their general avoidance of questions about the constitution of the we that reasons about moral issues. These approaches uncritically take the perspective of the doctor or administrator and unduly focus on one aspect of moral reasoning—its purported goal of producing definitive judgments. These limitations rarely produce considerations that are useful and usable by most people who face moral dilemmas concerning health care decisions, especially people who do not find medical institutions to be empowering places. In this dissertation I contribute to the painting of a different picture—one that provides more usable resources for dealing with the problems that confront people in a morally messy world. I by no means claim artistic originality here. This alternative picture has been painted in several different shades and variations by many others. Though each variation places a different gloss on the relationship between ethical theory and practice, all share a commitment to modeling ethics on the variety of actual social practices in which moral reasoning occurs. I focus on a naturalized and feminist variation on this theme. More specifically, this variation combines politically critical and socially reflexive analysis with a commitment to starting moral reflection from the actual moral experiences of human beings—most often from the experiences of people excluded from mainstream moral discourse on account of their social position (e.g., gender, race, class, or disability status). In this dissertation, I aim at the modest task of clarifying the details of the portion of this picture relevant to moral reasoning in bioethics. I begin with a critical examination of dominant methodologies in bioethics and outline their problems in terms of their inability to accommodate the si

关键词： 食品工程   基因工程   现代生物技术  

摘要： 随着科学技术的飞速发展,食品工业逐渐进入到人们的眼帘.在面临机遇的同时也在经受着前所未有的挑战,现在食品工程的发展与生物技术的结合越来越密切.与传统的生物技术不同,现代生物技术在食品工程方面发挥着不可替代的作用,不仅提高了食品的质量安全,而且生产的效率也进一步加强.针对于这种现状,这篇文章立足于食品工程的视角,探索生物技术在其中的应用,希望能够通过生物技术的应用开发更多的新产品,促进生物工程迈上一个新的台阶.

关键词： 胚胎干细胞   应用   问题   前景  

摘要： 胚胎干细胞是一类具有高度全能性的细胞，其细胞表面存在胚胎抗原和 Oct4蛋白[1]，是从哺乳动物着床前胚胎内细胞团体外分离培养而建立的克隆细胞系。在体外培养的条件下,胚胎干细胞可以在未分化状态下经无限增殖、诱导进而分化为机体的任何组织细胞。对人的胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hES)研究始于1998年,现已成为继人类基因组计划后生命科学中相对活跃的研究领域。但因存在伦理性的争议因而研究的不深。人们有望利用hES细胞修复或替代因各种因素所造成的人体组织器官缺损或功能障碍，在人类疾病治疗模式上做出新的突破。

关键词： 转基因作物   基因污染   隔离法律制度  

摘要： 转基因作物商业化种植有可能引发基因漂移,从而造成基因污染。基因污染一旦发生它将会给生物多样性带来毁灭性的破坏,其后果不堪没想。隔离制度的主要就是通过防止转基因产品与其他普通产品之间发生基因漂移,来达到防治基因污染发生的目的。完善的转基因作物基因污染隔离法律制度,对于有效地防治基因污染具有十分重要的作用。

关键词： 井冈霉素   基因组   色素   阿卡波糖   异源高产  

摘要： 井冈霉素是我国自主研发并实现大规模产业化生产的第一个农用抗生素,主要由吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus ***)产生。它对防治水稻纹枯病具有特效,在亚洲的水稻产区需求量巨大。同时,井冈霉素及其衍生物可作为治疗II型糖尿病的药物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前体,具有很高的经济附加值。鉴于其市场需求的不断攀升,利用代谢调控和基因工程手段来优化井冈霉素高产菌株的发酵性能,获得产量进一步提高的菌株,是本论文的研究重点。前期研究发现井冈霉素野生型菌株5008中存在三套同源的afsA-arpA代谢调控基因,组合缺失A因子受体基因shbR1和shbR3能明显上调valABC的转录水平,井冈霉素的终产量提高约40%。因此,我们首先通过缺失高产菌株TL01中shbR1和shbR3基因,促使井冈霉素的发酵产量分别提升14%和11%,在组合缺失菌株中井冈霉素的终产量由22.5 g/L提高到28 g/L。商品化的井冈霉素粗品通常包含约70%的A组分,15%的B组分,以及其他类似物。与有效成分A组分相比,B组分具有明显低效的抗病原真菌活性。前期研究推测ValE与ValJ蛋白可能催化A组分转化成B组分。在缺失valE基因后,突变株只产生少量的B组分;在缺失valJ基因后,突变株中B组分的含量与出发菌株相比减少了35%。并且不论是缺失valE基因,还是缺失valJ基因,对井冈霉素A的产量没有影响。由此,通过基因工程改造,我们成功实现了井冈霉素A组分的特异性积累。井冈霉素工业发酵中会产生大量的色素,48小时发酵液呈现深褐色,加大了下游分离纯化的难度,并影响了产品的色泽、产率和质量。为了消除发酵液中的色素,我们通过全基因组分析,在基因组中寻找到了四组可能参与色素合成的基因,分别参与以酪氨酸为前体的黑色素、III型聚酮合酶(以下简称为PKS)编码的黑色素、II型PKS编码的孢子色素、来源于尿黑酸的褐黄素的合成。通过对上述基因簇进行逐一中断,和出发菌株TL01相比,多巴类黑色素基因突变株PY06中井冈霉素的发酵产量提高了12%;III型PKS编码的黑色素基因簇突变株PY07产量无明显变化;II型PKS编码的孢子色素基因簇缺失和褐黄素基因缺失,分别导致井冈霉素产量下降11.7%和17.2%。所有突变株中井冈霉素基因簇转录水平和发酵液颜色均没有明显变化。基于上述改造过的高产菌株,我们进一步中断井冈霉素生物合成基因簇,成功构建了用于高效表达氨基环醇类化合物的异源宿主。一方面,我们将包含阿卡波糖天然合成基因簇的整合型质粒引入到阿卡波糖基因簇被中断的原始菌株Actinoplanes *** 50/110(?acb)中,可以检测到阿卡波糖合成能力的恢复。但该基因簇在Streptomyces coelicolor M145和Streptomyces lividans 1326中的转录量极低,检测不到阿卡波糖的产生。这暗示可能存在未知的副调控基因抑制阿卡波糖天然合成基因簇的转录,或者缺乏激活该基因簇表达的正调控基因。另一方面,我们选用井冈霉素基因簇的温敏性启动子PvalA,并将阿卡波糖生物合成的17个可能必需基因进行串联组装,并将其引入上述的宿主中,检测各基因的转录水平。综上所述,本论文通过全基因组分析,对井冈霉素高产菌株TL01进行了系统地改造,得到了井冈霉素产量提高、有效成分A组分特异性积累的衍生菌株。同时尝试了天然的和人工重组装的阿卡波糖天然基因簇的异源表达,为异源高产阿卡波糖奠定了基础。

关键词： 基因工程   实验教学改革  

摘要： 近年来,随着基因工程相关技术的发展和成熟,在微生物、细胞、酶等多领域有着广泛的应用.因此,基因工程逐渐和微生物、细胞工程、发酵工程等共同组成生物工程的新系统.本文介绍了我校基因工程实验课程的教学内容,并对该课程的教学改革进行了探索和总结.

摘要： Heart disease includes an array of cardiovascular diseases causing 25% of all deaths annually in the United States. Patients who live with heart disease experience significantly decreased quality of life. While current treatments on the market aim at improving heart function and cardiovascular efficiency, none are able to restore functionality to native levels. Tissue engineered approaches are becoming increasingly viewed as the definitive treatment to increasing longevity and quality of life of patients affected by heart disease. While stem cell therapies have immense potential, clinical application is still largely unsuccessful in generating healthy myocardium in patients. This study aims to differentiate and characterize human embryonic, induced pluripotent, and adipose derived stem cells into cardiomyocytes to engineer an electrically conductive construct for heart disease patients. Action potentials of embryonic, and induced pluripotent derived cardiomyocytes were measured using Nanion’s automated patch clamp system in order to attain baseline measurements. Current and voltage clamp configurations were used under physiological conditions and electrical signals were sampled every 15 seconds. In addition, two and three dimensional co-culture studies were performed using adipose-derived and embryonic-derived cardiomyocytes. The cells were seeded within an agarose gel and on 6-well plates at a 2:1 ratio. Samples were then measured using the automated patch clamp system after seven days of culture and stained for connexin-43 and desmin using immunofluorescence. Lastly, multielectrode array measurements readings were performed using embryonic derived cardiomyocytes to verify the patch clamp data. Results showed differentiated induced pluripotent stem cells produced action potentials almost identical to ventricular cardiomyocytes. No action potential readings were able to be recorded for the 3D cultures, however physiologically relevant action potentials were measured