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关键词： 石油污染土壤   生物修复   基因工程菌  

摘要： 随着石油开采量和使用量的不断增加,其在开采、运输、储存过程中的不规范操作或事故,导致大量石油进入环境中,造成了严重的环境污染问题。石油是一种成份十分复杂的天然有机化合物的混合物,通常由烷烃、芳香烃、胶质和沥青质组成。根据油源的不同,烷烃组分可占石油的50%～95%,且我国原油含蜡量高,其中石蜡主要成份为长链烷烃,导致了烷烃组分中的长链烷烃含量较高。长链烷烃因其含量高,难降解的特点,提高其处理效率就尤为重要。微生物修复是迄今为止修复石油污染较为有效安全的一种方法,但微生物往往受限于其降解能力,导致了处理效果不理想,通过分子生物学手段构建可降解石油污染物的基因工程菌用于污染修复是一种较为有效的方法,工程菌株因其具有降解能力强、降解底物范围广的特点,成为修复石油污染的理想菌株。 本研究对Acinetobacter vivianii KJ-1中长链烷烃降解基因almA进行原核表达并分析其降解功能。将该基因通过三亲接合转化法转入至野生型石油降解菌Acinetobacter calcoaceticus 21#中,分析其生长特性、降解能力、产酶活性的变化。考虑到基因工程菌直接投加到环境中可能存在着安全性问题,实验制备了石油降解酶制剂用于石油污染土壤修复中。最终对野生型菌株*** 21#进行了全基因组分析及工程菌株*** 21#-A3重测序分析,在分子水平上验证了其石油烃降解能力。主要研究结果如下: （1）对本实验室保藏菌株*** KJ-1中长链烷烃降解基因almA进行原核表达,测定了AlmA蛋白对2-癸酮和2-十二酮的酶活性,分别达到0.39（U/mg）和0.37（U/mg）。并测定了AlmA蛋白的代谢产物,其可催化脂肪酮转化为相应的酯,而在相同条件下不进行长链正构烷烃的羟基化。实验结果证明菌株KJ-1中AlmA蛋白具有Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）活性,参与了烷烃降解途径中的次末端氧化途径。 （2）通过三亲接合转化法将*** KJ-1中almA基因转入至野生型石油降解菌Acinetobacter calcoaceticus 21#中,并通过PCR扩增及测序验证了almA基因被整合至*** 21#基因组中,成功构建出一株基因工程菌。对其生长特性、降解能力及产酶活性进行检测发现:外源基因的导入并未显著影响野生型菌株*** 21#的生长能力,受体菌与工程菌生长趋势大致相同,而在以正二十八烷为唯一碳源的无机盐培养基中,工程菌株*** 21#-A3表现出比野生型菌更强的增殖能力。在正二十八烷降解实验中,与野生型菌株21#相比,工程菌株21#-A3在7 d和14 d时对C28的降解率分别提高了6.72%和6.89%。在测定粗酶液酶活时发现,重组工程菌21#-A3制备的粗酶液对2-癸酮、2-十二酮的酶活性分别提高了18.81%和18.56%。 （3）通过对菌株21#和21#-A3制备的酶制剂分别进行土壤修复实验可知,在第1 d和第4 d时两种酶制剂对石油的降解率并无显著差异,第7 d时,二者对1%和5%石油浓度土壤的石油降解率分别达到了20.32%、23.1%和31.64%、35.92%,两种酶制剂对5%石油污染土壤的石油降解率高于1%石油污染土壤,且21#-A3制备的酶制剂石油降解率显著高于21#制备的酶制剂（P<0.05）。 （4）完成了对*** 21#的全基因组分析。菌株*** 21#仅有一个环状的染色体,拼装后序列全长4089750 bp,不含有质粒,GC含量38.67%,预测共有3829条编码基因。通过对编码基因进行KEGG、COG、GO进行功能注释后发现:21#基因组中具有多条与石油烃降解相关基因,包括2个中链烷烃降解基因alk B1＿1、alk B1＿2,长链烷烃降解基因almA、Lad A基因及芳香烃降解基因cat A、cat B、cat C、ben D,并对其相应代谢通路进行了分析。通过对*** 21#中AlmA蛋白进行系统进化发育树及蛋白多重序列比对分析,预测了该蛋白同样具有BVMO活性。同时发现21#基因组中具有氯霉素、头孢菌素等小类抗生素及磺胺类、四环素抗生素等大类抗生素抗性基因。 （5）完成了对*** 21#-A3的重测序分析。编码区上共有11个核苷酸序列发生变化,1个短片段缺失,通过对蛋白功能分析后,预测该变化不会显著影响菌株21#-A3的生长发育能力。并在重测序过程中发现了一段新增氨基酸序列,此序列与*** KJ-1中AlmA序列相似性达到了97.5

关键词： 产琥珀酸放线杆菌   丁二酸   CRISPRi   碱基编辑器   谷氨酸脱羧酶系统  

摘要： 丁二酸是一种重要的C4平台化合物,在食品、医药、表面活性剂、绿色溶剂、生物可降解塑料等领域具有广泛的应用前景。产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）以丁二酸为主要代谢产物,被认为是最有应用前景的丁二酸生产菌之一。然而,由于在发酵产酸的过程中,需添加pH中和剂MgCO,增加了工程操作的难度和染菌的机会;同时,遗传操作工具的匮乏使得获得性能优良菌株困难,从而阻碍了***的工业化应用。针对上述问题,本文通过基因组测序和耐酸机制分析,研究外源引入耐酸系统对改善菌株发酵产酸的作用。研究建立基于CRISPR/Cas的系列基因编辑方法,以及构建***工程菌株,以期实现对***的改造,提高菌株发酵产丁二酸性能。主要研究内容如下:（1）通过对*** ZK进行基因组测序和分析,发现***存在与耐酸机制相关的FF-ATP酶、修复蛋白Rce F、Rad C、Rce O、DNA错配修复蛋白Mut S、Dna K和对大分子修复或保护的AP内切酶,确定缺少细菌中较常见的谷氨酸脱羧酶（Gad）耐酸系统。通过在***菌株中引入Gad系统,构建重组菌gadB-SW和gadBC-SW,发现细胞在pH4.6环境下的存活率提高,但在中性pH下生长受影响;在减少MgCO添加量的摇瓶发酵条件下,gadBC-SW产量比野生菌提高了8.4%;3-L发酵罐分批发酵34 h,用NaCO控制pH 6.5和pH 6.0时,gadBC-SW的丁二酸浓度分别可达47 g/L和31 g/L。（2）以编码乙酸激酶的基因（ackA）为靶基因,研究产琥珀酸放线杆菌的基因敲除方法。就*** CRISPR/Cas基因敲除系统:Western Blotting结果显示来自土拉弗朗西丝菌的Cpf1和经过密码子优化的来自化脓性链球菌Cas9可以成功在***中表达;以e GFP为报告蛋白,鉴定了7个不同表达强度的启动子:pck A>J23119>kasop>gadph>Km>erm E;构建了不同的CRISPR/Cas9基因敲除质粒和CRISPR/Cpf1基因敲除质粒,推测优化Cas蛋白和g RNA的表达量、筛选可辅助的重组酶可能是今后构建CRISPR/Cas基因敲除系统的关键。建立了同源重组基因敲除系统:以质粒p CVD442作为基因敲除载体,利用接合作用、两次同源重组、抗性筛选及蔗糖反筛,获得基因敲除菌株ΔackA。（3）研究构建***基因干扰系统（CRISPRi）。以pLGZ922为骨架载体,通过定点突变Cas9获得dCas9,构建基于CRISPR/Cas9的CRISPRi,但对靶基因ackA的抑制作用不明显。通过定点突变Cpf1获得dCpf1,构建基于CRISPR/Cpf1的CRISPRi,对靶基因ackA有抑制作用,其中dCpf1（E1006A）CRISPRi对ackA抑制效果可达75%以上。与ackA基因敲除菌相比,下调ackA表达菌株的生长OD得到改善,在葡萄糖或木糖培养基中,发酵液副产物乙酸浓度显著下降。下调ackA表达菌株在3-L发酵罐分批补料发酵60 h,产丁二酸57.06 g/L,乙酸2.44 g/L,糖酸转化率0.79 g/g。（4）研究构建基于CRISPR/Cas的碱基编辑器。分别设计构建了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）,发现只有基于CRISPR/Cas9构建的ABE和CBE,可以在***中实现A到G和C到T的转换。通过延长linker和引入2拷贝UGI优化CBE,得到nCas9（D10A）max,编辑效率提高到50%,编辑窗口在PAM上游C-2-12。将大肠杆菌腺苷脱氨酶突变体（Tad A-8e）与Cas9的氨基端融合,构建得到nCas9（D10A）-ABE,编辑窗口在PAM上游A4-8,编辑效率达到100%。此外,对Tad A-8e进行N46L突变,构建鸟嘌呤碱基编辑器（Td-GABE）,在PAM上游G4位点实现了G到T的转换,编辑效率为11%;构建Td-CBE和Td-CBEmax,在PAM上游C5位点,编辑效率100%,实现了C到T的精准转换。同时,考察了碱基编辑器在多位点的碱基编辑情况,发现nCas9（D10A）-ABE可同时编辑至少6个位点,编辑效率可达100%;CBE中的Td-CBE和Td-CBEmax可同时编辑2个位点,且第一个位点的编辑效率为100%,第二个位点的编辑效率为10%。（5）基因工程改造***发酵产丁二酸。根据

关键词： 心肌纤维化   肥厚型心肌病   金属有机框架   微小RNA CTGF   仿生纳米酶  

摘要： 研究背景: 心肌纤维化与肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM）患者的恶性心律失常、心衰、猝死等密切相关,因此早期干预以延缓心肌纤维化进程对预防HCM患者出现恶性不良事件至关重要。但HCM心肌纤维化的发生机制受多重因素的相互影响,导致临床缺乏有效的抗纤维化策略。目前认为炎症,氧化应激,转化生长因子β1（Transforming growth factor-β,TGF-β1）通路等参与心肌纤维化的进展,其中活性氧（ReactiveOxygen Species,ROS）在心肌纤维化的形成过程中发挥着重要作用,过量的ROS可加速心肌纤维化的形成,因此有效清除ROS对于治疗心肌纤维化至关重要。二氧化铈（CeO2）纳米粒因其具有类超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）双重特性,因此具有明显的清除ROS的能力。但是复杂的心肌纤维化病理生理过程提示我们,仅依靠清除ROS不足以逆转心肌纤维化,因此多靶点、多维度的抗纤维化治疗方式可能更有潜力助力心肌纤维化的治疗。 基因治疗可为HCM心肌纤维化的治疗提供新思路,最新研究表明:siRNA CTGF（siCTGF）具有抑制胶原生成,改善心肌纤维化的作用。若能够将化学药物CeO2与核酸药物siCTGF相结合可能发挥协同治疗的作用,起到“1+1>2”的疗效。但由于裸露的siRNA存在易降解,免疫原性高且不容易穿过细胞膜等缺点,同时单独的CeO2纳米粒也存在半衰期短,易发生聚集等问题。因此,如何将siCTGF与CeO2共同递送到心肌纤维化部位,是二者发挥协同作用治疗心肌纤维化的关键。 金属有机框架（Metal-organic framework,MOF）是由有机桥联体和无机结构基元组成的多孔材料,这种材料具有孔径大、生物降解能力好等优点目前已成为核酸药物的一种“明星载体”。其中金属有机框架zif-90材料,是以锌离子和2-甲醛咪唑为原料构造而成的多孔材料,制备过程简单、孔径大,生物相容性好,同时zif-90具有ATP响应作用。由于细胞内的ATP含量明显高于细胞外,故ATP响应可促使药物在细胞内释放,提高治疗效果,因此,zif-90是一种理想的siRNA和CeO2的递送载体。但普通MOF材料存在受单核巨噬细胞系统的阻碍,易被巨噬细胞吞噬,缺乏靶向性等问题。而细胞膜包裹的仿生纳米系统因其低免疫原性、长半衰期、低毒性和先天靶向性等特点,弥补了普通纳米载体的不足。但普通的仿生纳米材料缺乏对心肌纤维化部位的靶向性,而成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein,FAP）在HCM心肌纤维化部位高表达,是天然优良的心脏纤维化病变的靶标分子。文献研究证实细胞经基因编辑后表达抗FAP嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,Car）可实现靶向高表达FAP的心脏纤维化部位作用。故采用anti FAP-car修饰的细胞膜包裹具有促使纳米粒实现心肌纤维化部位靶向聚集的潜力。 第一部分:FM@zif-90/Ce/siR NPs的合成、表征及性能检测 目的:合成具有多功能的基因工程化仿生纳米酶递送系统（FM@zif-90/Ce/siR NPs）,并对其进行表征和性能检测。 方法:利用一锅法将CeO2和siCTGF包裹于zif-90材料中得到zif-90/Ce/siR NPs,通过脂质体挤出法将anti FAP-car修饰的细胞膜封装在zif-90/Ce/siR NPs表面组装成基因工程化仿生纳米酶FM@zif-90/Ce/siR NPs,并对其基本表征,体外释药,酶活性等进行检测。 结果:当siCTGF与zif-90/Ce NPs的质量比为1:100时,zif-90/Ce NPs与siCTGF完全连接。电镜结果显示合成的FM@zif-90/Ce/siR NPs大小、形态均一,在zif-90/Ce/siR NPs的正十二面体核心表面被覆盖着约10 nm厚的细胞膜结构。FM@zif-90/Ce/siR NPs直径约为99.3±3 nm,ζ电势为-17.76±3.03 mV,稳定性良好。X射线衍射技术（XRD）结果显示所制备的FM@zif-90/Ce/siR NPs与zif-90单晶结构一致,证明药物负载对zif-90晶体结构并无影响,X射线光电子能谱技术（XPS）结果证实FM@zif-90/Ce/siR NPs同时存在Ce3+和Ce4+两种价位,具有能够发挥SOD和CAT双重模拟酶活性的潜力。电镜结果表明ATP存在时纳米材料出现明显的崩解,体外释药实验结果显示FM@zif-90/Ce/siR NPs具有良好的ATP响应的药物释放特性。酶学活性检测结果提示该体系具有SOD和CA

关键词： 盐单胞菌   聚羟基脂肪酸酯   基因工程   发酵工程   菌株选育  

摘要： 微生物底盘是发酵工业的核心,菌株的选育及开发至关重要。目前,传统工业菌株具有一定的局限性,如发酵成本高、易染菌、目标产物产量受限、抗胁迫能力差等,因此,亟需探究新一代与生物制造及发酵生产相适配的新型底盘。可开放非灭菌发酵的底盘菌盐单胞菌（Halomonas sp.）,因其可在高盐、高碱等胁迫环境下快速生长的特性并且可天然积累生物可降解材料聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）而受到广泛关注。本研究聚焦于新疆盐水湖盐单胞菌的筛选,并对所选菌株的遗传背景、生长培养、表达元件与基因编辑、PHA聚合机制与产物发酵等方面进行表征与探索,旨在进一步解决目前盐单胞菌在PHA生物合成中的局限性。 首先,对来自新疆的耐盐碱微生物群进行初步的发酵生长测试,建立快筛流程,获得一株具有较高发酵干重和聚-3-羟基丁酸酯（Poly-3-hydroxybutyrate,PHB）产量且具有天然PHA大颗粒的新型盐单胞菌LY01。随后,对该菌株的遗传背景进行分析并优化其发酵条件,确定LY01最适培养基。此外,LY01不仅不依赖微量元素,而且还具备较强抗逆性,可在最高90 g L-1Na Cl与p H为10的环境中保持最佳生长且不受影响。 其次,本研究建立了一套内源启动子的筛选及优化方法,挖掘了具备高表达量的内源启动子P2440,并通过随机突变建立了具有宽范围、高强度的P2440突变文库。通过对LY01遗传背景的分析,本研究建立了一套适用于盐单胞菌中高表达中心位点的筛选流程,筛选出稳定的整合位点,并实现绿色荧光蛋白表达模块的插入。随后,通过CRISPR/Cas9工具实现了基因pha P1的敲除,对pha P1与产物聚合机制做了一定的探究,证实了Pha P1蛋白具有调控PHA颗粒大小的作用,进而猜想Pha P1在LY01中可能因蛋白质水平过低而使得多颗粒调控作用无法实现,导致单一大颗粒PHA性状的出现。 最后,通过异源表达3-羟基丙酸（3HP）合成通路,在LY01中实现了聚-3羟基丁酸-3-羟基丙酸(P（3HB-co-3HP）)的生物合成,其中3HP摩尔占比达到27.97%。过表达依克多因（Ectoine）合成通路,摇瓶发酵获得1.82 g L-1的依克多因产量。对LY01进行适应性进化,获得了驯育后的菌株LY45,其PHB产量提升11%,转化率提升13.4%。 综上,本论文结合组学分析、代谢工程、合成生物学等策略,对新型盐单胞菌LY01进行了完善的选育及底盘改造,建立了系统方法论,对进一步推动新型特色底盘在绿色生物制造发展具有重大意义。

关键词： 生物保守主义   人类增强   人性   基因工程  

摘要： 生物保守主义出于保护人性的目的在原则上反对人类增强。这种主张可以从三个方面来理解：一是我们应当保护人性中固有的内在价值，也就是人性所具有的神圣性；二是人性为人类尊严、人权、道德地位等其他重要的价值提供了基础；三是人类增强对人性产生影响，最终会危及人类社会的政治体制。然而，生物保守主义并未对人性给出清晰的解释，将人性等同于由遗传产生的一系列特质的做法也存在问题。在此基础上形成的对人类增强的反对意见难以成立。对于人类增强的讨论应当从人性的概念框架转向特定增强技术在具体情境中产生的伦理问题。

关键词： 关中奶山羊   胚胎干细胞   4i/LA体系   多能性   转录组测序  

摘要： 关中奶山羊是我国关中平原地区的特色山羊品种,上世纪80年代以西农萨能奶山羊为父本,本地优质奶山羊为母本选育而成,具有产奶量稳定、乳品质好等特点。但相比于其他家畜,奶山羊研究起步晚,育种基础薄弱,导致奶山羊的遗传育种进展十分缓慢。传统育种存在周期长、性状选择不显著以及遗传资源利用不够充分等问题。因此,利用生物技术对奶山羊进行遗传改良是奶山羊育种的趋势。干细胞育种是指通过在体外建立稳定的家畜干细胞系,与核移植、体外受精、基因编辑等技术相结合,快速获得优良个体,从而实现家畜遗传改良的一种育种手段。同传统育种相比,干细胞育种可以大大缩短世代间隔,快速生产具有优良性状的家畜,为家畜育种提供了新的思路。然而,截至目前,能够在体外稳定生长的山羊胚胎干细胞尚未见报道。 本研究以关中奶山羊第5天囊胚为试验材料,分离获得了能够在体外稳定生长的关中奶山羊胚胎干细胞,并通过观察细胞形态、碱性磷酸酶染色、检测多能性标记基因在mRNA及蛋白水平上的表达和拟胚体试验等验证分离获得的胚胎干细胞的多能性,获得的主要结果如下: (1)利用已公开的两种培养体系pEPSCM、bEPSCM和本实验室前期提出的TePR体系(未公开)以及本实验室前期在绵羊ESCs培养中优化得到的4i/LA培养体系,进行关中奶山羊胚胎干细胞的体外分离培养,成功利用4i/LA培养体系(以mTeSR PLUS为基础培养液,补充添加WNT信号通路抑制剂IWR-1、MEK信号通路抑制剂PD0325901、PKC信号通路抑制剂Go6983、SRC信号通路抑制剂CGP77675、LIF、Activin A和Vitamin C)从D5囊胚中分离获得了山羊胚胎干细胞(Goat embryonic stem cells,gESCs),gESCs呈边缘清晰的圆顶状克隆,核质比高,目前已在体外培养至20代。 (2)初步对分离获得的gESCs多能性进行鉴定,相关鉴定试验结果显示gESCs碱性磷酸酶染色呈阳性;实时荧光定量PCR结果显示,在mRNA水平,gESCs中OCT4、SOX2和NANOG等多能性标记基因的表达显著高于山羊成纤维细胞(Goat fetal fibroblasts,gFF)(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,gESCs在蛋白水平表达多能性标志基因OCT4、SOX2和NANOG,此外还表达干细胞表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA4;体外拟胚体试验结果表明,gESCs能够形成类似胚胎的球状结构,在分化培养液中培养28 d后,实时荧光定量PCR结果表明分化后的拟胚体表达三胚层标记基因,包括外胚层标记基因PAX2,中胚层标记基因PDGFRA和内胚层标记基因GATA6,表明分离获得的gESCs具备一定的体外发育潜能。 (3)gESCs及gFF转录组测序共鉴定出7364个差异基因,其中3945个基因上调,3419个基因下调。COG分类分析和GO富集分析结果显示,差异基因主要集中在蛋白质翻译、WNT信号通路调节和细胞增殖等生物学过程。KEGG分析进一步富集到多个与维持gESCs多能性及分化相关的差异基因,主要靶向WNT信号通路、PI3K信号通路和MAPK信号通路,从分子水平上初步对gESCs多能性调控网络进行解析。 综上所述,本研究利用4i/LA培养体系成功分离获得了可在体外稳定生长的gESCs,并对分离获得的gESCs多能性和体外发育潜能进行了初步鉴定,同时利用转录组测序对调节gESCs分化的分子机制进行了初步研究,为山羊胚胎干细胞研究提供了实践与理论参考。

关键词： 第三代DNA测序   纠错算法   深度学习   卷积神经网络   Transformer  

摘要： PacBio SMRT(PacBio)和Oxford Nanopore(ONT)代表着基因测序最前沿的第三代测序技术,能产生超长的读段,积极地推动了基因组装、转录本识别等基因组和转录组的研究。但它们的缺陷之处在于产生的读段错误率较高,因此需要对其先纠错再分析。目前,纠错算法主要采用将第三代数据进行多序列间相互比对,再用在某个位置上出现频率最高的碱基作为最终碱基来纠正错误,然而这些方法存在以下的问题。第一,它们的校正策略本质上都基于序列中的单一位置碱基出现频次,没有利用同源序列上碱基间的相关性;第二,这些算法需要依赖足够的测序深度,在低测序深度时效果不佳。第三,受限于校正时所使用的策略,部分方法需要切割和裁剪读段,导致纠错后的读段变得碎片化,从而失去了长读段原有的优势。 针对以上不足,本文引入深度学习对序列校正算法展开深入研究,分别为两种第三代DNA测序平台开发了数据纠错算法。具体研究工作如下: (1)针对PacBio生成的高错误率长读段,提出了一个基于卷积神经网络的纠错模型命名为PBDeep SC。我们提出了一种新的序列编码方法,将读段序列、测序质量、比对结果三种数据信息编码成二维三通道图像,多方面的提取了序列间相关特征。然后基于卷积神经网络构建了深度学习模型来学习编码后的数据,该模型采用了卷积分解和残差网络的设计思路,支持多任务学习。通过在大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥和人类四个物种的数据集上实验,并与现有四种基于不同实现逻辑的自校正算法进行比较,PBDeep SC在准确率上分别为99.16%、97.14%、94.01%和89.17%,均高于其他算法。且在输出深度、基因组覆盖率、输出长度方面也具备一定优势。 (2)针对ONT测序平台生成的长读段,提出了一个基于Encoder-only Transformer的纠错模型命名为Nano Deep SC。该方法把全基因组比对结果划分成等长的分区,并将每个分区内的测序读段、比对质量、测序质量等多种辅助特征编码成二维张量;然后构建了仅含有Encoder模块的Transformer模型,模型针对每个分区输出一条抛光后片段,最后将这些片段按顺序连接在一起形成抛光后长读段,作为纠错结果。通过在大肠杆菌和酿酒酵母的数据集上与五种算法进行比较实验,Nano Deep SC虽然在输出深度和基因组覆盖率方面不具备优势,但在准确率上为96.62%和96.02%,高于其他方法,且能输出更长的读段。 综上所述,本文将深度学习应用到处理第三代DNA测序数据的纠错问题中,通过采用多种方法提取序列间相关特征,提高了纠错算法在低测序深度数据上的性能,为深度学习方法在该领域的应用提供了新思路。

关键词： 长江鲟   圆口铜鱼   黑尾近红鲌   胚胎干细胞   鲤春病毒血症病毒  

摘要： 长江鲟(Acipenser dabryanus)、圆口铜鱼(Coreius guichenoti)和黑尾近红鲌(Ancherythroculter nigrocauda)是生活在长江上游的洄游性鱼类,由于过度捕捞、筑坝、航运和污染等人为活动导致其数量急剧减少,已濒临灭绝。本文通过构建细胞系以保存鱼类种质资源,并为研究鱼体遗传学与生物学提供基础工具。 本文以长江鲟为实验材料,建立了第一个鲟鱼类胚胎细胞系——ADEc。ADEc细胞培养条件为24℃,20%FBS的L-15培养基,冻存后复苏依旧有80%细胞能够恢复正常生长。染色体数目在147-258之间,其中,染色体数目众数为234条。CoI基因物种鉴定与长江鲟相似性大于99%,证实ADEc细胞来自于长江鲟。将pEGFP-N1和cy3-siRNA通过lipo8000脂质体转染试剂能够成功转入ADEc细胞。转录组测序显示,在脂多糖(LPS)刺激后的2小时,会引起1562个基因差异表达,这些基因显著富集于Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和NF-kappa B信号通路等免疫相关通路。碱性磷酸酶(AP)染色发现有少量ADEc细胞中具有多能性。进一步通过全反式维甲酸(RA)诱导后,可以观察到ADEc细胞向神经元类型细胞分化。转录组数据分析发现,ADEc细胞中含有胚胎干细胞标记基因wdr43和神经干细胞标记物如bmi1、nes和ocln的表达,进一步证实了 ADEc细胞为胚胎干细胞。ADEc细胞系的建立为替代长江鲟个体进行免疫学、种质资源保存等提供良好的工具,为胚胎干细胞的分化潜能研究提供参考。 首次建立圆口铜鱼的组织细胞系——鳍(CGF)和皮肤(CGSK)细胞系。CGF和CGSK的最佳培养条件是在28℃、20%FBS的L-15培养基。CGF和CGSK已分别传代至60代和30代。通过ndl、16s、12s、cytb和coI因的进行物种鉴定结果表明,其圆口铜鱼序列一致性均超过99%,表明细胞来源于圆口铜鱼。核型分析发现两种细胞的染色体数均为2n=50。液氮冷冻保存6个月后,细胞存活率仍保持在70%以上。转录组分析结果显示,CGF细胞特异性表达sfrp2、angpt1、mmp11和nab1等肌成纤维细胞标志基因,主要由肌成纤维细胞组成,而CGSK细胞特异性表达col5a1、col5a2、col22a1和ccn4等编码胶原以及成骨细胞标志基因,主要由真皮成纤维细胞组成。通过lipo8000成功将cy3-siRNA和pEGFP-N1质粒转染到CGF和CGSK细胞中。在免疫学方面,两种细胞受到鲤春病毒血症病毒(SVCV)刺激时,均表现出显著的细胞病变效应(CPE)。CGF和CGSK细胞系的建立和鉴定为研究圆口铜鱼的免疫学、资源保护提供了细胞基础。 首次建立了黑尾近红鲌细胞系——精巢细胞系(ANG)。ANG的培养条件为24℃,20%FBS的L-15培养基。目前ANG传代至10代。通过coI基因进行物种鉴定表明,细胞系确实来源于黑尾近红鲌。液氮冻存12个月后,细胞存活率保持在60%以上。通过lipo8000成功将cy3-siRNA和pEGFP-N1质粒转染到细胞中。ANG细胞系的建立,为保存黑尾近红鲌种质资源、生殖细胞移植提供潜在的实验材料。

关键词： 高中生物   原创试题   科技文献   表观遗传   基因工程   生物安全性  

摘要： 本文介绍了利用前沿科技文献命制两则生物试题的主要思路。利用科技文献可以提升试题的逻辑严谨性和证据真实性，又能有效开拓新的考察角度、进行试题内容的创新，还可以间接让学生对接科技发展趋势、学以致用。