关键词：
华支睾吸虫
原核表达
重组抗原
ELISA
摘要：
华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)是一种危害严重的淡水鱼源性人兽共患寄生虫病,人或哺乳动物由于生食或半生食淡水鱼虾而引起感染。长期感染能够诱发胆结石、胆管炎、胆囊炎、胆管癌和肝癌等疾病。在感染华支睾吸虫囊蚴4周后成虫发育成熟才开始产卵并随粪便排出,在这期间如果粪便检查没有发现虫卵则导致误诊,延误疾病的治疗,可能导致严重的后果。因此,诊断华支睾吸虫病,对于预防该病具有重要意义。本研究首先在华支睾吸虫病流行区应用粪便检查法(改良加藤厚涂片法)和已发表的PCR检测方法双重鉴定当地居民粪便样本以获得标准阳性血清。粪便检查1745人,其中513人粪便中具有虫卵;然后提取513人粪便样本中虫卵的DNA进行PCR鉴定,阳性为113人,共采取阳性血清112份。本研究通过双重鉴定,以减少获得假阳性血清,由此确定获得的112份血清为华支睾吸虫病标准阳性血清,用此血清检验间接ELISA诊断方法的敏感性。免疫学诊断方法在疾病诊断方面飞速发展,本研究拟应用免疫学原理建立华支睾吸虫病诊断方法。目前ELISA诊断方法已逐渐应用到华支睾吸虫病的诊断当中,应用这种方法能够尽早对疾病进行诊断,以免延误疾病的治疗,能够解决感染早期无法诊断和虫卵产生较少时期的盲区问题。间接ELISA诊断方法所使用的诊断抗原多为粗抗原或分泌排泄物(ES)抗原,这些抗原虽然敏感性尚可但存在的共同弊端是特异性差,除在健康人存在较高的假阳性外,同其他寄生虫如血吸虫、后睾吸虫、并殖吸虫等均存在较强的交叉反应。目前基因工程抗原成为诊断抗原研究的热点,其在保持高敏感的基础上,同时具有高特异性,能够解决交叉反应问题。因此,寻找高特异性、高敏感性的诊断抗原成为建立免疫学诊断方法的关键。为解决以上问题,本实验室前期对华支睾吸虫成虫的c DNA表达文库进行免疫学筛选,获得3个强反应原性抗原,经测序发现三个抗原均为高度串联重复序列,并且都有一个相同的末端,因此,本实验根据三个强反应原性抗原的串联重复序列和共同末端获得四对抗原基因,分别为Cs G1、Cs G2、Cs G6、Cs Gend,首先,对四种抗原基因进行基因合成,然后对四种抗原进行原核表达,成功制备了表达载体p ET-28a-Cs G1、p ET-28a-Cs G2、p ET-28a-Cs G6、p ET-28a-Cs Gend,获得四种基因重组抗原,纯度达到95%,western blot结果显示四种重组蛋白能够被阳性血清特异性识别。利用四种重组抗原分别建立华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法,分析四种抗原基因的抗原性。四种重组抗原p ET-28a-Cs G1、p ET-28a-Cs G2、p ET-28a-Cs G6、p ET-28a-Cs Gend敏感性分别为91.1%(102/112)、86.6%(97/112)、74.1%(83/112)、49.1%(55/112),四种重组抗原同时包被进行检测敏感性为83.9%(94/112);特异性均为100%;筛库获得的三种强反应原性基因共同末端Cs Gend抗原性最弱;Cs G1抗原性最强,为理想的诊断抗原,以此为抗原建立华支睾吸虫病间接ELISA诊断方法,能够解决感染早期无法诊断的问题,有利于华支睾吸虫病的预防和控制。
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