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ISBN: (纸本)9787513024259

关键词： 碱性蛋白酶   基因重组   发酵优化   微胶囊  

摘要： 本研究隶属于国家十二五技术攻关项目-《食源性功能肽生物制备技术研究》(2012BAD33B03)。以地衣芽孢杆菌2709为碱性蛋白酶基因来源,借助PCR技术、SDS-PAGE技术、Image J软件分析技术、8-395 Pro仪器微胶囊包埋技术等手段,采用单因素实验设计和响应面优化实验设计等研究方法,创新性地开展了重组菌*** Top 10-p GM-T-Apr的构建与鉴定,重组菌*** BL21-p ET-28b(+)-Apr的构建与鉴定,重组菌*** BL21-p ET-28b(+)-Apr的发酵优化,基于微胶囊技术固定碱性蛋白酶及酶特性研究等四个方面的研究内容,成功构建了一种单位菌密度高产碱性蛋白酶的重组菌*** BL21-p ET-28b(+)-Apr,确定了该重组菌以酶活性、葡萄糖利用率及菌密度为指标的发酵条件,并初步揭示了微胶囊化的粗酶有效延长了酶活半衰期,适宜条件更为温和,为后期开展碱性蛋白酶工业化生产相关研究奠定技术基础。本研究所获成果如下:(1)根据NCBI数据库设计可行引物,引入Nco I和Xho I酶切位点,经过优化PCR条件,确定最佳退火温度,扩增碱性蛋白酶目的基因Apr,其中包括开放阅读框和完整的上下游调控区。回收目的片段,连接p GM-T载体,成功构建重组菌*** Top 10-p GM-T-Apr,进行*** I和*** I酶切鉴定,扩增序列大小与预期一致。(2)将鉴定正确的Apr基因序列经*** I和*** I酶切纯化回收后,插入至表达载体p ET-28b(+)中,成功构建重组原核表达载体p ET-28b(+)-Apr。p ET-28b(+)-Apr转化至*** Top 10中,进行质粒提取并送生物公司进行测序,软件分析得出同源性高达98%。重组原核表达载体p ET-28b(+)-Apr转化至*** BL21中,经SDS-PAGE分析表明,目的基因Apr在*** BL21中表达蛋白分子量约为36 k Da。(3)以葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、盐溶液体积、培养时间和震荡速率为变量进行重组菌发酵单因素实验,综合三项指标确定显著因素和最优水平。基于单因素实验确定蛋白胨浓度、培养时间和震荡速率为变量进行响应面实验,获得重组菌发酵统计模型,综合三项指标确定最佳工艺参数为:蛋白胨浓度8.1 g/L,培养时间24 h 15 min,振荡速率180 r/min。在单位菌密度的条件下,重组菌的蛋白酶活性显著高于原始菌株;同时,葡萄糖的利用量与原始菌株并无显著差异,重组菌在工业应用中意义更大。(4)以海藻酸钠浓度,Ca Cl2浓度,固定时间,碱性蛋白酶浓度为变量,以微胶囊包埋率为指标进行粗酶微胶囊化单因素实验,确定响应面因素水平中心点。基于单因素实验确定海藻酸钠浓度,Ca Cl2浓度,固定时间,碱性蛋白酶浓度为变量进行响应面实验,获得粗酶微胶囊统计模型,确定最佳工艺参数为:在海藻酸钠浓度1.47%,无水氯化钙浓度2.93%,固定时间62 min和碱性蛋白酶浓度0.78%,在此条件下,微胶囊的包封率达到95.51%。通过对比分析游离碱性蛋白酶与微胶囊水解效果,发现游离酶与微胶囊在水解最适条件方面略有差异,在水溶液p H与温度变化中,微胶囊表现更为温和,通过微胶囊固定化大大延长了碱性蛋白酶的保存时限,在工业生产中有广泛应用前景。

关键词： Wnt3a   无饲养层培养   多能性维持  

摘要： Wnt信号通路在调控胚胎分化与干细胞多能性维持等生物学过程中发挥重要作用。该信号通路通过胞外蛋白与细胞表面受体的结合起始一系列复杂的胞内信号,从而调控相关基因的表达。Wnt信号通路控制着许多与多能性维持相关基因的表达,对于干细胞多能性的维持与体细胞诱导重编程具有有一定的促进作用。然而,Wnt信号通路在维持和诱导干细胞多能性时对于表观遗传修饰基因的调控作用目前还不清楚。本研究旨在以小鼠胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)为研究对象,利用L-Wnt3a细胞向胞外分泌Wnt3a蛋白这一功能,通过制备其饲养层或条件培养液,进行ESCs培养或iPSCs诱导,系统探讨Wnt3a信号通路对于胚胎干细胞多能性维持,诱导干细胞多能性的获得,以及相关表观遗传修饰基因的表达调控作用。结果显示,使用L-Wnt3a细胞饲养层培养ESCs可以很好的维持ESCs的形态,该ESCs表达碱性磷酸酶等多能性相关基因,能够在体外分化形成类胚体和畸胎瘤。进一步检测表观遗传修饰和Wnt3a信号通路相关基因的表达显示,组蛋白H3K36me2的甲基转移酶kdm2b的转录水平显著提高,H3K9me甲基转移酶suv39h1的转录水平显著下降。此外,DNA羟甲基化酶tetl的表达水平显著下调,chd1与parp1的转录无显著变化。Wnt3a信号通路调控基因cd31与Wnt通路抑制基因dkkl的表达显著上调,stat3的表达显著下降,而bircS转录水平无明显变化。当在无饲养层条件培养ESCs时,L-Wnt3a细胞条件培养液可显著维持ESCs的克隆形态,而传统干细胞培养液中培养的ESCs克隆发生明显分化。L-Wnt3a细胞条件培养液培养的ESCs的多能性基因sox2、oct4、nanog以及表观修饰基因parpl、kdm2b的转录水平都显著高于对照组ESCs培养液培养的ESCs。而这两组细胞的Wnt信号通路基因的表达则没有出现显著改变,相比分化较严重的MEF培养液培养的ESCs,两组细胞cd31和birc5的转录水平相对较高。此外,L-Wnt3a细胞条件培养液培养的ESCs能够较好的维持干细胞的多能性,体外分化形成的类胚体表达更高水平的三胚层标记基因,并体内分化形成畸胎瘤。本研究显示,Wnt3a信号通路会显著促进ESCs多能性的维持并上调与ESCs多能性维持相关的表观遗传修饰基因的表达。进而,该信号通路显著促进小鼠iPSCs的诱导,并显著上调与多能性调控相关的表观遗传修饰基因的表达。本实验证实,Wnt3a信号通路不但对多能性基因转录有显著的调控作用,而且也影响与多能性相关的表观遗传调控基因的表达。该研究的结论为进一步阐明Wnt3a信号通路在调控多能性,特别是诱导过程中多能性的获得奠定理论基础。

关键词： 基因工程   微课   教学点   教学设计  

摘要： 基因工程是生物工程专业的必修课程，与分子生物学联系紧密，其在生产实践中的理论与实践并重。微课教学以授课形式丰富、时间短、跨越领域广的特点，在现代社会尤其是网络社会受到普遍欢迎。微课教学形式运用于基因工程课程的教学是全新尝试，是大势所趋。基因工程微课设计中，教师应注意教学点的分析、重点难点的突破设计，应注重应用型人才培养。

关键词： 微拟球藻   中性脂   多不饱和脂肪酸   基因工程   转录组  

摘要： 微拟球藻具有生长速度快、脂质含量高及培养成本较低等特点。近年来,一些产油量丰富的微拟球藻藻株已投入工业化规模培养,建立起成熟的规模化封闭式光生物反应器和开放池等的户外培养体系。微拟球藻除了被认为是生物柴油生产的理想原料外,其胞内还能累积一些有益健康的活性物质,如类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸等,被认为是生产多不饱和脂肪酸的重要原料之一,如何提高微拟球藻多不饱和脂肪酸的生产效率已成为研究热点。随着高通量测序技术的发展,一些微拟球藻藻株的全基因组序列已经测序完成,但全基因组序列尚未公布,且很多基因缺乏注释,对研究其代谢途径带来了一定的困难。本研究首先通过RNA-seq对微拟球藻培养周期的转录组进行了分析,推测出微拟球藻的多不饱和脂肪酸代谢途径,为研究微拟球藻高产多不饱和脂肪酸及构建工程微藻提供了基础。通过分子生物学手段构建了微拟球藻的遗传转化表达载体,通过电击转化,成功得到Δ6去饱和酶基因过表达转化藻株NoD6,Δ5去饱和酶外源基因转化藻株PtD5b,Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶外源基因转化藻株PtD5bD6。通过对这3种转化藻藻株的生理生化分析,与野生型相比,发现3种转化藻株的生长速率没有变化,光合作用效率有轻微改变,而中性脂含量均显著增加。对比不同脂肪酸组成的变化发现,转化藻株的不饱和脂肪酸,尤其是多不饱和脂肪酸的含量有不同程度的提高。结果表明脂肪酸合成途径潜在关键基因D6、D5b去饱和酶均具有促进脂质合成以及多不饱和脂肪酸合成的重要功能。研究结果初步阐明了微拟球藻的多不饱和脂肪酸合成途径及其关键酶,为微拟球藻多不饱和脂肪酸合成途径的分子改良及选育高产多不饱和脂肪酸的藻株提供了理论支持,有助于推动其工业化应用。

关键词： 转基因   科学   发展   趋势  

摘要： 转基因作物给人类带来了很多益处,但由于对新生事物的了解、宣传不实,以及喜好、贸易保护等因素,使人们谈转基因色变,那么转基因实质是什么,为什么需要转基因,从一个高中生的角度,戴着"科学"和"发展"的眼镜看待转基因,指出转基因作物不仅是给人类增加了一种选择,更是一种发展趋势。

关键词： CRISPR   疾病模型   胚胎干细胞   NSun2   RNA甲基化  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)取自于着床前的囊胚内细胞团,具有无限增殖的自我更新能力和分化为包括生殖系在内的机体全部类型组织细胞的全能性。在一定的体外培养条件下,胚胎干细胞可以分化为心肌细胞、胰岛p细胞、神经细胞等多种类型的体细胞。胚胎干细胞全能性的特点,使其不仅为研究机体的发育机制和基因功能提供了良好的平台,也在细胞替代治疗等新兴疾病治疗手段中具有广阔的应用前景。哺乳动物在生物进化程度上更加接近于人类,是研究基因功能和疾病致病机理的良好模型。哺乳动物疾病模型,如啮齿类的小鼠、大鼠疾病模型,猪的疾病模型和非人灵长类的猴子模型等,在对基因的功能和作用机制的探索、新药研发及人类疾病的发病机理的研究和治疗等方面发挥着非常重要的作用。要获得遗传修饰的哺乳动物疾病模型需要同时具备以下两个因素：一方面是对遗传物质基因组DNA进行遗传修饰,常见的技术包括物理、化学和病毒或者质粒介导的随机插入、转座子系统介导的基因捕获、同源重组和位点特异性核酸内切酶介导的基因编辑等；二是将遗传修饰拓展到个体水平并能够通过生殖系传递到下一代,常见的技术包括胚胎原核注射、体细胞核移植、胚胎干细胞介导的生殖系嵌合以及单倍体胚胎干细胞替代精子与卵母细胞融合产生个体等。近几年发展起来的位点特异性核酸酶介导的基因编辑技术,是一种定向改造基因组的遗传修饰技术,是进行基因组改造和探索基因功能的关键技术手段之一。目前常用的基因编辑技术主要包括ZFN (Zinc-finger nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9。其中CRISPR-Cas9技术由于构建简单、使用方便、周期短、基因编辑效率高而且价格便宜,已经被广泛应用于基因修饰的干细胞系的建立和哺乳动物疾病模型的获得。其主要原理是通过gRNA利用碱基互补配对靶向目的位点,引导Cas9在该位点进行切割从而产生DNA双链断裂(Double strand break, DSB),进而诱发内源性的细胞修复机制,通过同源重组修复(Homologous directed repair, HDR)或非同源末端连接(Non-homologousend-joining NHEJ)将断裂的双链DNA连接起来,通过不同的修复方式以及利用设计好的带有同源区段的供体质粒或寡核苷酸片段,就可以实现基因敲除、外源基因或片段的定点插入、基因特定位点的定点突变以及染色体的大片段缺失和重排等遗传修饰。根据文献报道,NSun2基因是一种RNA甲基化转移酶,能够在tRNA的胞嘧啶第5位的C原子上进行甲基化修饰(5mC),促进tRNA的稳定性和蛋白质的生物合成,并能够抑制Myc基因诱导的肿瘤增殖,对精子发生也具有非常重要的作用。另有报道称NSun2基因异常会产生常染色体隐性的智力障碍。MRNA的甲基化修饰主要发生在腺苷酸第6位的N原子上(m6A),m6A修饰对mRNA的剪切,稳定性,细胞内的定位,翻译等具有非常重要的作用。因而我们推测mRNA的m5C修饰也可能具有非常类似的功能,研究NSun2对mRNA的5mC甲基化修饰的作用将有助于我们弄清楚NSun2基因发挥功能的分子机制。为此我们利用CRISPR技术建立了NSun2基因纯合敲除的胚胎干细胞(ESC)和小鼠动物模型,为后续的基因功能和分子机制的的探索、胚胎干细胞的重编程以及对小鼠的发育和代谢等研究提供了基础。

关键词： 转基因认知   转基因作物   风险评价  

摘要： 本研究针对广州大学生的转基因知识认知和转基因作物生态环境及食用安全风险问题,采用问卷调查方法,通过研究假设与经济计量模型、层次分析和模糊综合评价模型的建立,用统计软件SPSS19.0进行数据整理,对调查结果分别描述性表述、计量模型分析以及科学量化综合评价,从而得出结论,为有关部门提供相关建议。本文研究主要结论如下:大学生主观上对转基因的认知程度高,专业和常识认知程度低,对生活中转基因产品的关注度一般;互联网成为大学生关注转基因信息的主要途径,而最为关注的转基因内容是产品的食用安全;大学生尝试购买转基因产品态度是相对保守,但绝大多数大学生对国家发展转基因技术及其产业持积极态度。大学生受广告宣传和网络报道转基因信息的影响程度高。理学类(生物专业)相对于其他专业学生对转基因知识认知程度高。大学生中男生比女生、理学类(生物专业)相对于其他专业更易于交流探讨转基因话题。大学生的转基因认知程度越高,他们对其关注度也越高。受转基因信息的广告影响程度越大的大学生,对产品转基因问题关注度越高。对转基因产品的态度和国家对其发展的态度与专业、媒体影响、转基因法律法规认知度相关。大学生客观上转基因认知程度越高,他们接受转基因产品的意愿越高,但主观上对转基因认知的自我评价越高,他们尝试转基因产品意愿越低。媒体对转基因信息传播的影响因素有性别、转基因专业知识和法律法规认知度。另外,通过层次分析法和模糊综合评价法,对转基因作物的生态环境风险和食用安全风险进行科学量化分析,得出食用安全风险是最重要的风险因素,转基因作物的风险等级处于中等略高水平,其中转基因作物对非目标生物影响是比较重要的生态环境风险因素,转基因作物产生有毒物质是比较重要的食用安全风险因素。

关键词： Erk   Mek   胚胎干细胞   自我更新   基因组稳定性  

摘要： 用小分子抑制剂阻断Mek/Erk信号通路极大的提高了小鼠ES细胞自我更新和多能性能力,然而激活该通路则使ES细胞走向分化。更有趣的是该通路对于人ES细胞是非常重要的,小鼠ES细胞与人ES细胞不同之处仅仅在于小鼠ES细胞是一种全能性更高的na?ve状态,人ES细胞则更类似于小鼠的epiSCs(postimplantation epiblast derived stem cells)。那么Erk信号通路对于小鼠ES细胞发挥怎样的功能?为了在小鼠ES细胞中深入探究Erk信号通路,我们应用Cas9和TALENs技术构建了强力霉素(Doxycycline,Dox)可诱导的iErk1;Erk1/2-/-ES细胞。证明了Erk信号通路对小鼠胚胎干细胞多能性的维持以及基因组的稳定性都是不可少的。当Erk基因敲除之后,小鼠ES细胞的多能性下降,增殖能力减弱,细胞周期G1/S阻滞,端粒缩短以及细胞凋亡产生,并且当Erk信号通路被阻断之后,细胞的分化能力下降,表现为特异性表征分化的基因不能被有效的激活。进而,我们通过RNA-seq高通量分析结果发现了Mek下游非Erk依赖性途径的存在,阐述了小分子抑制剂处理Mek阻断Erk与通过基因水平敲除Erk产生不同的实验效果。总之,Erk信号通路对于端粒的维持,基因组的稳定性以及多能性的维持都是非常重要的。

关键词： 细胞分裂素   异戊烯基转移酶   基因工程  

摘要： 本文介绍了细胞分裂素的种类和生物合成过程，阐述了异戊烯基转移酶是细胞分裂素生物合成过程中的重要限速酶，其编码基因ipt已被克隆并在植物基因工程得到广泛应用。重点综述了转化ipt基因可增加植物内源细胞分裂素的含量，在延缓叶片衰老、提高作物产量、诱导单性结实、抗旱、抗病虫害、抗寒等方面起到了显著作用，并分析了ipt基因在植物基因工程中应用研究方向。