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关键词： 基因工程   外源   水稻   研究  

ISBN: (纸本)9787030466242

摘要： 自2002年起，在国家重点基础研究“973”计划和国家转基因重大专项的支持下，作者对水稻转基因飘流进行了13年的系统研究，通过大量的多年、多点田间试验，阐明了不同类型水稻基因飘流的基本规律，建立了水稻花粉扩散和基因飘流的普适模型，以南方稻区15个省1270个气象台站记录的水稻开花期连续30年(1981-2010)的气?

ISBN: (纸本)9787513043045

关键词： 大肠杆菌   L-色氨酸   基因工程   NADPH   耐酸  

摘要： L-色氨酸是一种重要的芳香族氨基酸,广泛应用于饲料和医药方面。本研究依据代谢工程理论,以L-色氨酸工程菌TRTH为出发菌株,构建L-色氨酸高产菌。tktA基因编码的转酮醇酶在磷酸戊糖途径中生成4-磷酸赤藓糖起主要作用。在本实验中,将两种启动子控制的tktA基因整合至假基因位点ybfG处,获得菌株TRTH（△ybfG::Ptrc 1-tktA）和 TRTH（△ybfG::Ptrc2-tktA）。通过30L发酵罐进行发酵实验,结果表明,菌株TRTH（△ybfG::Ptrc1-tktA）L-色氨酸产量36.2 g/L,相比较于菌株TRTH（32.2 g/L）产量提高12.4%。而菌株TRTH（△ybfG::Ptrc2-tktA）L-色氨酸产量 12.3 g/L,相比较于菌株TRTH下降61.8%。发酵结果表明适当增强tktA基因表达量能够增加L-色氨酸前体物E4P的合成,减少耗糖量提高L-色氨酸产量。将将解除了反馈抑制的基因trpEfbrD整合至假基因位点处构建菌株TRTH(△ybfG::Ptrc-trpEfbrD)。发酵结果显示 TRTH(△ybfG::Ptrc-trpEfbrD)L-色氨酸产量为29.3 g/L,比出发菌TRTH降低9.3%。这表明L-色氨酸工程菌质粒本身所带有的L-色氨酸合成相关基因表达量已足够。以增加NADPH为目的,将gapC基因替换大肠杆菌自身基因gapA构建了菌株TRTH（△gapA::PgapA-gapC）。发酵 L-色氨酸最终产量为 37.5 g/L,相较于 TRTH（32.2 g/L）,增加15.4%。说明通过增加NADPH的供应量对提高L-色氨酸产量和减少乙酸有正向效果。菌株TRTH生产L-色氨酸时,发酵周期较长,容易染菌,若将培养基pH降低可减少生产过程中染菌的机率。构建了耐酸性菌株TRTH（△araBAD::Para-arcA）和TRTH（AaraBAD::Para-gadBC）。将菌株TRTH（AaraBAD::Para-arcA）分别在pH5.5、6.0及双阶段情况下发酵,L-色氨酸产量均提高。菌株TRTH（△araBAD::Para-gadBC）在pH6.0情况下发酵,最终L-色氨酸产量为27.45 g/L下降18.86%。发酵结果表明谷氨酸依赖性系统的强化并没有显著提高TRTH的耐酸能力。

关键词： 原发性肝细胞癌   分子分型   经肝动脉化疗栓塞术   临床疗效  

摘要： 研究背景：　　外科切除、肝移植术和局部消融是肝细胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC，以下简称肝癌）可能治愈的方法。对于晚期或进展期肝癌患者，临床以非手术治疗为主。经肝动脉化疗栓塞术（Transcatheter arterial chemoem-bolization， TACE）以微创、明确的疗效已成为临床非手术方案首选的治疗方法。TACE术后残癌及复发是影响肝癌远期疗效的瓶颈。因此，肝癌的早期筛查、诊断和治疗对于改善患者预后有重要的意义。特别是如何早期明确诊断 TACE术后残癌及复发，是当今面临的严峻问题。目前针对残癌的诊断及随访主要依靠血清学检测和影像学检查，其中以影像学检查为主。血清学检测最常见的是AFP检测。但临床证实AFP特异性、敏感性差，并且在不同的疾病进展状态下，AFP的高低并不能实时反应出肿瘤进展的真实情况。影像学检查对于位置深的小病灶或者低流速、乏血供病灶的诊断精确性较差。近年来研究表明，血浆游离DNA（cell free DNA，cfDNA）能有效反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息，与肿瘤组织的基因信息呈一定相关性。通过对血浆cfDNA测序检测肿瘤相关的基因拷贝数变化、甲基化变化、染色体重排变化等已广泛应用于临床诊断、用药指导和检测肿瘤发生情况。文献报告，cfDNA的变异情况对肿瘤患者的辅助诊断价值优于传统肿瘤标志物，如CEA、CA199等，某些方面也优于影像学检查。但极少有相关的临床研究。　　目前关于肝癌的治疗，主要依据是病理类型及肝癌分级。但临床发现，同一病理类型的肝癌，经过相同的治疗方案，其结果却差别很大。提示肝癌分子分型不同。依据分子分型进行个体化的精准治疗，是肝癌研究的热点，也是趋势。　　因此，本研究旨在通过前瞻性研究，探索基于cfDNA的肝癌分子分型及其对肝癌TACE后残癌的早期预警。　　研究目的：　　评估基于第二代测序技术的cfDNA肿瘤相关基因变异检测是否可以用于分析肝癌的分子分型;观察肝癌患者在介入治疗过程中血浆cfDNA动态变异的出现，是否早于传统的实验室和影像学检查，并实时、客观反应肿瘤进展。　　材料和方法：　　本研究分为两个部分，第一部分，利用基于第二代测序技术的目标基因靶向测序技术，对41例肝癌患者的肿瘤组织DNA、血浆cfDNA和血细胞DNA中的21个肿瘤相关基因进行捕获测序。分析肿瘤组织DNA、血浆cfDNA和血细胞基因组DNA中的肿瘤相关突变基因及突变负荷率，比对出差异基因，以及差异基因的突变趋势。　　第二部分选择接受TACE治疗的肝癌患者（包括早期和中晚期），定期检测和评估患者血浆cfDNA基因变异的情况，同时从临床症状、影像学检查、实验室检查（AFP）等方面进行随访，判断患者血浆 cfDNA动态变异的出现，是否早于传统的实验室和影像学检查，并实时反应肿瘤进展情况。　　结果：　　本研究的第一部分，在肝癌患者中驱动基因（PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、ERBB4）的变异负荷率最大。在高频变异的基因中，血细胞DNA总体变异谱（基于变异频率）不同于肿瘤组织DNA和血浆游离DNA变异谱，而肿瘤组织DNA和血浆cfDNA变异谱较为接近，提示血浆cfDNA和肿瘤组织DNA中肿瘤相关基因变异的一致性较好。多发病灶的肝癌患者血浆游离 DNA中CTNNB1、PIK3CA、MET、EGFR、FBXMW7、EGFR、TP53、ERBB2基因变异负荷量较单发病灶患者高。AFP正常的患者中血浆cfDNA基因变异结果显示，在AFP正常的肝癌患者（AFP<20ng/ml）中CTNNB1、EGFR、ALK、BRAF、NOTCH1基因变异负荷量较高。　　本研究的第二部分，在前期基础研究纳入的患者中，选取其中资料完善、随访规律的三例患者为观察对象，前瞻性的观察患者在介入治疗期间cfDNA动态变异情况。两例患者均为晚期肝癌，病灶为巨块型，伴多发小结节，门脉受侵犯伴有癌栓，均接受了3次TACE治疗。1例为早期肝癌患者。治疗前和治疗后一周期间，患者血浆 cfDNA中肿瘤驱动基因（NRAS、BRAF、PIK3CA、ARID1A、AXIN1、ARID2、TERT、TP53、CTNNB1基因）的变异负荷量未发生变化，而此期间 AFP是下降趋势，影像学评估为疾病缓解（PR）。治疗后1个月时，患者血浆cfDNA中肿瘤驱动基因的变异负荷量总体呈现上升趋势，提示肿瘤进展，但此时AFP仍然下降，患者影像学评估仍为疾病缓解。患者治疗后1个半月后时，AFP又明显升高，影像学此时评估为病变进展（PD）。另一例早期肝癌患者，cfDNA的变异负荷量的变化，也客观反映了肿瘤进展情况，早于影像学，并且在后期的治疗中得到了临床验证。　　结论：　　1.肝癌患者血浆cfDNA和肿瘤组

关键词： 猪   卵母细胞   孤雌胚胎   ES细胞  

摘要： 本试验以从屠宰场采集废弃的猪卵巢为研究材料,对卵母细胞体外成熟培养体系以及孤雌囊胚胚胎干细胞的分离培养进行了探究。首先以亮甲酚蓝染色对成熟培养前的卵母细胞进行筛选,并通过添加db-cAMP来达到核质的同步成熟,进而提高卵母细胞的体外成熟质量;随后以孤雌激活后得到的囊胚为材料,从胚龄、饲养层以及内细胞团的分离几个方面对孤雌胚胎干细胞的分离培养进行了探究。试验主要结果如下:1.以13、26、39、52μmol/L的亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对成熟培养前的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)染色90 min,比较不同浓度的BCB对卵母细胞的着色率、成熟率以及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的早期发育情况。分析结果显示,BCB浓度为26μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,而又不影响其体外成熟的效率。挑选BCB+组卵母细胞进行孤雌激活和核移植试验,其卵裂率和囊胚率均显著高于BCB-组(P<0.05)。胚胎移植试验挑选BCB+组中发育较好的1细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。2.成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP时,卵母细胞的成熟率随着浓度的增加依次降低,但浓度为1 mmol/L时,孤雌激活后的囊胚率最高(27.03%);卵丘细胞单层与卵母细胞共培养时,其成熟率、卵裂率及囊胚率(86.00%、89.04%、28.36%)也得到了显著提高;0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率(85.78%和88.95%)与对照组差异不显著,但囊胚率(35.14%)显著提高。3.试验研究了囊胚的胚龄、饲养层的种类及囊胚的不同处理对猪孤雌囊胚胚胎干细胞分离培养的影响。实验结果显示:①第8天的囊胚贴壁率(25.00%)显著高于第7天和第9天;②以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层时贴壁率为18.52%,显著高于猪胎儿成纤维细胞和猪子宫上皮细胞饲养层(P<0.05);③取孤雌激活后第8天的囊胚分成全胚组、孵化囊胚组、去透明带组和分离内细胞团(ICM)组进行体外培养时,分离的ICM贴壁率明显高于其他组(P<0.05)。

关键词： 胚胎干细胞   自我更新   分化   Gadd45g   STAT3  

摘要： 小鼠的胚胎干细胞起初是于1981年在实验室条件下分离得到的,与此同时建立起了最早的具有全能性的胚胎干细胞系。基于已有的小鼠胚胎干细胞建系方法,科学家先后在多种家畜动物中分离胚胎干细胞并建立相应体系。因胚胎干细胞具有自我更新和全能性的独特生物学性质,无论是在生物发育学角度还是在临床医学研究上均具有非常重要的研究意义。为了更透彻的研究影响胚胎干细胞相关特性的机制,更多的研究者将研究重点集中在如何在体外维持其自我更新状态；如何定向诱导其分化,以便于为临床疾病建立模型。经过大量的实验和数据分析,科学家已探索出能够在体外环境下维持胚胎干细胞自我更新状态的方法。然而胚胎干细胞维持自我更新是一个较为复杂的生物学过程,不同的基因,不同的通路亦或者不同外界条件的影响都会使其状态发生变化。目前对于影响胚胎干细胞的相关基因、通路和调控机制的研究尚不完善,这也阻碍了其在应用上的广泛性。因此借助分子实验技术研究新的基因对于胚胎干细胞的影响,是有利于更全面的了解胚胎干细胞维持自我更新及分化的调控机制。大量报道指出Gadd45g与肿瘤的发生有关,目前已证实其与垂体瘤、睑板腺癌、食管鳞癌、结肠癌等肿瘤细胞形成有关。而我们已经知道,干细胞与肿瘤细胞存在很多相似的生物学特性,因此我们猜想Gadd45g可能对胚胎干细胞也存在一定的作用,到目前为止,尚未有关于该基因在胚胎干细胞中作用机制的报道,所以我们大胆推测该基因可能与胚胎干细胞的增殖有关。我们想要通过该课题探索Gadd45g在小鼠胚胎干细胞中如何调控其自我更新过程,首先需在胚胎干细胞中过量表达该基因,然后借助相关实验软件设计该基因引物并大量扩增。测序验证正确后,在脂质体的协助下将该基因导入46C细胞内进行过表达并验证。当稳定细胞株建立后,充分利用胚胎干细胞的特性,即处于自我更新状态的胚胎干细胞可在碱性磷酸酶染色后着色,然而处于分化状态的胚胎干细胞则无法着色,借此可对细胞状态进行判别。通过阅读大量文献,我们可以筛选出一些具有特殊标志性的基因,如胚胎干细胞维持自我更新的标志性基因Oct4、 Nanog等,通过免疫荧光实验,运用带有染料的二抗来识别相对应的一抗抗体,识别后可以根据显微镜下荧光的相对含量来推断相应蛋白的表达量,从而判定胚胎干细胞是否处于自我更新状态。实验结果证实,在过表达Gadd45g基因后胚胎干细胞的生长速度明显降低且出现了明显的分化状态,说明Gadd45g基因具有抑制胚胎干细胞自我更新,促进其分化的作用。初步断定后,我们想借助一些功能验证实验来探究其作用。首先选择了qPCR实验,通过标志性基因判定细胞状态的同时借助细胞各发育状态的标志性基因的表达量变化来推测Gadd45g可能影响胚胎干细胞发育的具体阶段。我们筛选了Esrrb、Tfcp211(CP2样转录因子1)、Sox17、Gata6、Foxa2、T、Mixl1、GSC、Nestin以及Sox1等标志性基因,结果对比分析可知,过表达Gadd45g后对中内胚层标志性基因的表达量影响较大,由此可以推断Gadd45g对于中内胚层发育阶段的影响较大。为了验证其蛋白的表达量变化,我们还做了Western Blotting实验,因前期报道指出该通路对于LIF/JAK/STAT3信号通路有作用,所以我们也选取了STAT3作为目标蛋白进行验证。通过实验结果分析,过表达Gadd45g的实验组STAT3磷酸化表达量与对照组相比,表达量有明显变化,因此可以推断在胚胎干细胞中Gadd45g基因同样影响了LIF/JAK/STAT3信号通路。之前大量的文献报道,在培养基中加入一些化学小分子对于维持胚胎干细胞自我更新是有一定作用的,而我们实验过程观察到过表达Gadd45g后的胚胎干细胞相对于实验组的生长速度有明显的下降趋势。基于此我们筛选了大量的化学小分子,如CHIR、PD03、ActivinA、 bFGF等,试图寻找到可以抑制Gadd45g对胚胎干细胞作用的化学小分子。经过分条件培养、细胞计数以及碱性磷酸酶染色验证胚胎干细胞状态后,我们筛选到Rho激酶抑制剂(Y-27632),简称Y27,可以抑制Gadd45g对胚胎干细胞的影响。大量实验数据分析得知Gadd45g基因对于小鼠胚胎干细胞的增殖有一定作用,该基因会抑制胚胎干细胞的自我更新,促进其分化；同时实验结果还验证其影响胚胎干细胞中内胚层的发育过程并且调控LIF/JAK/STAT3信号通路。目前还没有针对该基因可以调控胚胎干细胞的相关报道。所以本课题的研究发现了一个抑制胚胎干细胞维持自我更新,促进其分化的全新基因,丰富该基因作用的同时也扩充了胚胎干细胞的研究范围。

关键词： 毛细管电泳   微流控芯片   片段分选   DNA测序   基因表达   综述  

摘要： 新一代测序速度越来越快,费用不断降低,但整个流程中还有不少瓶颈。最耗时且影响测序准确度和重复性的环节之一,就是在文库制备过程中,对打断的大量基因组DNA片段进行基于传统凝胶电泳的手工操作筛选。近几年市场上出现了几种目标片段自动分选仪器,并迅速被多家国际知名测序中心引入测试,从而引起了广泛关注。本文评述了DNA片段分选发展经历,包括凝胶电泳、毛细管电泳、特别是微流控芯片在分选精度和通量上的不断提升,并简要论述了DNA分选目前尚存在的问题。

关键词： 胚胎干细胞   RNA Haunt   非编码   长链   调控作用   基因组   染色体组  

摘要： 文章简介长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200nt且不编码蛋白质的RNA转录物。近年来,随着高通量测序的普及越来越多的lncRNA被鉴定出来,据估算人和小鼠的基因组中lncRNA基因和蛋白编码基因数量基本相当。但关于lncRNA的功能研究一直存在争议。到目前为止,只有少数lncRNA被证明是有功能的。沈晓骅实验室创新性地利用CRISPR/Cas9系统介导的敲除、敲入等策略,系统全面地研究了一个长链非编

关键词： 土壤重金属污染   牡丹   芍药属   植物修复   毒害   重有色金属   重金属   耐逆性   食物链   大豆   航天育种   基因工程  

摘要： 土壤耐受重金属毒害关键基因找到土壤重金属污染是全球性的重要环境问题之一,被污染土壤中的重金属可被农作物吸收进入食物链,严重影响食品安全并危及人类健康。植物修复基因工程是解决土壤重金属污染的重要途径之一,其中,寻找和发掘耐受重金属毒害且调控重金属超量积累的关

关键词： 甲醛   基因   启动子   转化   表达   基因工程  

摘要： 甲醛(HCHO)是装修后的主要污染物之一,对室内环境和人体健康影响较大。植物净化作为一种生态环保的净化室内空气质量的手段,一直被人们所关注。研究证明,利用基因工程手段增强转基因植物HCHO代谢能力可提高其吸收外源HCHO的速率和脱毒能力。HPS和PHI是许多甲基营养菌甲醛固定途径RuMP的关键酶。本研究论文的工作:(1)从番茄中克隆了可定位在植物叶绿体细胞器的RbcS3c基因两个长度不同启动子和信号肽序列,并进行元件分析和功能预测;(2)分析金鱼草密码子的偏好性并对目的基因hps-phi融合序列进行优化后,将RbcS3c基因信号肽和hps-phi目的基因构建到瞬时表达载体中,观察其是否定位到叶绿体中表达;(3)构建RbcS3c基因2个长度不同启动子引导hps-phi目的基因的表达载体,转化烟草获得转基因植株,通过定量PCR比较不同长度启动子启动目的基因效率,并验证hps-phi目的基因分解甲醛的作用;(4)建立金鱼草的再生体系,获得大量的可转化植株。第一部分工作结果:从番茄中克隆了可定位在植物叶绿体细胞器的RbcS3c基因两个长度不同启动子和信号肽序列,分别命名为RbcS3cPS1和RbcS3cPS2。RbcS3cPS1片段长度为738bp,对该序列进行测序分析并与已发表的RbcS3c基因(X05986)相应序列进行比较发现:在TATA盒、CAAT盒等重要功能区域并未发现有碱基的改变,说明所克隆片段即为番茄RbcS3c基因上游调控序列。Plant CARE软件分析该序列表明:该基因启动子含有多处保守序列,而且越靠近起始密码子区域序列越保守,该启动子序列除含有启动子必需的CAAT框、TATA框外,还含有G-box、I-box、box I、box II、ATC-motif等十二种与光响应有关的元件。另外,还含有一个个Me JA响应元件、一个乙烯响应元件。将该基因启动子再向上游拉长后扩增的RbcS3cPS2片段长度为1086bp序列。在从RbcS3c基因启动子738bp向上游延伸的300bp的序列中,发现这个启动子有很多与植物非生物胁迫相关的响应元件,如ABRE、G-BOX、HSE、GARE-MOTIF、TATC-BOX、MBS。与Gen Bank中X05986比对,本研究克隆的两个不同长度的RbcS3c基因启动子和信号肽序列虽然在TATA-box、CAAT-box、G-box等重要功能区域没有碱基改变,但在其他区域存在9处碱基的差异,包括8处碱基替换和1处碱基缺失,这些差异序列都存在于738bp序列中。两者与已发表的RbcS3c基因(X05986)相应序列同源性分别为98%和98.7%。这说明在不同番茄品种之间RbcS3c基因启动子序列会存在一定的差异性。第二部分工作结果:金鱼草的ENc值为61,偏大,表明金鱼草在密码子的使用上偏好性不强。叶绿体中的密码子使用较为均匀,除终止密码子外,最小的为2.5,分别是苏氨酸ACG和丝氨酸AGC,最大的是苯丙氨酸UUU,使用率在千分之53.5左右,其次是天冬酰胺千分之37.0。根据生物软件计算结果表明,GCC、GAC、GAG、TTC等30个以C或G碱基为第3位的密码子的RSCU值均大于l,且Frac值也较大,为hps-phi基因的偏好密码子。据此,将甲基营养菌中hps-phi融合基因序列根据密码子简并性优化,优化后的序列与原序列的相似度为76%左右。通过烟草瞬时表达,我们可以看到在信号肽的指导下,携带目的基因成功定位到叶绿体中。这说明我们克隆的信号肽虽然在氨基酸组成上与NCBI中报道的序列有2个氨基酸的差异,但其信号肽功能并没有发生改变,这与生物软件预测结果一致。即我们克隆的信号肽与NCBI中报道的信号肽剪切位点不同,但在功能上都可以发挥信号肽的作用。第三部分结果:分别构建两个由番茄RbcS3c基因不同长度启动子及信号肽引导融合基因hps-phi的表达载体:pC1301-RbcS3cP1S::hps-phi-Nos(小载体)和pC1301-RbcS3cP2S::hps-phi-Nos(大载体),并利用根癌农杆菌介导转化烟草获得转基因植株。利用定量PCR检测分别含有大、小载体转基因烟草植株目的基因的表达量。结果显示,在含有小载体转基因植株中,目的基因表达量平均比含有大载体转基因植株提高20多倍。转基因烟草植株抗甲醛能力检测显示,含有小载体转基因植株非常强,比野生型提高了约14-20倍,这也与目的基因定量检测结果一致。目的基因定量分析以及抗甲醛能力检测结果都表明,将启动子加长之后并没有增加外源基因的表达量,反而比没有加长的启动子表达量更低。由此我们推测,在加长的启动子序列上,可能有某些功能元件抑制了该启动子的效率,从而使目的基因的表达量下降到几乎没有表达的水平。最后,我们建立了金鱼草的再生体系,研