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关键词： 普通小球藻   基因工程   光合作用   醛缩酶   生物碳减排  

摘要： 由温室气体导致的全球变暖现象已经引起全世界的广泛关注。其中CO2是温室气体的主要成分。据世界气象组织(WMO)估计,现今大气中的CO2浓度已惊人地超过400ppm,比工业化之前的280 ppm提高了约43%。因此,发展低碳经济技术、实现碳减排已刻不容缓。目前已有多种技术致力于大气中CO2的捕获与封存,其中利用微藻进行固碳的生物碳减排技术逐渐成为当今的研究热点之一。微藻通过光合作用,将CO2转化成油脂、蛋白质、淀粉和类胡萝卜素等生物质,有助于实现碳减排。同时,微藻具有光合效率高、生长快、培养成本低,以及易工业化集成等优点,因此,通过微藻固定CO2实现碳减排是一项经济有效的技术,具有广阔的发展前景。但微藻通过光合作用固定CO2的效率仍然有限,如何实质性的提高其内在的光合固碳能力成为制约微藻生物固碳技术发展的一个难题。本研究以具备良好的CO2固定和耐受能力的普通小球藻(Chlorella vulgaris)为研究对象,首次提出并尝试通过基因工程技术过表达光合作用卡尔文循环中的关键酶基因来实质性的提高普通小球藻光合固碳的能力,从而达到碳减排的目的。首先利用增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)建立了一套稳定有效的普通小球藻遗传转化体系,在此基础上,将集胞藻(Synechocystis ***6803)卡尔文循环中的关键酶——果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因(FBA)导入到普通小球藻基因组中,成功地将其定位到叶绿体中进行了表达,有效地提高了普通小球藻的生长速率和光合效率(CO2固定速率)。此外还探究了集胞藻FBA基因对普通小球藻光合固碳可能的调控机理。本研究结果为小球藻基因工程和细胞生物学研究奠定了良好的基础,同时为今后进一步提高其光合固碳效率提供了参考与依据。本研究的主要结果如下:(1)确定了普通小球藻外源基因遗传转化体系的最适筛选标记。通过在普通小球藻的固体培养基中分别添加4种不同的抗生素(卡那霉素,G418,壮观霉素和氯霉素),发现其对G418最为敏感,半致死率(LC50)可达11.74μg/m L。之后通过在液体培养基中分别添加不同浓度的G418,发现30μg/m L的G418可强烈地抑制藻细胞的生长,抑制率可达90%以上。因此,30μg/m L的G418可作为普通小球藻遗传转化体系筛选转化子的有效浓度,同时G418对应的抗性基因——新霉素磷酸转移酶基因(npt II)可作为该遗传转化体系的最适抗性筛选标记。(2)利用EGFP报告基因建立了一套稳定有效的普通小球藻外源基因遗传转化体系。通过克隆EGFP基因,利用聚乙二醇(PEG)转化法首次将EGFP基因导入到普通小球藻的基因组中,转化率为356±30 cfu/μg DNA。通过PCR、Southern杂交和反转录PCR(RT-PCR)和荧光显微实验,结果表明EGFP基因成功整合到了普通小球藻的基因组中,并可在细胞质基质中进行可见表达。另外,经过细胞传代实验,发现普通小球藻在传代16次后仍能表达出可见荧光。由此建立了一个稳定有效的普通小球藻外源基因遗传转化体系。(3)克隆并验证了rbc S基因叶绿体导肽(c TP)序列的亚细胞定位功能,同时验证了在普通小球藻的叶绿体中表达核基因组编码的外源蛋白的可行性。从普通小球藻中克隆了核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因(rbc S)的c TP序列,通过构建一系列中间载体将其融合到EGFP基因的N端(c TP::EGFP),并利用PEG法导入到普通小球藻中,经过荧光亚细胞定位分析,发现c TP::EGFP融合基因在藻细胞的叶绿体中表达出肉眼可见的绿色荧光,而未融合c TP序列的EGFP基因仅在细胞质基质中表达出绿色荧光,由此表明该c TP序列起到了叶绿体定位的功能,且验证了在普通小球藻的叶绿体中表达核基因组编码的外源蛋白的可行性,同时拓展了荧光蛋白技术在微藻分子生物学研究中的应用。(4)通过在普通小球藻叶绿体中过表达FBA酶,有效地提高了普通小球藻的生长和光合效率。从蓝藻的模式生物——集胞藻中克隆了其FBA基因,通过构建融合上述c TP序列的FBA超表达载体,利用PEG法首次将集胞藻FBA基因导入到普通小球藻基因组中,通过PCR、southern杂交、RT-PCR和western杂交共同鉴定,表明集胞藻FBA基因成功整合到了转化藻株的基因组DNA中并进行了表达。另外,通过测定发现转化藻#3和#5的FBA酶活显著高于WT 1.27和1.30倍(p<0.05),其生物量在培养中后期也显著高于WT(p<0.05),同时,它们的净放氧速率和CO2固定速率也分别是WT的1.18.21倍与1.15.18倍(p<0.05),表明集胞藻FBA基因的过表达能有效地促进藻细胞的生长与光合效率。(5)通过比较转FBA藻(#3和#5)和野生型藻的生理指标

关键词： 草酸青霉   工程菌构建   木糖苷酶   酶学性质   优化   发酵生产   应用  

摘要： 木聚糖是半纤维素的主要组成成份,广泛存在于硬木和谷物的细胞壁当中,是自然界中丰富的可再生资源。植物木聚糖的异质性及其复杂的化学性质,决定了它的完全降解需要多种酶的共同参与。β-木糖苷酶是木聚糖酶系中重要的酶组分,在降解木聚糖的过程中,它不仅可以解除木二糖对木聚糖酶的抑制作用,而且能够水解木寡糖生成更多的木糖。β-木糖苷酶在生物转化、制浆造纸和医药行业等方面具有很大的应用潜力,获得高产量的β-木糖苷酶具有重要的实践意义。通过对草酸青霉野生株及其多株突变株等菌株的发酵鉴定,筛选出一株合成木糖苷酶较高的草酸青霉ΔlaeA-gpdA (p) ::xlnR。与草酸青霉野生株114-2相比,该菌株合成木糖苷酶的能力提高了4.5倍。对114-2、ΔlaeA、gpdA(p)::xlnR、 gpdA(p)::clrB、ΔlaeA-gpdA(p)::xlnR和ΔlaeA-gpdA (p)::clrB六株菌株的木糖苷酶基因转录水平的分析表明,同时敲除laeA和过表达xlnR之后,木糖苷酶基因转录水平显著上调,而对114-2菌株单独的进行敲除laeA或过表达xlnR的改造,菌株合成木糖苷酶的能力并没有明显的变化,显示LaeA和XlnR共同作用于木糖苷酶基因的表达。在草酸青霉ΔlaeA-gpdA (p) ::xlnR中成功同源过表达8个木糖苷酶基因(xyl3A、 xyl3C、xyl3D、xyl43A、xyl43C、xyl43D、abf43D和xyl31A)。其中,过表达xyl3A的其中一株转化子(BZ-1)的β-木糖苷酶和木聚糖酶酶活分别达到35.7 U/mL和408 U/mL,为出发株的28.4倍和1.9倍。abf43D、xyl3D和xyl31A基因转化子的木糖苷酶活分别为出发菌株的1.6、1.6和2.0倍,显示在草酸青霉中过表达β-木糖昔酶可以实现其β-木糖苷酶合成能力的显著提高。对纯化后的Xy13A进行酶学性质检测,结果显示Xyl3A的最适底物为lpNPX,比酶活为25.2 U/mg,其对pNPX的最适作用温度50℃,在45℃以下其温度稳定性较好;最适pH值3.5～5,pH4.5时酶活力较稳定。大部分金属离子(Cu2+、Co2+、 Ca2+、Pb2+、Ba2+、Mg2+、K+、Mn2+和Zn2+),对酶活的影响不明显;加入5 mM的Fe3+时,p-木糖苷酶相对酶活为119%,显示铁离子促进β-木糖菅酶活性;5 mM的SDS存在下,β-木糖苷酶活降低了57%,显示其对Xyl3A活性具有较强抑制作用。该酶对木糖的耐受性Ki值为5mM,以pNPX为底物时的Km值为0.36 mM。为提高BZ-1合成β-木糖苷酶的能力,对发酵碳氮源等培养条件进行了优化。得到发酵BZ-1的最优培养条件为玉米芯2.4%,微晶纤维素2.4%,麸皮2.4%,玉米浆粉2.1%,KH2PO40.5%, MgSO4·7H2O 0.05%o在此培养条件下,BZ-1合成的β-木糖苷酶、木聚糖酶和滤纸酶活分别达到67.7U/mL、556.7 U/mL和0.4U/mL。其中,β-木糖苷酶酶活力是目前已报道的丝状真菌中产酶的最高水平。以碱处理的玉米秸秆为底物,研究了基因工程菌BZ-1的β-木糖苷酶粗酶液在降解半纤维素与协同降解纤维素原料中的应用潜力。发现与出发菌株::xlnR的粗酶液和商品木聚糖酶相比,BZ-1菌株的粗酶液具有更高的水解玉米秸秆中木聚糖的能力,木聚糖转化率显著提高。利用来源于玉米芯、甘蔗渣及山毛榉的木聚糖进行酶解实验,发现BZ-1菌株的粗酶液对玉米芯来源的木聚糖的降解效果最好,显示β-木糖菅酶对木聚糖底物的降解具有特异性。

关键词： 绿针假单胞菌GP72   吩嗪-1-羧酸   2-羟基吩嗪   无痕敲除   过表达  

摘要： 绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）GP72是一株从青椒根际分离得到的植物根际促生菌株,它能够分泌吩嗪-1-羧酸（PCA）、2-羟基-吩嗪-1-羧酸（2-OH-PCA）、2-羟基-吩嗪（2-OH-PHZ）三种具有抗真菌作用的吩嗪类化合物,其中PCA与2-OH-PHZ均是有效的杀菌剂。PCA由于其广谱而良好的抗菌效果和环境友好等特点,在2011年被中国农业部授予农药证书,并将其正式命名为“申嗪霉素”。相对于PCA,2-OH-PHZ在拮抗某些病菌时显示出更好的效果,如防治引起小麦全蚀病的病源真菌。小麦全蚀病是一种严重影响小麦产量的全球性病害,目前尚没有特效农药,2-OH-PHZ则是很好的潜在候选,具有良好的应用前景。由于吩嗪类物质的化学合成产量不高,并产生氧化铅、苯胺、苯二胺等有毒有害物质,阻碍了其生产应用,因此利用微生物发酵生产以PCA、2-OH-PHZ为代表的吩嗪类物质是一个必选方案。目前,利用微生物发酵生产2-OH-PHZ的菌株主要来自绿针假单胞菌,GP72便是其中一株,但其野生株的2-OH-PHZ产量仅仅只有4.5 mg/L。因此提高GP72菌株中2-OH-PHZ的产量成为我们目前迫切需要完成的任务。为了提高绿针假单胞菌GP72中2-OH-PHZ的产量,我们采取了敲除负调控基因;增强吩嗪合成的前体途径-莽草酸途径;删除吩嗪合成的竞争途径;优化phzO基因的密码子提高PCA转化2-OH-PHZ的效率等措施,虽然后两种尝试没有得到理想结果。首先,我们通过敲除负调控基因的方法提高GP72中2-OH-PHZ的产量。GP72中吩嗪类物质的合成是以分支酸为前体的,而分支酸的合成则是由4-磷酸-赤藓糖（E4P）与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）经由莽草酸途径合成的。PEP作为中心代谢重要的中间产物,参与了一系列代谢反应,其中由丙酮酸激酶催化的PEP转化为丙酮酸的反应是重要的PEP消耗反应,阻断这一反应可以增强莽草酸途径。因此我们尝试将GP72中的丙酮酸激酶基因pykF敲除从而部分阻断PEP向丙酮酸的转化（GP72中含有pykA与pykF两个丙酮酸激酶合成基因）,经过HPLC检测,pykF敲除株的2-OH-PHZ的产量相对于野生株GP72增长了6.7倍,由4.5 mg/L增加到35 mg/L。在实验室的前期研究中,我们通过插入失活负调控因子rpeA的方法大大提高了2-OH-PHZ的产量。我们在GP72Δpyk的基础上敲除了基因rpeA,获得了突变株GP72ND-1,经HPLC检测发现,2-OH-PHZ的产量由35 mg/L增长到239.8 mg/L。经研究发现负调控因子RpeA是双元调控系统RpeA/RpeB的组成部分,双元调控系统是细菌中重要的全局调控系统,而在假单胞菌中被研究最多的双元调控系统则是GacS/GacA系统。最近的研究表明,在绿针假单胞菌30-84中,通过GacS/GacA发挥作用的rsmE的过表达抑制了包括吩嗪在内的某些次级代谢产物的产生,因此我们在GP72ND-1菌株中敲除了rsmE基因获得了菌株GP72ND-2,2-OH-PHZ产量由239.8 mg/L提高到273.5 mg/L。同样的,有报道表明,在Pseudomonas protegens中,ATP依赖的蛋白水解酶LON可以通过降低GacA蛋白的稳定性来影响GacS/GacA的稳定性,在Pseudomonas protegens中敲除lon可以提高某些抗生素的活性,因此我们在菌株GP72ND-2上敲除了lon获得了菌株GP72ND-3,经检测发现菌株的2-OH-PHZ产量由273.5 mg/L上升到300.5 mg/L。我们通过在GP72基因组中连续敲除了pykF、rpeA、rsmE、lon四个基因使GP72的2-OH-PHZ的产量由4.5 mg/L提升到300.5mg/L。其次,为了增强GP72中2-OH-PHZ的产量,我们选择强化吩嗪合成底物-分支酸的合成途径--莽草酸途径。莽草酸途径的强化大致有以下几个策略:增加强化合成底物E4P与PEP,通过过表达转酮酶（由tktA编码）,磷酸烯醇式丙酮酸合成酶（由ppsA编码）;解除或减轻限制途径或反馈抑制,如大肠杆菌中通常会通过点突变改造DHAP合成酶基因（由aroG、aroF、aroH等基因等编码,在假单胞菌中则是主要由phzC等基因编码）;增强限制途径的催化酶的活性,如过表达DHQ合成酶（由aroB编码）、DHQ脱水酶（由aroD编码）、莽草酸脱氢酶（由aroE编码）等。我们选取了GP72中存在的ppsA、tktA、phzC、aroB、aroD和aroE六个莽草酸途径关键酶,利用模块化质粒pBbB5K在菌株GP72ND-3中进行过表达,而六个基因的排列顺序则与他们在反应途径中的顺序相反,菌株

关键词： 转基因作物   三文鱼   种植面积   农业部   美国   统计局  

摘要： 在美国，转基因作物最早问世于1996年，随后迅速被广泛接受。2013年，从种植面积来看，美国至少95％的甜菜，93％的大豆，90％的棉花和玉米均为转基因品种，这一数据来自美国农业部国家农业统计局。

关键词： 寨卡病毒   NS2B-NS3蛋白酶复合物   基因工程   原核表达   酶活性  

摘要： 目的:本研究利用基因工程技术构建重组蛋白的原核表达体系并建立重组蛋白的纯化工艺,表达寨卡病毒（ZIKA Virus,ZIKV）的非结构蛋白NS2B的膜结合区域（NS2BH）和NS3具有蛋白酶活性的区域（NS3pro）,对表达的重组蛋白进行纯化,并检测其酶活性,为进一步研究NS2B-NS3蛋白酶复合物抑制剂打下基础。方法:1.采用重叠PCR技术合成NS2BH和NS3pro基因序列,并引入Gly4-Thr-Gly4（G4TG4）氨基酸连接臂的序列,最终构建出NS2BH-G4TG4-NS3pro靶序列;2.用原核表达载体pET-28b（+）和靶序列构建目的蛋白表达载体pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro,转化***5a,获得高拷贝的重组质粒。提取重组质粒的DNA,并对其进行序列分析。将经过DNA序列分析的重组质粒转化*** BL21,采用菌落PCR技术进行鉴定。用IPTG诱导菌落PCR阳性的重组质粒表达目的蛋白。运用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组蛋白;3.使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry MALDI-TOF MS）技术,对重组蛋白酶复合物NS2BH-G4TG4-NS3pro进行鉴定;4.采用荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术分析蛋白酶复合物NS2BH-G4TG4-NS3pro的活性。结果:1.成功的利用重叠PCR技术合成了 NS2BH-G4TG4-NS3pro靶序列。构建出了pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro原核表达载体。测序的结果显示,目的序列和GenBank数据库中的ZIKV标准毒株（MR766,GenBank ***012532）的参考序列完全相同;2.重组工程菌经过IPTG的诱导,实现了 NS2BH-G4TG4-NS3pro可溶性表达。重组蛋白经镍柱亲和层析技术纯化后,最终获得了预期分子量且高纯度的可溶性蛋白;***-T0FMS的结果证明,本研究诱导表达的蛋白为NS2BH-G4TG4-NS3pro。***分析结果显示,本研究的重组蛋白可催化底物Bz-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC产生较强的荧光,即NS2BH-G4TG4-NS3pro有较强蛋白酶活性。结论:以重叠PCR技术合成靶序列,运用基因工程技术可实现ZIKV的NS2BH-NS3蛋白酶复合物可溶性表达,表达产物具有较强的酶活性。为未来进行ZIKV的NS2B-NS3蛋白酶复合物适配体抑制剂的研究创造了有利的条件。

关键词： Nanog基因   胚胎干细胞   功能  

摘要： Nanog基因是2003年发现的与胚胎干细胞更新有关的转录因子,在胚胎干细胞更新过程中具有重要的作用。详细地介绍了Nanog基因的分子结构特征,功能及其表达特点。在相关研究的基础上,进一步阐述了Nanog基因在胚胎干细胞自我更新中的作用机制及它与肿瘤发生的关系,具有一定的理论意义。

关键词： 氯霉素   单链抗体   重组表达   直接竞争酶联免疫分析  

摘要： 各类兽药的大量使用,虽然提高了动物性食品的产量,但是也对人类健康造成了潜在威胁。同时兽药残留问题也影响着我国动物性食品的出口贸易。免疫分析方法是目前兽药残留检测使用较多的方法。抗体作为免疫分析的核心试剂,其稳定性是影响免疫检测分析结果的关键因素。本论文利用分子生物学技术获得了氯霉素的基因工程抗体,并利用这一抗体建立了免疫检测方法,为氯霉素的检测提供了一种有效、稳定的检测技术。从分泌氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株10A3B6E中提取总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA为模板,利用兼并引物进行PCR扩增,获得抗体基因的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),将其连接到pMD18-T载体后进行大规模测序。同时,利用木瓜蛋白酶对单克隆抗体进行水解获得Fab,SDS-PAGE电泳后,对Fab中的轻链和重链分别进行Orbitrap质谱分析,获得其中的氨基酸片段。将可变区测序结果与质谱鉴定结果进行比对分析,获得了氯霉素特异性抗体可变区序列,重链可变区和轻链可变区的长度分别为341 bp和324 bp。利用重叠延伸PCR将重链可变区、轻链可变区及连接片段进行连接,获得了 711 bp的单链抗体(scFv)基因片段。将该片段用内切酶SfiⅠ和NotⅠ进行酶切,并与经过相同酶切的表达载体pLIP6/GN进行连接,转化BL21(DE3)后,对scFv进行重组表达。在25℃,180rpm振荡培养条件下,利用0.1 mmol/L IPTG对表达菌株诱导10-14小时,成功获得出可溶性的抗氯霉素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CAP scFv-AP)。利用Ni2+-NTA亲和层析柱对CAP scFv-AP进行分离纯化。利用纯化后的蛋白,通过对免疫分析条件的优化,建立了一种简便、快捷、实用的氯霉素直接竞争ELISA检测方法。优化后的检测条件为:包被原包被量0.1μg/孔;封闭液1%脱脂乳粉;样品稀释液0.02 mol/LTBS(pH 5.7)。在最佳条件下,该检测方法的检测灵敏度(IC50)与检测限(IC15)分别为6.92:±0.24 ng/mL和1.11±0.05ng/mL。选择3种氯霉素结构类似物和2种兽药进行特异性分析,结果显示该检测方法对氯霉素琥珀酸钠、氟甲砜霉素、甲砜霉素、四环素、链霉素的交叉反应率分别为42.34%、0.37%、0.22%、0.22%和0.12%,说明所建立的检测方法具有较好的特异性。选择对虾和鳕鱼作为实际样品,分别向其添加10、30、100 ng/g氯霉素,测得其回收率为72.53%-107.67%,变异系数小于10%,表明方法具有较好的精密度。本研究为氯霉素的大规模检测提供了一种有效的初筛技术,这对于保障动物源性食品安全具有重要的实际意义。

关键词： 植物研究   基因工程  

摘要： 《植物研究》1959年创刊,是由东北林业大学主办,科学出版社出版的植物学专业刊物,是国内外公开发行的学术期刊。2006年变更为双月刊。后成为以植物分类、基因工程、植被生态、数量遗传学等为核心的多学科综合性学术期刊。其刊载内容为植物新种、分子生物学、基因工程、植物细胞学、植物化学、植物遗传学、植物生理学、群落生态学等基础理论研究方面具有创新性或较高学术水平的原始性论文。现为中文核心期刊、中国科技核心期刊、RCCSE

关键词： 胚胎干细胞   microRNA   自我更新   分化   单倍体胚胎干细胞   纯合突变体文库  

摘要： 论文中包含两部分的工作。第一部分工作：miR23a～27a～24在胚胎干细胞分化中的功能研究了解胚胎干细胞（Embryonic stem cell, ESC）维持自我更新及多向分化潜能的具体机制,对于人们未来更好的将其应用于再生医学非常重要。过去几十年已经对ESC中转录因子和信号通路层面上的调控机制开展了较全面的研究,也勾画出ESC维持其特征的具体整体框架。除了各种转录因子相互协调形成网络调控外,人们也逐渐认识到表观遗传修饰,如组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码RNA等,也可以协同转录调节因子来共同维持ESC状态基因的表达。其中microRNA在ESC自我更新及分化中发挥了重要的功能,在ESC中将Dicer和DGCR8敲除均显示ESC分化存在缺陷,说明microRNA在胚胎干细胞的自我维持尤其是分化中具有非常关键的作用。人们对于促进ESC自我更新和多潜能性,提高iPS细胞重编程效率的microRNA研究较多。但是,对于抑制ESC自我更新,促进分化的microRNA则研究较少。本课题组在前期的研究工作发现位于小鼠8号染色体上的miR-23a～27a～24-2基因簇（miR-23a基因簇）的两个成员miR-27a和miR-24在分化细胞和组织中呈现不同程度的高表达,通过靶基因Oct4、 Foxo1、 gp130、 Smad3、 Smad4实现对ESC自我更新的抑制,并能够促ESC多胚层分化,抑制二者的表达能显著提高三因子介导的iPS细胞形成的效率,同时有促进胚层特异性分化的相关报道。考虑到上述工作很多是在特定修饰的细胞系或者体外开展,对miR-27a和miR-24-2在ESC分化中是否不可或缺这一问题不能全面回答,miR-23基因家族除了miR-23a基因簇外,还包含有位于13号染色体上的miR-23b～27b～24-1基因簇（简称miR-23b基因簇）,这两个基因簇共编码5个microRNA:miR-23a,23b,27a,27b,24。 miR-23b基因簇上三个成员miR-23b,27b,24-1的种子序列与miR-23a基因簇中的三个成员完全相同,因此它们可能具有相同的靶基因及相应的功能,在功能上有代偿作用。因此,我们使用CRISPR/Cas9技术在V6.5细胞系中分别获得miR-23a和23b双基因簇纯合敲除（DKO）和miR-23a基因簇纯合敲除（KO）细胞系,而这是第一次由CRISPR/Cas9技术实现双microRNA基因簇的纯合敲除。而后,我们将获得DKO和KO ESC系通过EB形成实验、ES细胞向中内胚层定向诱导实验和畸胎瘤形成实验确定上述miR-23a/b基因簇敲除ESC系的分化能力。在EB形成实验中,DKO细胞显示导致中胚层分化缺陷而促进其它胚层的分化,提示miR-23-27-24基因簇参与ESC自我更新的抑制和早期中胚层的形成;在心肌分化实验中,DKO ESC 在任意天数都未观察到博动性cEBs,心肌特异标志物Nkx2.5、 Tbx5、a-MHC、 b-MHC和cTnT等的表达量明显降低。免疫荧光试验显示没有明显的肌原纤维形态,三个心肌标志物Actinin、 ANP和Troponin1的表达量也非常低,提示miR-23～miR-27～miR-24基因簇在心肌细胞分化中起着非常重要的作用;同过畸胎瘤体积大小和重量检测显示DKO ESC成瘤能力小于KO和野生型ESC,通过HE染色,DKO ESC来源的畸胎瘤中可以观察到外、内胚层的结构,而几乎没有中胚层的结构,并且存在大量未分化或低分化的区域;通过ESC的标志物Oct4进行免疫组化检测,发现DKO ESC来源的畸胎瘤中存在大片Oct4染色阳性区域,而野生型ESC来源的畸胎瘤中则几乎没有,KO ESC来源的畸胎瘤介于两者之间。第二部分工作：单倍体胚胎干细胞突变体文库的建立和应用研究表明转录因子Oct4与Sox2是维持多能性所必须的,它们与其它一些转录因子共同组成了一个调控网络来建立及维持ESC的多能性。当这一调控网络被破坏时,ESC将退出多能性（Exit from Pluripotency）走向分化,但是,对于这一过程的机制,还有很多疑问有待人们研究,目前在国际上已经有几个研究团队利用正向遗传学筛选（Forward Genetics）方法获得了与调控ESC退出多能性相关的候选基因。但这些研究都有自身的局限性,另外,将这些遗传筛选的结果放在一起分析会发现相互间的重复性很差,只有少数几个基因（如Tcf3）在不同研究中都被筛选出来,这也从侧面说明上述研究还远没有全面揭示ESC退出多能性进入分化状态的相关因子及其作用机制。由于多数基因的性状为隐性的,只有两个等位基因都发生突变时,性状的变化才显现出来,因此获得基因组范围的纯合突变细胞文库是进行正向遗传筛选研究必要条件。ha

关键词： 基因工程   字母表   遗传信息   遗传缺陷   新技术   基因组   阅读   物种   书写   能力   困扰   父母   订单  

摘要： 书写基因组要用到的字母表只包含四个字母.人类掌握阅读、研究和对比自身及数以千计其他物种的DNA序列的能力已变为寻常事.一项新技术有望让迅速、廉价地编辑遗传信息成真.这可以修正困扰生活的可怕的遗传缺陷.它也预示着在遥远的未来,父母或许能按照订单创造孩子.