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关键词： 细长聚球藻   木糖醇   木糖醇磷酸脱氢酶   磷酸酶  

摘要： 木糖醇是一种良好的甜味剂,在食品、医药和化工等领域得到广泛的应用。木糖醇的化学法合成不仅存在工艺复杂、酸碱消耗大、原料来源受限等缺点,而且对设备要求高、生产成本高,对环境污染严重。生物法合成工艺简单易操作、低能耗、环保,用生物法来生产木糖醇已经成为一种发展趋势。在21世纪,随着合成生物学和代谢工程的不断发展,利用微生物代谢生产木糖醇的方法已经得到了广泛地开发和利用。然而,受微生物自身和一些外在条件的影响,譬如微生物中NADPH代谢积累能力差,添加的前体物质或原料昂贵等。因此,尽管生物法合成木糖醇在过去的十年中取得了飞速的发展,但是经济可持续的生物法生产木糖醇仍然面临着巨大的挑战。鉴于此,本论文通过在蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942中构建产木糖醇新路径来实现木糖醇的生产。我们将木糖醇合成途径中涉及到的基因导入到蓝藻*** PCC7942中构建了一个产木糖醇的光合平台,直接利用CO和太阳能来生产木糖醇。首先我们将木糖醇脱氢酶基因(xdh)和磷酸酶基因(pho13)转入到*** PCC7942中,构建重组菌SPSX和TF,未检测到目的产物;随后又将木糖醇磷酸脱氢酶的编码基因(xpdh)导入到*** PCC7942中,在蓝藻中构建戊糖磷酸延伸途径,构建的重组菌PX在连续通气的条件下培养,16天后产25.5 mg/L的木糖醇;最后,对戊糖磷酸延伸途径进行了优化,将木糖醇磷酸脱氢酶的编码基因和磷酸酶的编码基因(phoA)共同导入到*** PCC7942,构建重组菌PXP在连续通气的条件下,培养16天后产16.94mg/L的木糖醇,优化后的菌株产量没有提高。这是首次在蓝藻中实现利用CO和太阳能来直接合成木糖醇,使得环境友好、低成本的可持续生产木糖醇的策略得以实现。基于木糖醇有较高的食用价值和经济价值,本研究可能会推动一个新的光合反应器的出现,利于木糖醇生产行业的发展,也使得在蓝藻中生产其他高值化合物和大宗化学品成为可能。

关键词： 炭疽病   致死毒素   保护性抗原   全分子抗体   中和抗体  

摘要： 炭疽病(anthrax)是一种由炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)引起的人畜共患的急性传染病,可以通过皮肤、呼吸道和消化道等途径感染动物和人[1]。人患该病主要是因接触病畜及其产品或是食用感染的牲畜肉类而发生感染。炭疽杆菌具有高度致病性,其芽孢在恶劣环境中生存能力强而且容易传播,因此长期以来芽孢杆菌一直作为细菌战剂用于制造生物武器,且用做生物恐怖袭击[2-3]。在我国传染病中炭疽病为甲类传染病,其在发病早期,没有特异的临床症状,往往诊断报告出来时,已经错过使用青霉素治疗的最佳时机。因为青霉素只可杀死炭疽杆菌,而对炭疽杆菌释放的外毒素没有任何作用[4-5]。炭疽杆菌进入血液后可以释放三种蛋白,分别为保护性抗原(protective antigen,PA)、致死因子(lethal factor,LF)和水肿因子(edema factor,EF)。这三种蛋白单独存在时没有任何毒性,而一旦PA和LF结合则形成致死毒素(lethal toxin,LeTx),PA 和 EF 结合则形成水肿毒素(edema toxin,EdTx)[6-9]。也就是只有当保护性抗原与细胞表面炭疽毒素受体结合后,在细胞表面形成一个七聚体通道,才能介导LF或/和EF发挥作用。同时PA是炭疽杆菌最主要的免疫原,它能够诱导机体发生保护性免疫[10]。因而针对炭疽芽孢杆菌PA的抗体研究成为治疗炭疽病的研究热点。保护性抗原PA与细胞表面结合后又会通过弗林蛋白酶裂解掉20kDa大小的蛋白,剩下63kDa大小的蛋白(PA63)与细胞表面结合,所以保护性抗原PA的核心部分为PA63[6]。本实验是以PA63为靶点,用PA63免疫小鼠,制备中和性鼠源单克隆抗体,通过基因工程技术将鼠源抗体改造成人鼠嵌合抗体;同时通过噬菌体抗体库技术用PA63筛选人源Fab噬菌体抗体库,将筛选的抗PA63的中和性Fab抗体经基因工程技术改造成全分子IgG抗体。接着评价制备的中和性基因工程抗体在体外及体内对致死毒素的中和作用,并初步分析抗体保护作用机制及中和表位,本课题包括以下四个部分。一、PA63、PA及LF的表达和纯化本部分首先构建在原核表达系统中表达PA63的表达质粒,经核酸胶及基因测序证明成功构建PA63的原核表达质粒。将质粒转进大肠杆菌中表达,实验证明有63kDa的蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白形式表达,用Western Blot证实用商业化PA多克隆抗体(Pierce公司)以及HIS抗体均可以检测到63kDa大小的蛋白。继而优化蛋白的表达条件,比较诱导时间及诱导温度对蛋白表达的影响,实验表明在37℃下诱导表达4h为最佳表达条件。其次构建在外分泌表达系统中表达PA及LF的表达质粒,从炭疽人用疫苗株中提取目的PA及LF基因,基因测序证明获取正确目的基因。将目的PA及LF基因分别插入外分泌表达系统中,并将表达系统中的启动子替换为PA启动子,基因测序构建的质粒正确。接着将质粒分别转染炭疽减毒杆菌中表达PA及LF蛋白,Western Blot实验证实,用PA及LF商业化兔多克隆抗体(Pierce公司)分别可以检测到炭疽减毒株分泌表达的83kDa大小的蛋白及90kDa大小的蛋白。接着细胞实验证实,PA及LF蛋白在浓度为0.01 μg/ml时就可以是使小鼠巨噬细胞J774A.1存活率降低至50%,在LF浓度达到10 μg/ml时,细胞存活率降至20%以下。Fischer344大鼠实验证实PA及LF蛋白的用量达到30μg/只时可以时大鼠在90min左右死亡。以上实验证实首先我们成功制备了 PA63、PA及LF蛋白,其次验证制备的PA及LF蛋白具有很好的生物学活性。PA63的制备为中和性抗PA63基因工程抗体的制备奠定基础;有生物学活性的PA及LF的制备为后续验证中和性基因工程抗体的保护作用提供了条件。二、抗PA63中和性基因工程抗体的制备、表达及鉴定1.抗PA63人鼠嵌合中和性基因工程抗体的制备、表达及鉴定本阶段研究首先用之前制备的PA63免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备鼠源单克隆抗体,经检测有四株鼠源单抗分别命名为PA5、PA6、PA7、PA8具有较好的中和活性,在毒素剂量达到10 μg/ml时,抗体浓度在20μg/ml,PA5和PA6可以使细胞存活率达到95%以上,PA7和PA8可以使细胞存活率达到80%以上。最后选择PA6这株抗体,通过基因工程技术构建抗体真核表达的质粒,优化表达条件将质粒和转染试剂以1μg:1μl的比例转染293F细胞,6天后收集细胞上清,用Pro.A亲和株纯化上清,获得人鼠嵌合抗体,命名为hmPA6。改造后的基因工程抗体hmPA6经免疫共沉淀检测验证其仍然可以识别PA63。ELISA检测显示hmPA6与抗原成剂量效应关系,用Biacore检测抗体与抗原的亲和力,结果

关键词： 人工合成   酵母菌   染色体   HGP   文特尔   细胞核   DNA   人类基因组计划   基因组测序   合成人  

摘要： 1990年在美国科学家主导下,人类基因组计划(HGP)启动,中国研究人员参与其中1%的任务,该计划到2003年基本结束,重点是对人的基因组测序,也就是让人能够"阅读"人类自身的基因组。今天,这种基因组测序也扩到多种生物,让人能对更多的动植物的基因组进行测序和阅读。现在,美国一些研究人员提出了更为雄心勃勃的计划——编写和合成人的基因

关键词： 新橙皮苷   橙皮苷   鼠李糖基转移酶   基因克隆   酶学性质   分离纯化  

摘要： 新橙皮苷在植物内的含量较低,其同分异构体橙皮苷在植物体内含量较高。两者的结构上的差异仅仅是黄酮环上取代基上葡萄糖与鼠李糖的糖苷键不同。本研究希望利用生物转化法将橙皮苷转化为新橙皮苷。本文通过构建一株原核工程菌来表达鼠李糖基转移酶,该酶可以催化鼠李糖与葡萄糖通过1,2糖苷键连接,以此来合成新橙皮苷,并且对其酶学性质进行研究,还对工程菌的产酶发酵条件进行了优化研究。主要的研究内容及结果如下:1.原核工程菌的构建及表达:从Lactobacillus plantarum WCFS1的基因组中扩增得到编码鼠李糖基转移酶的glycosyltransferase(rhamnosyltransferase),family 2(GT2)基因,将该目的基因与表达载体pET-DsbA连接,得到重组表达载体pET-DsbA-GT2。将表达载体导入表达菌株BL21(DE3),成功构建得到了原核表达工程菌BL21(pET-DsbA-GT2);采用诱导剂IPTG对工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)进行诱导表达,GT2与DsbA成功的融合表达,得到了56.7 kDa左右大小的融合蛋白(其中,GT2的大小为35.7 kDa,DsbA的大小为21 kDa)。表达方式为部分包涵体、部分可溶性表达。2.鼠李糖基转移酶的分离纯化及其酶学性质的研究:通过分离纯化分别得到了包涵体蛋白酶(GT2-1)、可溶性蛋白酶(GT2-2)两种鼠李糖基转移酶。酶活测定结果显示GT2-1的比活力为0.41 U/mg,远低于可溶性目的蛋白GT2-2的1.92 U/mg。酶学性质的研究结果:GT2-1、GT2-2两种酶的最适反应温度38-40℃,最适pH值为6.0-6.5;GT2-1、GT2-2在20-40℃处理1 h后的酶活仍能达到90%以上,当温度超过40℃时,GT2-1的酶活随着温度的升高迅速降低,当温度达到70℃时便完全失去酶活,GT2-2温度达到80℃才完全失去酶活;GT2-1、GT2-2在pH值在5-10这个范围内均具有较好的稳定性。3.重组菌BL21(pET-DsbA-GT2)表达条件的优化:以表达系数F和表达量Q为表征量,对BL21(pET-DsbA-GT2)重组菌的表达条件进行了优化。最后得到的最优表达条件为:诱导时机选择为培养10-12 h后进行诱导;诱导时间为5-6h;诱导温度为30℃;诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL;摇床转速为160 rpm。

关键词： miRNA   干细胞   胚胎干细胞   造血干细胞  

摘要： miRNA属于内源性的非编码RNA家族，在基因调节中发挥重要的作用。胚胎干细胞中特异性的miRNAs可能是胚胎干细胞的重要标志物之一，在干细胞的自我更新和分化过程中发挥重要的调控作用。本文就miRNAs对胚胎干细胞、造血干细胞的调控作一简单综述。

关键词： 作物转基因   种子产业   技术演化   竞争态势   有序聚类分析  

摘要： 作物转基因技术是目前现代生物技术中发展最为迅速、影响最为广泛的核心技术,发达国家投入巨资进行相关技术的研究和应用,目的在于抢占生物技术的制高点,强化生物以及相关领域的国际竞争力。中国作为发展中大国,尽管技术和产业发展水平与发达国家相比还有相当的距离,但是种种迹象表明,缩短差距是我们相当长一段时间追求的目标。而实现缩小差距的一个重要环节就是,从技术发展这一根本上知己知彼,有的放矢地进行研究和开发,才能在技术和产业发展上取得突破。因此,论文以德温特专利库中作物转基因技术为数据集,通过定性与定量相结合的研究方法,从专利知识的主体和客体的视角,对于转基因技术的技术演化和竞争态势进行了分析,为我国的作物转基因技术及产业发展提供较为全面的知识服务,为相关企业及政府相关部门决策提供参考。论文主要的研究成果如下：(1)从技术内容的角度,通过有序聚类,将具有内在关联的技术依据时间序列进行阶段划分,得到作物转基因技术发展的四个阶段,分别是萌芽期、成长期、高峰期、稳定期。同时,通过对于技术内容的分析,揭示了每一个阶段的研究热点。同时,通过时间序列,分析作物转基因技术的总体进展。以及从高被引文献的技术领域,总结出了作物转基因技术的核心领域。(2)从专利机构的角度,根据其发明专利的内容,构建机构技术特征向量,利用专利相似性进行聚类,得到具有竞争关系的类别,揭示出1983家企业间存在五个梯队的竞争态势。(3)以德温特手工分类代码为依据,通过专利统计分析,揭示了杜邦、孟山都、基因泰克、拜耳、巴斯夫和先正达这6家领先企业的技术特色以及中美日三国的技术特色,分析了其各自的研发实力。

关键词： 番茄红素   耶氏解脂酵母   基因工程   发酵  

摘要： 番茄红素是一种天然类胡萝卜素,具有多种生理功能,在食品、药品等领域有着重要的应用价值,利用合成生物学技术构建基因工程菌发酵生产番茄红素是目前的一个研究热点。耶氏解脂酵母由于其卓越的脂质合成和积累能力,在脂类物质生产方面具有很好的应用潜力。本文的研究目的是构建生产番茄红素的耶氏解脂酵母工程菌。首先,构建含有番茄红素合成途径关键基因crtB(编码八氢番茄红素合成酶,催化两分子牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸缩合生成八氢番茄红素)、crtI(编码八氢番茄红素去饱和酶,催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素)、GGS1(编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶,催化法尼基焦磷酸和异戊二烯焦磷酸缩合生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)的质粒pBIGgut2、pBIGInt F,这两个质粒能够把外源基因整合于耶氏解脂酵母染色体GUT2(位于B染色体,编码甘油三磷酸脱氢酶,催化甘油醛-3-磷酸转化为二羟基丙酮磷酸)和IntF(位于F染色体,目前尚未发现有任何基因功能)位点。然后,通过LiAc转化方法将线性化质粒pBIGgut2导入耶氏解脂酵母20362(Hmg)感受态细胞,利用MM(基本培养基)平板筛选重组子,得到9个阳性转化子,进行摇瓶发酵培养,其中LY3001-1在摇瓶中番茄红素发酵产量最高,为49mg/L。最后,初步研究了LY3001-1菌种在5L发酵罐上发酵的代谢规律。通过补料培养,番茄红素发酵48h的产量达到492.5mg/L。

关键词： 胚胎干细胞   诱导多能干细胞   分化   多能性基因   实时定量PCR  

摘要： 目的:观察人类诱导多能干细胞在体外的培养情况与生物学特性,并检测其相关多能性基因的表达水平,为后期定向诱导人类诱导多能干细胞向表皮样干细胞分化奠定实验基础,也为其能够成为组织工程种子细胞新来源提供了可能性。方法:将人类诱导多能干细胞接种在经过辐照处理的CF-01小鼠的胚胎成纤维细胞(feeder细胞)上,加入人类胚胎干细胞完全培养基(含bFGF)培养细胞。将此时的人类诱导多能干细胞分为A1和A2两组,A1组细胞直接进行碱性磷酸酶染色检测,并使用TRIzon裂解液裂解细胞,提取该组细胞的总RNA,进行实时定量PCR检测其相关多能性基因的表达水平;A2组细胞则采用Ⅳ型胶原酶消化法传代,倒置相差显微镜下观察诱导多能干细胞传代后的生长情况和细胞形态。传代至第15代时,A2组细胞同样进行碱性磷酸酶染色检测和实时定量PCR检测相关多能性基因的表达水平。结果:本实验中培养的人类诱导多能干细胞生长情况良好,表现出经典的干细胞克隆样生长,边界清晰,增殖旺盛;A1和A2两组细胞在碱性磷酸酶染色检测中均呈现阳性表现;A1和A2两组细胞进行实时定量PCR检测相关多能性基因结果显示:A1和A2两组中4种基因的相对表达量没有明显差异,无统计学意义(P〉0.05)。结论:本实验中培养的人类诱导多能干细胞可以稳定生长并旺盛增殖,在生物学特性方面也同人类胚胎干细胞相类似。随着人类诱导多能干细胞传递代数的增加,它所表达的相关多能性基因的水平仍与最初的人类诱导多能干细胞的表达水平相接近,并不会因此而出现下调。这为后期本课题组进一步诱导人类诱导多能干细胞定向分化为表皮样干细胞提供了实验基础,也表明了人类诱导多能干细胞作为种子细胞新来源的潜力。

关键词： 组织工程皮肤   种子细胞   人胚胎干细胞   成纤维细胞  

摘要： 皮肤对维持人体内环境稳定以及保护人体免受外部环境干扰具有重要的作用。然而,创伤、溃疡等引起的皮肤缺损,会给患者的生活造成影响。目前,临床上的治疗,一般使用皮肤移植,但是该方法需要开辟第二术区、给患者带来额外的痛苦,并且无法适用于大面积皮肤缺损的治疗。组织工程皮肤(Tissue-engineered skin, TES)的发展为皮肤缺损的治疗带来了希望,在TES的研究中,种子细胞的来源是关键的问题之一。本文重点研究了将人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells, hESCs)定向诱导为成纤维细胞,并以此为种子细胞构建TES。本研究首先检测了hESCs的增殖能力、全能性及其未分化状态,并通过将hESCs注射到裸鼠皮下,8周左右观察到有畸胎瘤的形成;将hESCs悬浮培养获得的拟胚体(Embryoid bodies, EBs)再贴壁培养,可以观察到有肌样、上皮样以及纤维样的细胞,证明了hESCs的体内外分化的能力。进一步使hESCs自主分化,刮取细胞克隆周围纤维状的细胞,经过多次传代培养后,获得来源于人胚胎干细胞的类间充质干细胞(Human embryonic stem cells derived mesenchymal stem cells, hE-MSCs),流式细胞术和三系分化检测结果证实了hE-MSCs具有间充质干细胞的特征。然后通过添加结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)将hE-MSCs诱导为类成纤维细胞(Human embryonic stem cells derived fibroblasts, h-Fbs),实时定量PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)和ELISA方法分别检测诱导后细胞中成纤维细胞相关因子的基因和蛋白的表达情况,结果表明h-Fbs具有成纤维细胞的基本特征。最后,将h-Fbs复合到鼠尾胶原中构建TES,以裸鼠为实验模型,在其背部进行皮肤缺损修复实验,结果表明,20 d左右时,皮肤缺损修复即可完成,并且修复效果与以人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts, HSF)为种子细胞所构建的TES之间没有显著差别。综上所述,本研究首先将1hESCs自主分化为hE-MSCs;然后添加CTGF,将hE-MSCs成功诱导成为h-Fbs;最后以h-Fbs为种子细胞构建TES,并在皮肤缺损修复实验中取得了良好的修复效果。

关键词： 胚胎干细胞   细胞治疗   去分化  

摘要： 干细胞应用潜力巨大在最近的60余年时间里,干细胞领域涌现出许多革命性的发现,也吸引了一代又一代科学家加入其中,它之所以如此重要以及被广泛地研究,部分是因为其巨大的疾病治疗潜力。如果干细胞应用于体外培养重建组织器官的目标得以实现,可就以解决器官移植的难题,并且可成为癌症治疗的手段之一,但这项工作目前主要在理论研究过程中。日