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关键词： 兔   胚胎干细胞   诱导性多潜能干细胞   多能性   褪黑素  

摘要： 多能性干细胞对畜牧业发展和医学研究具有重要意义。兔作为传统的试验动物,被广泛地应用于转基因动物和人类疾病研究。兔的多能性干细胞—胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)和诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPSC)研究仍处于初级阶段,分离培养及鉴定方法还需要进一步探索。为完善兔多能性干细胞的研究方法,本试验分离培养了日本大耳白兔的类ESC,进行了多能性鉴定,同时初步探索了将兔胎儿成纤维细胞(Rabbit embryo fibroblast,REF)诱导为iPSC的方法。研究结果如下:1、分离得到了兔类ESC:使用FSH和h CG结合的方法对60只母兔进行超排,交配96 h后冲取胚胎,平均每只母兔可得38枚胚胎,囊胚率为79.96%。选用76%Knockout DMEM+20%KSR+1%谷氨酰胺+1%NEAA+1%β-巯基乙醇+1%青链霉素+10 ng/m L bFGF+1000 IU/m L hLIF作为兔类ESC基础培养液,并在基础培养液中添加不同浓度的褪黑素(10-6,10-7,10-8,10-9,0 M),探索褪黑素对兔囊胚、内细胞团(Inner cell mass,ICM)、ESC生长增殖的影响。试验结果表明,添加褪黑素对兔囊胚的贴壁率没有显著影响,5组囊胚贴壁率均在50%左右,但对ICM和类ESC的增殖、传代有促进作用,其中褪黑素浓度为10-7 M时作用最为显著。10-7 M的褪黑素可以显著提高ICM的增殖率(P<0.05),由19.97%提升到34.57%。对ICM进行机械传代,可以得到形态扁平,有清晰边缘的兔类ESC克隆。添加10-7 M褪黑素可以将兔类ESC的传代数由4代提高到6代,并且能够显著提高第4和第6代的传代率(P<0.05)。2、对P5代兔类ESC进行鉴定,试验结果表明,兔类ESC具有多能性:兔类ESC克隆碱性磷酸酶染色为阳性;RT-PCR可以检测到多能性基因Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog,Line28a的表达;qPCR检测结果表明,多能性基因Oct4,Sox2,Nanog的表达量明显高于兔胎儿成纤维细胞;免疫荧光染色结果表明,多能性标志蛋白OCT4,SOX2,NANOG为阳性,胚胎干细胞表面标记蛋白SSEA-1,SSEA-4和TRA-1-60,TRA-1-81为阳性,其中SSEA-4和TRA-1-60微弱表达;核型正常为2n=44;去除饲养层和多能性维持因子后,兔类ESC可自然分化为脂肪样细胞、神经样细胞、成纤维样细胞和跳动的心肌细胞;悬滴培养8 d后可以形成拟胚体,分化14和21 d后,qPCR和免疫荧光检测结果表明,组织特异性基因Bmp4,Afp,Desmin,Sox17,Pax6和组织特异性蛋白VIMENTIN,β-TUBULIN,AFP,ALB,DESMIN的表达量随分化时间延长而升高,说明兔类ESC可以向神经、成纤维、肝脏、肌肉等细胞分化。将第3代兔类ESC注射到NOD-SCID小鼠腹股沟皮下,8周后可以形成具有神经、肌肉、腺体等三胚层组织的畸胎瘤。3、探索了将兔胎儿成纤维细胞诱导为iPSC的方法:使用含有人源转录因子Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc的逆转录病毒载体感染原代兔胎儿成纤维细胞。感染后12-18天获得了3种类型的细胞克隆,形成率分别为0.01%,0.03%和0.06%。其中第2种克隆可以稳定传代。机械法传至第10代后外源基因不沉默,第10代克隆AP染色为阴性,表明没有获得兔iPS细胞系。

关键词： 人胚胎干细胞   冻存体系   视网膜色素上皮细胞   分化   Activin A  

摘要： 人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,h ESCs）是一类具有自我更新和在特定条件下可以分化得到三胚层的细胞群体,在基础科学研究中受到人们广泛的关注,而且具有潜在的临床应用价值。h ESCs分化得到的多种功能细胞是目前的研究热点,应用细胞疗法有望解决许多当前世界性的医学难题。hESCs冻存后复苏效率一直不高,这个问题制约着h ESCs的基础研究及临床转化。在冻存和复苏的过程中主要存在两方面损伤,包括机械损伤和溶质损伤,这两种损伤会破坏细胞器和细胞膜,进而引起细胞大量死亡。虽然有报道提到玻璃化冷冻法可以得到相对较高的冻存后复苏效率,但其操作技巧要求较高,仅适合保存种子细胞而难以在实践中大规模应用。本文基于常用的缓慢冻存和快速复苏的方法对h ESCs的冻存后复苏效率进行改进提高,为后期实验室的应用提供参考。眼睛是人类感知世界最重要的器官之一,眼部患病会给我们的生活带来极大的不便,而目前眼科疾病的常规治疗方法只能延缓视力下降的速度,最终仍会导致失明。眼科疾病发病率逐年升高,开发出新的治疗手段变得极为迫切。视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium,RPE）的损伤可以引起色素性视网膜炎（retinitis pigmentosa,RP）和老年性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）,由于其不能再生,可以通过后期注射细胞进行改善,这种细胞疗法目前已经在临床上进行试验,部分患者已经具有积极的效果。因此提高h ESCs向RPE的分化效率可以为以后临床需要提供更多的保障。

关键词： 胚胎干细胞   诱导分化   角膜缘干细胞   角膜缘干细胞缺乏   免疫原性  

摘要： 目的:诱导人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,h ESCs)向角膜上皮样细胞分化,观察分化细胞的生物学特性及其治疗角膜缘干细胞缺乏的效果,并探讨分化细胞的免疫原性及其移植后的免疫排斥反应。方法:通过小分子化合物诱导h ESCs向角膜上皮细胞分化,免疫荧光染色、PCR检测其上皮细胞标志物的表达,同时培养成体角膜缘上皮细胞(Limbal Epithelial Cells,LECs),以羊膜为载体制备重组角膜上皮细胞膜片。建立新西兰兔和食蟹猴的角膜缘干细胞缺乏模型,行重组角膜上皮细胞膜片移植,术后通过裂隙灯和印迹细胞学观察其治疗效果。通过全基因组芯片筛选h ESCs分化细胞和LECs差异表达的基因,流式细胞检测二者免疫相关分子的表达,体外T细胞增殖实验和NK细胞杀伤实验验证其免疫原性,同时在体外模拟炎症微环境观察对细胞免疫原性的影响,重组角膜上皮细胞膜片移植后观察免疫排斥反应,并用免疫荧光染色观察免疫细胞。结果:h ESCs分化细胞的细胞形态与角膜缘干细胞相似,并表达角膜缘干细胞和角膜上皮细胞的标记物,其多能性标志物为阴性,并能在去上皮羊膜上形成复层的细胞结构,重组角膜上皮细胞膜片移植到角膜缘干细胞缺乏的新西兰兔和食蟹猴体内后,能够显著改善眼表情况并长时间保持稳定。相比于LECs,h ESCs分化细胞中免疫相关基因的表达显著下调,其MHC分子低表达,在体外不易引起T细胞增殖也不易被NK细胞杀伤,并且这些特性不受炎症微环境的影响,h ESCs分化细胞移植到体内后未见明显的免疫排斥反应,且移植后免疫细胞的浸润也较少。结论:通过小分子化合物诱导的方法可以成功将胚胎干细胞分化为具有一定增殖能力的角膜上皮样细胞,该细胞体内移植后能够有效治疗角膜缘干细胞缺乏,并且其免疫原性较小,不易引起免疫排斥反应。

关键词： 基因工程多肽   纳米水凝胶   杂化纳米水凝胶   生物成像   靶向药物输送   光热治疗  

摘要： 治疗诊断学是一种将治疗学与诊断学结合起来的一种治疗策略。近年来,由于具有很高的药物装载效率和可控释放等优点,纳米水凝胶用于同时装载治疗药物和诊断试剂的载体而备受关注。特别是具有较高生物相容性和性质可调谐的基因工程多肽形成的纳米水凝胶颗粒。此外,无机纳米材料具有易于制备、稳定和独特的电学、光学和机械强度等特性而被广泛应用于生物成像、药物的转运及肿瘤的治疗中。基于此,本论文主要研究基于基因工程多肽和无机纳米材料的杂化纳米水凝胶颗粒的制备及研究其在生物医学中的应用。论文完成的工作如下：(1)设计和合成了一种新型的多功能QDs-多肽纳米水凝胶颗粒用于肿瘤的靶向成像和药物输送。杂化纳米水凝胶颗粒是将一种含有一个寡聚基蛋白P片段、一个拉链结构的片段A和一段水溶性的无序结构C10的卷曲人工多肽(PC1A或PC10ARGD)通过其N端的六个组氨酸和CdSe/ZnS QDs表面的锌离子通过配位结合制备。杂化纳米水凝胶颗粒表面的人工多肽PC1A具有刚性结构,从而形成一种含有两层憎水性层(分别由P和A组成)和中间是一层亲水性C10层的“三明治”结构的杂化纳米颗粒。通过CE和动态光散射测量粒径及电位结果证明了QDs-PC10A和QDs-PC10ARGD杂化纳米水凝胶颗粒的“三明治”结构。我们能通过基因工程的方法构建不同结构的多肽来调节QDs-多肽杂化纳米水凝胶颗粒的物理特性,包括尺寸、形状、粘附区域和表面电位等。憎水性和亲水性的药物分别被装载在杂化纳米水凝胶颗粒的憎水层和亲水层内。QDs-多肽杂化纳米水凝胶颗粒能够作为一种同时应用于装载憎水性和亲水性药物的通用载体。QDs表面修饰的具有温度和pH敏感的多肽能够作为温度和pH控制释放杂化纳米水凝胶颗粒内装载的憎水性药物。QDs-PC10ARGD纳米水凝胶颗粒在αwβ3整合素受体过表达细胞的内吞要比αvβ3整合素受体低表达的细胞要高很多。QDs-PC10A比谷胱甘肽修饰的QDs对细胞具有较低的非特异性结合。相比于原始QDs,QDs-多肽纳米水凝胶颗粒对HeLa细胞和NIH 3T3细胞的细胞毒性小很多。此外,靶向性的QDs-多肽纳米水凝胶颗粒对NIH 3T3正常细胞比HeLa癌细胞的细胞毒性要低。这些结果表明QDs-多肽杂化纳米水凝胶体系将可能为靶向成像和药物输送提供一种新的方式和方法。(2)设计和构建了一种新颖的基于基因工程多肽修饰的金纳米棒用于近红外光控制释放其上修饰的生物活性配体和光热治疗联合疗法。生物活性配体能通过基因工程的方法被融合到一个具有亮氨酸拉链结构的多肽A的C端。含有生物活体配体的多肽通过N端引入的一个半胱氨酸上的巯基和金形成金-硫键固定到金纳米棒表面。修饰了含有生物活性配体的多肽A的金纳米棒能够通过互补的亮氨酸拉链结构进一步和含有亮氨酸拉链结构的B-聚乙二醇(B-PEG)结合。多肽A上的活性配体能够被B-PEG上的PEG遮蔽。这种设计的优点是A和B能形成异二聚体使生物活体配体和PEG能在分子水平上一一相对应被固定在金纳米棒上。当多功能的金纳米棒聚集到靶向癌细胞或肿瘤后,金纳米棒的光热效应产生的热传给共固定在金纳米棒上的B-PEG使其变性而被移除从而释放被遮蔽的生物活性配体用于癌症的治疗。此外,功能化的金纳米棒能同步体现光热治疗效果。研究结果表明,通过810 nm的近红外激光照射,遮蔽的B-PEG能够被移除从而释放被遮蔽的RGD活性配体,并且对HeLa细胞具有较好的体外光热治疗效果。因此,我们设计的基于多肽修饰的金纳米棒采用近红外光控制控释系统将可能在靶向生物分子的输送和光热治疗领域具有很大的潜力。(3)采用带正电荷的金纳米棒和带负电荷的三段式多肽PC10-ARGD通过静电吸附构建了一种新的杂化纳米水凝胶颗粒用于肿瘤的化疗-光热治疗。吸附在金纳米棒表面上的PC10-ARGD多肽通过自组装的形式形成水凝胶。PC10ARGD形成的水凝胶除了能增加生物相容性外,还能增加纳米颗粒的稳定性。化疗药物DOX能够被装载在复合纳米水凝胶颗粒的水凝胶层内。构建的杂化纳米水凝胶在水、PBS、无血清的DMEM和含血清的DMEM中均具有较好的稳定性。杂化纳米水凝胶仍然保持良好的光热效应。其中包被的DOX能在低pH值和高温下具有较快的释放速度和较大的释放量。相对于CTAB包裹的金纳米棒,金纳米棒-多肽杂化的纳米水凝胶颗粒对HeLa细胞表现出较小的细胞毒性。化疗和光热治疗实验表明装载了DOX的金纳米棒-多肽杂化纳米水凝胶颗粒具有较好的化疗和光热治疗效果,其化疗和光热治疗效果都同复合颗粒的浓度相关,并且化疗和光热治疗存在协同效应。我们设计的这种杂化纳米水凝胶颗粒将为肿瘤的治疗提供一种新的思路和方法。(4)三段式的PC10A和PC10ARGD多肽在低浓度下能形成纳米水凝胶颗粒。PC1oA和PC10RGD纳米水凝胶颗粒的尺

关键词： 植物抗旱基因工程   研究进展   分析  

摘要： 干旱是影响植物生长的重要诱因,在现代分子生物学的发展下,植物抗旱基因工程取得了突破性进展,其研究日益深入,本文主要针对近年来国内外关于植物抗旱基因工程的相关研究展开分析。

关键词： 聚球藻   光生物反应器   光质   VP28   絮凝   采收  

摘要： 对虾白斑综合症病毒(WSSV)于1992年首次在台湾发现,随后迅速蔓延至各大洲,对全世界的对虾养殖业造成严重的病害,经济损失超过70亿美元。国际上,尚不存在产业化的WSSV防治药物。研究发现,WSSV被膜中的特异性结构蛋白VP28在病毒侵染细胞过程中发挥关键作用,该蛋白经异源系统表达后,通过口服或注射接种,可提高对虾抗WSSV的能力。我们的研究也发现,转vp28基因工程蓝藻经对虾口服后攻毒,发现对虾在30天内能有效抵抗WSSV(成活率达70%-90%),表明已开发的工程聚球藻具有巨大的产业化前景。目前本实验室转vp28基因工程聚球藻口服剂的研制已进入实验准备阶段,其中工程聚球藻的规模培养及采收是其产业化的重要一环。我们在进行工程聚球藻规模培养中,认识到其产业化受3方面因素制约:1)目前规模培养设备及技术不成熟,生物量产量较低;2)重组蛋白表达率尚有提高的潜力;3)缺少安全快速高效的采收技术。为解决上述问题,本论文特从以下3方面进行系统研究:1.光照强度对工程聚球藻生物量的调控为提高转vp28基因工程聚球藻的生物量产量,光照强度(I)的调控依据2个因素:1)I与p H、温度的交互作用;2)I在反应器中的衰减作用。为此,本论文首先通过单因素实验,确定了当净光合速率为极大值时,I、温度及p H的交互范围,分别为200-400μmol/m2s、28-48°C、6.5-8.5;并进一步通过响应面实验测定I、p H及温度的最优交互条件,即分别为300±10μmol/m2s、37°C、7.5,此时净光合速率达到最大值,342μmol O2/mg Chlah。按照优化温度(37°C)和pH(7.5),分别于2种反应器模型(5 L/108 W外置光源模型,100 L/120W内置光源模型)中培养工程聚球藻。5 L反应器中I在培养对数期可调至250-300μmol/m2s,3 d后生物量为1.5 g/L;100 L反应器中I在培养对数期可调至180-250μmol/m2s,7 d后生物量为0.4 g/L。对100 L反应器进行改造,将灯管功率由120 W提高至300 W,同时将光源分布由3组改为6组,培养至对数期时,反应器50%区域中I达到300±10μmol/m2s,并使对数期延长36 h,7 d后生物量达到0.8 g/L。可见,I是影响光生物反应器最终生物量的关键因素,提高I的功率能够显著增加生物量产量,使I均匀分布可显著延长生长对数期。2.光质对工程聚球藻重组蛋白VP28表达的影响通过改变光质可以调控工程聚球藻的生长及重组蛋白的表达。采用5 L/108 W外置光源反应器进行72 h培养,通过改变入射光中单色光的比例,检测培养过程中生物量的变化、psb A的转录、vp28的转录及VP28蛋白的相对积累量。研究发现:1)光质为50%白光、33.3%蓝光及16.7%红光时,最终vp28的表达率达到2.4%,是100%白光下的3倍;重组蛋白VP28的相对积累量提高至2倍;生物量的积累达到1.22 g/L;psb AII、psb AIII的转录得到促进。2)光质为50%白光、33.3%红光及16.7%蓝光时,最终vp28的表达率达到0.5%;10μg总蛋白中VP28的相对积累量只有高比例蓝光下的5%;psb AII及psb AIII基因的转录受到抑制,psb AI的转录得到促进;生物量积累达到1.68g/L。可见,光质可显著调控重组蛋白的表达,并对生物量产生一定影响。其中蓝光促进了重组蛋白的表达,抑制了生物量的积累,而红光与蓝光的作用相反。光质对质粒启动子的调控机制与宿主基因psb A的调控有关。3.工程聚球藻采收技术的研究为建立快速安全高效的采收技术,研究不溶性沉淀絮凝法的采收效率及安全性,主要包括3个方面:1)最适诱导剂及其剂量的确定;2)细胞悬浮液中胞外分泌物(AOM)的去除;3)絮凝后蛋白析出量控制。实验结果显示,1)在悬浮液中增加0.25 m M镁离子浓度,在p H 11条件下采收率达到90%以上。2)4000 rpm离心去除悬浮液中的AOM,采用新鲜培养液(0.3 m M镁离子)重悬,发现p H调至10.5时,采收率即达到95%以上。3)发现光质为50%白光、33.3%蓝光及16.7%红光时,悬浮液中AOM为2 mg/L以下。4)100%白光下,悬浮液AOM为4.5 mg/L左右。5)光质50%白光、33.3%红光及16.7%蓝光下,悬浮液中AOM为5 mg/L以上。6)在5°C、20°C及35°C水浴条件下,分别检测絮凝结束后上清液中的总蛋白含量,30 min后,分别为35μg/ml、24μg/ml、10μg/ml。其中,可溶性蛋白经电泳分离后,分子量大小均在20 KDa以下,经抗体检测未发现VP28条带。7)絮凝后及时调整下层藻细胞浓

关键词： HELQ   生殖细胞   胚胎干细胞   上胚层类似细胞   CRISPR-Cas9  

摘要： 依据世界卫生组织(WHO)评估,全球不孕不育的比例已经占到育龄夫妇的15%。而其中男性不育患者已经占据人类不孕不育患者总量的一半左右。利用干细胞结合基因编辑技术,建立体外生殖分化疾病模型来研究男性不育疾病的机制,将会有非常好的应用前景。HELQ,名为类似于POLQ的解旋酶(Helicase,POLQ-like),是一种DNA依赖性的ATP酶及DNA解旋酶,它在DSB(DNA Double-Strand Breaks)以及DNA链间交联(Inter-strand Cross Link,ICL)的修复过程中都发挥着重要作用。HELQ可以直接与RAD51的旁系同源复合物RAD51B/C/D,XRCC2以及DNA损伤相应激酶ATR作用。有研究表明,HELQ功能缺陷的小鼠出现类似唯支持细胞综合征(Sertoli Cell Only Syndronie,SCOS)表型,提示HELQ可能在性原细胞阶段或者原始生殖细胞阶段发挥作用。在本实验中,通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得能稳定传代的HELQ敲除的小鼠雄性胚胎干细胞系(Embryonic stem cell,ES)。免疫荧光染色结果显示敲除HELQ后,Oct3/4及Nanog的表达与对照组相比无明显差异,利用四倍体补偿实验证明胚胎干细胞的多能性不受影响,能够获得健康的四倍体小鼠子代。同时我们利用HELQ敲除的胚胎干细胞在特定的培养条件下继续进行体外分化,最终可以得到第二天(Day2)的上胚层类似细胞(Epiblast Like cells,Epi LCs)。通过免疫荧光染色及Real-time PCR分析,结果表明HELQ敲除的胚胎干细胞分化为上胚层细胞无明显异常。说明敲除该基因后不会影响胚胎干细胞的多能性及定向分化。因此,我们按照体外生殖细胞分化体系继续将上胚层类似细胞按照生殖细胞方向分化,通过流式分析可知敲除HELQ后,形成较低比例的Blimp1和Stella阳性细胞,其比例与对照组相比相差2-3倍,说明HELQ对生殖细胞的分化具有一定的影响作用。虽然并未对其影响原因做进一步的研究,但是这将对男性不育治疗提供更多的理论和技术支持,为干细胞的临床应用提供新的研究思路和重要依据。

关键词： 基因组学   领域   创新   全球性   人类基因组计划   研究者  

摘要： 医疗绝不是基因组学推动的创新革命的唯一领域。基因组学在其他领域也显示着改变和发展的趋势,其中不少已经证明具有有助于解决某些全球性问题的潜力。人类基因组计划的成功完成迄今不过13年,基因组学在应用上已经明显表现了其激励创新的效果。事实上,尽管基因组革命才刚刚开始,但它正在成为全球经济的变革因素——有望带来深远而积极的社会和环境影响的变革因素。

关键词： 猪流行性腹泻   单链抗体   基因工程   SOE-PCR   Western-Blot  

摘要： 目前,市场上预防猪流行性腹泻的主要疫苗均为弱毒苗和灭活苗,2010年冬季以来,猪流行性腹泻在我国又开始了爆发流行,即使是商品化的疫苗也难以快速控制该病的发展,说明主动免疫在免疫系统发育不健全的仔猪上难以发挥保护作用,因此,利用基因工程手段研发新型重组抗体进行被动免疫就成为了另外一个选择。本文在前人开发的抗PEDV杂交瘤细胞2D1的基础上,通过提取杂交瘤细胞总RNA,反转录获得全套cDNA,以此为模板,利用17对引物扩增重链可变区基因,利用19对引物扩增轻链可变区基因,筛选出2株VH序列和1株VL序列以及特异性扩增抗体可变区引物;另一方面,将原核表达的PEDV S1蛋白免疫昆明白鼠,获得阳性抗血清,提取脾细胞的总RNA,反转录全套cDNA,以此为模板,利用筛选出的特异性引物扩增抗体VH序列和VL序列,其中一株重链可变区单克隆SH2与杂交瘤细胞中抗体重链可变区基因序列VH5 100%相同,一株轻链可变区单克隆SL2与杂交瘤细胞中抗体轻链可变区基因序列VL匹配率达到97.18%,由此可以确定抗PEDV抗体的VH序列(366bp)和VL序列(354bp);与此同时,通过提取猪脾细胞总RNA,反转录全套cDNA,以此为模板,利用特异性引物扩增获得抗体Fc序列(363bp);通过SOE-PCR方法拼接得到单链抗体scFv(765bp)和scFv-Fc(1128bp),经过IgBlast分析后,两种单链抗体均具有典型结构域,构建原核表达载体pEASY-scFv和pET28a-sc Fv-Fc,通过原核表达系统对其进行分别表达,理论分子量分别为32KDa和45.8kDa,利用SDS-PAGE和Western-Blot方法对表达产物进行鉴定,通过间接Elisa鉴定该重组蛋白与PEDV的结合活性;最后,利用HRP anti-lebeled 6×His和HRP Goat anti-Swine两种抗体对scFv和sc Fv-Fc进行杂交。结果表明,通过原核表达产生的两种重组抗体均具有抗原结合活性,包含Fc段的sc Fv-Fc具有能被Goat anti-Swine抗体识别的特性,该研究为针对PEDV的重组抗体的研究奠定了理论基础,使用猪源Fc段对单链抗体的种属特异性进行了改造,具有较为深远的实际应用意义。

关键词： 法律规制   隐私权   知情权   干细胞研究   美国   陈蕾   法院   美利坚合众国   北美洲   司法机关   胚胎干细胞   监护权  

摘要： 干细胞和再生医学已成为当今备受瞩目的生命科学研究领域,但同时干细胞技术的蓬勃发展也受到了伦理、道德的挑战。关于干细胞美容,曾经有这样一个笑话:一女子出车祸重伤,生命垂危,恍惚中见到了上帝,上帝对她说:放心,你死不了,你还能再活50年。果然没多久,女子醒过来了,想到自己还能再活50年,就去做了整容。