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关键词： 造血发育   胚胎干细胞   血液谱系细胞   Hoxa9   Runx1c  

摘要： 背景 血液谱系细胞（B细胞、T细胞、NK细胞、髓系细胞等）作为机体免疫应答的核心参与者,在抵御外来病原体、抗击肿瘤等过程中发挥重要作用,细胞的缺失或功能异常都会导致多种疾病的发生。造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）作为一种拥有自我更新能力的多潜能干细胞,可以持续供给所有血液谱系细胞,是正常生理状态下各血液谱系细胞的主要来源。HSCs移植可重建整个造血系统,临床上利用HSCs移植来治疗多种血液类疾病。但在实际应用的过程中,HSCs的来源有限,体外扩增HSCs技术尚无实质性突破,这限制了成熟血液细胞和HSCs的应用。胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）具有易于进行基因编辑和无限来源的特性。因此,结合基因编辑技术,探索利用转录因子组合诱导ESCs定向分化获得造血干/祖细胞（Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs）以及成熟血液谱系细胞具有重要的研究价值。Hoxa9可以增强HSCs的自我更新能力。Runx1c对于HSPCs的发育至关重要。基于此,我们研究了Hoxa9和Runx1c转录因子组合诱导ESCs定向分化再生HSPCs及血液谱系细胞的潜能。 方法 首先利用同源重组的方法将携带Hoxa9和Runx1c基因片段的质粒导入到小鼠胚胎干细胞系（m ESCs）中,构建能够通过药物强力霉素（doxcycline,Dox）诱导从而特异性表达Hoxa9和Runx1c的i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs细胞系。接下来利用实验室前期建立的“两步法”分化策略进行造血谱系细胞分化的研究,即先在体外诱导i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs定向分化获得造血祖细胞（inducible hematopoietic progenitors,i HPCs）,再将i HPCs移植到C57BL/6野生型受体鼠或Rag1-/-免疫缺陷受体鼠体内进行谱系分化。通过流式分析术检测i HPCs在体内再生谱系细胞的能力,以及再生谱系细胞的类型和比例;分选再生的谱系细胞进行基因组PCR明确再生细胞的来源;利用10X单细胞RNA-Seq测序技术解析再生谱系细胞的转录谱特征。最后分选B细胞缺陷的μMT免疫缺陷鼠的LSK细胞分别移植到C57BL/6野生型受体鼠和Rag1-/-免疫缺陷鼠体内,解析i Hoxa9-p2a-Runx1c i HPCs移植到不同种类受体鼠体内再生不同谱系细胞的机制。 结果 （1）通过基因编辑成功构建了i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs细胞系,使用基因组PCR和q PCR实验证明m ESCs细胞系的基因组中包含i Hoxa9-p2a-Runx1c序列片段且细胞系能够在Dox的诱导下特异性表达Hoxa9和Runx1c基因。利用实验室前期构建的体外诱导分化体系,发现i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs细胞系在体外经过诱导分化后能够产生生血内皮细胞（inducible hematopoietic endothelial cells,i HECs）,分选i HECs并将其与OP9-DL1基质细胞共培养,可进一步诱导分化产生i HPCs。将i HPCs分别移植到经亚致死辐照处理的C57BL/6野生型受体鼠和Rag1-/-免疫缺陷鼠体内后,发现i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs来源的i HPCs在这两种受体鼠体内可分化为不同类型的血液谱系细胞。（2）i HPCs移植到C57BL/6野生型受体鼠体内能够再生包括B细胞、T细胞、NK细胞和髓系细胞在内的多种血液谱系细胞,这些再生的多谱系血液细胞包含多种亚型;分选再生的B/T/NK/髓系细胞进行基因组PCR鉴定进一步确定了再生的各谱系细胞均来源于移植到体内的i Hoxa9-p2a-Runx1c i HPCs;通过10X单细胞RNA-Seq测序实验发现再生的各谱系细胞具有与天然发育来源的对应细胞群相应的转录谱特征。i HPCs移植Rag1-/-受体鼠体内仅能产生T淋巴谱系细胞。（3）进一步分析两种受体鼠体内再生的T细胞激活状态,发现C57BL/6野生型受体鼠脾脏中存在效应T细胞、记忆T细胞和初始T细胞,而Rag1-/-免疫缺陷鼠脾脏中大部分为效应T细胞,不存在初始T细胞。此外,分析两种受体鼠胸腺中的DN细胞,发现野生型受体鼠体内可检测到各个时期的DN细胞,而Rag1-/-免疫缺陷鼠体内几乎检测不到DN细胞,表明Rag1-/-受体鼠体内的T细胞发育存在缺陷;（4）为了解析i Hoxa9-p2a-Runx1c i HPCs移植到不同种类受体鼠体内再生的T细胞具有不同激活状态的机制,将μMT免疫缺陷鼠的LSK细胞（μMT-LSK）和野生型小

关键词： 交替传译   词汇误译漏译   定语从句   翻译腔  

摘要： 本篇英汉交替传译实践报告所采用的语料来自于牛津辩论会网络视频。牛津辩论会历史悠久,辩论传统是邀请专家、学者、学生等人分别进行正反立场的主题演讲并于网络公开发布。本篇实践报告选取其中一篇演讲作为语料,辩论主题为“基因工程是否会削弱人类天性”。在完成英汉交替实践后,笔者分析了英汉交传过程中会遇到的问题,并提出与之对应的解决策略。 报告选择实践中的典型案例,从“词汇误译漏译”、“定语从句翻译不当”、“译语出现翻译腔”这三个角度对此次实践进行分析并得出如下结论。针对于词汇误译、漏译可以采用结合上下语境内容推测生词含义及对概念补充说明的口译技巧;源语定语从句翻译不当,可以采用译成前置定语和重复先行词的应对方法;译语出现翻译腔可以采用归化和语态转换的口译策略。此外,笔者总结反思了此次交传实践任务的不足,并对未来的口译学习提出了一些意见。

关键词： 转基因作物   检测方法   分子生物学   蛋白质检测   核酸检测  

摘要： 转基因生物技术在农业生产和研究中的应用日益广泛，该技术通过改变作物的遗传信息，提高其产量、抗病虫及适应环境的能力。然而，转基因作物的商业化种植可能引起生物安全和环境安全等潜在问题。因此，开发高效、准确的检测方法是确保转基因产品安全的重要环节。本文综述了目前应用于农业转基因作物的主要检测方法，包括分子生物学检测法、蛋白质检测法、细胞学检测法及综合分析法等研究进展，并对未来检测技术的发展进行了展望，以期为相关领域的研究人员提供参考。

关键词： RNA结合蛋白   HuR   转录调控   暂停释放   小鼠胚胎干细胞  

摘要： 近期的许多研究报道了RNA结合蛋白能结合染色质的现象,但是对于RNA结合蛋白在染色质上的功能及在转录上的调控机制的研究仍十分匮乏。本研究的HuR蛋白是一个经典的RNA结合蛋白,此前的研究大部分集中于其在修饰、转运、稳定性等转录后调控中的作用,然而HuR的部分重要生物功能并不能通过其直接调控RNA来解释。因此,我们构建了能够实现HuR快速降解的小鼠胚胎干细胞系,绘制了精确的HuR染色质结合图谱,发现HuR能够结合染色质且倾向于结合TSS和TTS,其染色质结合强度与基因的表达正相关,这提示着HuR可能在转录中存在调控。随后,HuR快速降解前后的PRO-seq、Ch AR-seq等多种转录组学实验发现HuR调节靶基因上转录的暂停释放。为了进一步寻找潜在的机制,我们通过质谱等方法发现并验证HuR与FACT复合物的亚基SSRP1的相互作用。FACT此前被报道能够维持启动子近端RNA聚合酶Pol II的暂停。通过染色质免疫沉淀,我们发现HuR能够招募SSRP1结合染色质。进一步,用SSRP1抑制剂处理HuR快速降解前后的细胞能够部分回补靶基因上HuR快速降解造成的转录变化。由此,说明HuR能够招募SSRP1,并且在靶基因上部分通过SSRP1发挥其在转录上的调控。 综上所述,我们的结果表明,在小鼠胚胎干细胞中,RNA结合蛋白HuR能够结合染色质并且部分通过SSRP1来调控靶基因上转录的暂停释放。我们的研究进一步扩充了HuR在转录层面的功能,丰富了RNA结合蛋白在染色质和转录层面研究。

ISBN: (纸本)9787519795580

关键词： 核酸扩增   CRISPR/Cas12a   可视化检测   转基因作物   DNA甲基化  

摘要： 基于核酸扩增的检测技术作为可以对真实样品中的痕量核酸靶标进行高灵敏检测的方法,在食品安全、农业生产和生物医学等领域发挥着重要作用。经典的核酸扩增方法,例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等,虽然已经实现了对特定核酸靶标的灵敏、特异性检测,然而仅仅依靠单一扩增反应很难实现超高灵敏度检测,尤其难以达到单分子水平。基于此,本论文从新型核酸扩增体系的构建以及可视化检测等方面进行研究,建立了多种高灵敏、高特异性、可视化的检测方法,并将其应用于转基因作物和DNA甲基化的分析。具体研究内容和结果如下: (1)基于多重LAMP的CRISPR/Cas12a法简单、便携和可视化检测转基因作物。选用转基因玉米的三个外源基因作为目标基因,根据LAMP的引物设计原则,分别针对每个基因设计两条茎环引物。每个基因对应茎环引物的茎环部分设计成相同的序列,因此,仅用一对通用引物即可实现所有目标基因的扩增。向体系中加入所有基因对应的引物,经多重LAMP扩增后,产生大量双链DNA扩增产物。随后,分别将扩增产物加至对应的CRISPR/Cas12a体系中,激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性,切割报告探针释放荧光信号,经紫外灯照射后即可肉眼观测结果。此方法解决了传统DNA嵌入型荧光染料无特异性识别能力的缺点,保证了方法的高特异性和高选择性。结合基于茎环引物的多重LAMP的高效扩增能力和CRISPR/Cas12a的高特异性识别能力,此方法实现了对转基因作物的多重、高灵敏、可视化分析,并可从大量非转基因玉米基因组DNA中检测低至0.5%的转基因玉米基因组DNA。 (2)双指数扩增法对转基因作物的超灵敏、可视化检测。为了进一步提高检测的灵敏度,我们在上一个工作的基础上,增加双指数扩增反应,以期提高扩增效率。首先根据LAMP的引物设计原则分别针对转基因玉米的启动子基因35S和报告基因GUS设计靶向识别目标基因四个区域的引物。经多个热循环的预扩增,一个目标基因可以产生大量的双茎环DNA。此双茎环DNA可以作为LAMP反应起始物,引发后续LAMP扩增。随后利用扩增产物作为桥梁,诱发阳离子共轭聚合物(cationic conjugate polymerization,CCPs)PFP 和荧光染料 SYBR GreenⅠ之间的高效荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET),经紫外灯照射可实现可视化检测。此方法将双指数扩增反应与基于阳离子共轭聚合物的荧光共振能量转移相结合,实现了低至5 pg转基因玉米的快速、超灵敏、可视化检测,并可以从大量非转基因玉米基因组DNA中区分0.01%的转基因玉米基因组DNA。 (3)基于单酶切的级联指数扩增法高灵敏、可视化分析DNA甲基化。利用甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ的高特异性识别能力和级联指数扩增的高效扩增能力,我们建立了一种高特异性和高灵敏检测特定位点DNA甲基化的方法。HpaⅡ选择性地将非甲基化DNA靶标切断,而甲基化DNA保持完整。因此,甲基化DNA可以引发后续级联指数扩增反应,扩增产物激活CRISPR/Cas12a系统的反式切割活性,切割荧光探针释放荧光信号,而非甲基化DNA因被切断而无法引发后续扩增反应,由此可实现DNA甲基化的高特异性、可视化检测。本方法可以精确检测低至1 aM的甲基化DNA,相当于10 μL体系只有6个分子,灵敏度接近单分子水平。此外,此方法能从大量非甲基化DNA中区分低至0.1%的甲基化DNA,并且实现了癌细胞和正常细胞中甲基化DNA含量的分析。

关键词： 诺如病毒   P蛋白   单克隆抗体   ELISA  

摘要： 诺如病毒是导致全球急性胃肠炎爆发的主要原因,不仅对人类健康造成严重威胁,也给社会带来巨大的经济损失。诺如病毒的快速、准确检测对感染性腹泻的诊治及随后的预防性控制具有重要意义。在众多基因型中,GII.4基因型仍占据主导地位。因此,本论文针对GII.4基因型,通过动物免疫制备高质量杂交瘤细胞,利用抗体基因重组技术制备基因工程抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。主要内容如下: （1）对诺如病毒P蛋白的氨基酸多序列进行比对,结果表明,诺如病毒P蛋白在GII.4序列表现出相对的保守性,与GII.4-ALQ43928-2015毒株进化关系最近。构建重组P蛋白的真核表达载体,在293F细胞中表达。 （2）以P蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得最优效价为32000的动物血清抗体。利用杂交瘤技术,通过间接ELISA法和多轮克隆、亚克隆的筛选,获得12株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过体内诱生法制备腹水,纯化后利用间接ELISA测定亲和力,获得6株EC50值小于50 ng/mL的单克隆抗体。进一步,通过竞争ELISA法筛选配对,获得一对表现为明显不竞争关系的抗体8-F1和9-F8,对其测序,获得抗体可变区的基因序列,并构建抗体真核表达载体,在293F细胞中表达、纯化后获得2个目标抗体:8-F1抗体,轻链20～25 kDa,重链50～55 kDa、EC50为7.375 ng/mL;9-F8抗体,轻链20～25 kDa,重链50～55 kDa、EC50为29.98ng/mL。 （3）构建以双基因工程抗体为基础的ELISA方法,确定包被抗体（8-F1）和检测抗体（9-F8）的最佳工作浓度分别为1000 ng/mL与1600 ng/mL,从而建立线性回归方程y=0.0266x+0.3075,R2=0.9918。该检测方法空白限（LoB）和检出限（Lo D）分别为0.24 ng/mL与0.33 ng/mL。 综上所述,通过一系列实验和研究,成功地获得了针对诺如病毒P蛋白的基因工程抗体,并构建了一种兼具高灵敏度和特异性的ELISA检测方法,基本达到体外诊断领域（In Vitro Diagnostic,IVD）的检测标准。相关工作可为诺如病毒的快速、准确检测提供指导,为进一步开发并研制诺如病毒快速检测试剂盒提供理论与物质基础。

关键词： 人胚胎干细胞   肝细胞分化   肝细胞极化调控   肝脏疾病模型   规模化培养肝细胞   类器官  

摘要： 肝脏是人体中重要的实质器官,负责解毒、代谢以及物质合成等重要功能。肝脏具有卓越的再生能力,但由于原代肝细胞难以在体外长期培养,导致体外功能性成熟肝细胞来源十分有限,极大地限制了肝细胞在临床治疗以及生物制药等方面的应用。其次,肝细胞在体内肝脏中处于高度极化状态,同时极化结构也是保证肝细胞功能的必要条件,而目前在体外难以便捷的方式获取极化肝细胞。所以,在体外建立规模化极化肝细胞的培养方法具有重要意义。为此,我们在3D悬浮培养条件下建立了基于人胚胎干细胞向肝祖细胞类器官以及成熟的极化肝细胞类器官分化体系,并最终验证了其在规模化培养系统中的适配性。本论文主要研究内容包括以下两个部分: 1.从人胚胎干细胞分化诱导可扩增的肝祖细胞类器官。为了获得体外具有扩增能力的肝祖细胞,我们首先在3D悬浮培养条件下建立了一种高效的胚胎干细胞来源肝祖细胞类器官扩增体系。通过模拟体内肝脏再生过程中的分子信号,在培养体系中加入诱导肝祖细胞扩增的细胞因子以及小分子,包括BMP4,FGF4,EGF,CHIR99021,SB431542和Forskolin等,搭配培养体系5%体积比的Matrigel支持分化肝祖细胞类器官的形成以及长期扩增。肝祖细胞类器官呈囊泡状,具有活跃的增殖能力,高表达肝祖细胞标志物与细胞增殖标志物。通过单细胞测序及分析技术,将肝祖细胞类器官与不同时期的人胎肝单细胞测序数据进行整合分析,结果表明分化肝祖细胞类器官与人第六周胎肝十分接近,而第六周胎肝正是富集肝祖细胞的时期,表明我们的分化肝祖细胞类器官与天然肝祖细胞高度相似。最后,通过转录组测序分析技术,对细胞外基质成分支持肝祖细胞类器官长期培养的分子机制进行探究,结合KEGG富集分析与WB等分析手段,最终揭示了在细胞外基质存在的条件下肝祖细胞通过维持细胞内活性氧以及细胞自噬水平的分子机制,进而保持长期的细胞活性以及增殖能力。 2.体外培养条件下长期扩增的肝祖细胞类器官能够保证稳定的肝细胞来源。肝祖细胞具有双能性,能够被诱导分化为成熟肝细胞以及胆管细胞。通过对诱导成熟肝细胞分化体系进行探索,模拟体内肝细胞成熟过程中的信号分子调控,并结合5%体积比Matrigel的支持,能够在3D悬浮培养条件下将其诱导为极化的成熟肝细胞类器官。成熟的肝细胞类器官呈典型的柱状上皮细胞极化结构,具有明确的底膜与基底膜以及丰富的胆小管网络,高表达肝细胞标志物,在体外表现出典型的肝细胞功能如白蛋白分泌、药物及氨代谢等,并且能够移植到体内对急性肝衰小鼠进行治疗。通过单细胞转录组测序分析,与人原代肝脏组织数据进行对比,证明了成熟的极化肝细胞类器官高表达肝细胞功能相关基因,包括药物代谢,胆汁合成分泌,物质转运,糖类代谢,脂质代谢等,并且高达43%的细胞与原代肝细胞十分相似,能够被定义为成熟肝细胞。通过转录组测序分析,对细胞外基质在3D悬浮培养条件下支持肝细胞极化的分子机制进行探究,结果显示细胞外基质作用于肝细胞上整合素,激活了FAK-ERK-AMPK极化信号通路,进而调控了肝细胞的极化过程。为了进一步证实分化的极化肝细胞类器官的应用前景,我们将其对非酒精性脂肪肝相关疾病的发生发展进行了模拟,另外使用两种急性肝损伤小鼠模型用成熟肝细胞类器官进行了治疗,并且构建了适用于药物筛选和研发及毒理分析的药物毒性检测模型。 最终,为了满足实际应用中对高数量级肝细胞的需求,我们建立了肝祖细胞类器官以及极化的成熟肝细胞类器官在小型生物反应器中的规模化扩增及规模化分化的培养方法,相比于静态培养,肝祖细胞类器官在动态培养条件下扩增能力提高三到四倍,显著提高了最终收获细胞的数量;另外,动态培养条件下有助于获得更加成熟的功能性肝细胞,为将来体外规模化生产肝细胞应用于临床细胞治疗、药物研发等领域提供前期的工作基础。