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关键词： Mesp1   Foxa2   胰岛细胞   胚胎干细胞   调控作用  

摘要： 研究目的:Mesp1是中胚层心脏发育重要的调节因子,敲除后会出现心脏发育不良,我们的前期研究发现Mesp1的子代细胞在内胚层区域有表达,而且只在胰腺的细胞中有特异性表达,但是Mesp1在胰腺发育中的调控作用机制尚有待深入研究。方法:构建Foxa2敲除的MCFFA小鼠模型,鉴定MCFFA小鼠遗传学表型,测定其血糖、胰岛素、胰高血糖素等生理指标,对MCFFA小鼠的胰腺组织进行免疫荧光染色,检测不同分组（Foxa2被敲除的纯合子组,杂合子和对照组）小鼠胰腺中胰岛细胞数量的变化。利用细胞谱系示踪技术定位Mesp1子代细胞分化为胰岛细胞的种类。培养并鉴定Mesp1敲除的胚胎干细胞,通过RNA-Seq测序后,PCA和热图分析全面评价不同基因型干细胞样本表达水平差异,对差异表达基因进行功能分析。将纯合子干细胞（MMR7）及杂合子干细胞（MMR2）分别注入囊胚后再转入代孕鼠的子宫内形成嵌合子,得到嵌合体小鼠,观察Mesp1子代细胞在胰腺中的表达水平及表达部位。将上述胚胎干细胞移植在STZ诱导的糖尿病小鼠胰腺体内,观察干细胞对糖尿病小鼠血糖的影响及Mesp1在糖尿病小鼠模型中的作用机制。结果:Mesp1子代细胞中敲除Foxa2可引起高胰岛素血症性低血糖,使小鼠胰岛细胞数量发生变化,胰岛细胞之间可能会发生命运的转换。Mesp1可抑制内胚层转录因子的表达（Foxa2）,当Mesp1被敲除后内胚层转录因子的抑制作用被去除,Foxa2相对的增多,胰岛细胞之间可能发生不同的命运转换;RNA-Seq测序后,PCA和热图评价MMR2和MMR7两个干细胞样本表达水平存在差异,对差异表达基因进行功能分析,发现MMR2和MMR7干细胞差异表达基因主要集中在生物体发育过程、细胞膜成分、离子通道活性等方面,KEGG富集功能发现Mesp1与胰腺分泌等作用密切相关;STRING软件对Mesp1与其相关联蛋白之间网络关系的分析结果表明直接与Mesp1相关联的蛋白有:TCF3,TCF4和TCF12;MMR胚胎干细胞种植在糖尿病小鼠的胰腺后对血糖的变化产生一定影响。结论:Mesp1是调控胰岛细胞发育的重要调控因子,可调节胰岛细胞间的命运转换;Mesp1敲除的胚胎干细胞为干细胞移植治疗糖尿病提供了新的实验思路。

关键词： 甲醛降解   甲醛脱氢酶   乳酸乳球菌  

摘要： 甲醛作为一种原生毒素,对生物体有很强的毒害作用,是室内空气污染的主要污染物之一。如何有效的控制空气中的甲醛污染,已引起人们的高度关注。通过生物法降解甲醛将成为去除甲醛的有利手段。本文合成了乳酸乳球菌偏爱密码子优化的甲醛脱氢酶的基因,并以乳酸乳球菌(***)为宿主,构建可以表达FADH的基因工程菌L6,并对其表达产物进行了鉴定和初步应用研究。Sphingomonas ***-3962的甲醛脱氢酶FADH由336个氨基酸残基组成。乳酸乳球菌偏爱GC含量降低的编码密码子,根据Lactococcus lactis *** SK11的2504个编码区、696252个密码子的使用情况统计,选择了丰沛及偏爱密码子进行优化。共替换了246个密码子。密码子优化后,可使FADH在乳酸乳球菌中个表达量提高37.14%。鞘氨醇单胞菌ACM-3962的HOCO降解基因簇,在FADHC和FADHA基因之间,存在着一个正向启动子和一个反向启动子,分别控制着FADHA和FADHC的表达。将该段序列克隆出来,在其上下游分别添加绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白,克隆到大肠杆菌中,检测并验证其功能。实验结果表明,FADH promoter的正向启动子,可以启动FADHA基因表达的启动子,可以在HOCO的诱导下启动,使其下游的蛋白得以表达。将FADH promoter-GFP基因和合成的FADH基因插入到pMG36e载体中,构建重组载体pMG-FADH。在*** BL21中扩增、验证后,电击转化进*** ML23中,构建可以表达FADH的基因工程菌*** L6。将培养液放置在有紫外灯照射的暗室中,观察菌液颜色,可见菌液发出绿色荧光,表明在HOCO存在时,FADH promoter可以启动GFP-FADH融合的表达,使*** ML23的菌液在紫外灯下发出绿色荧光。实验结果表明,FADH promoter的正向启动子,在乳酸乳杆菌中也可以启动GFP-FADH融合蛋白的表达。冻干的纯化FADH粉末,在加入含有HOCO的水溶液中后,可以在3h内将97%以上的HOCO水解成线性分子,大大降低HOCO的毒性。与未冻干的FADH相比,冻干酶活损失了超过34.8%,因此表达纯化后的FADH的应用受到较大限制。冻干的纯化乳酸乳球菌粉末,在加入含有HOCO的水溶液中后,可以在3h内将99%以上的HOCO水解成线性分子,大大降低HOCO的毒性。与未冻干的FADH乳酸乳球菌,冻干酶活损失了30%,菌体死亡数量大约为48%,因此将乳酸乳球菌直接冻干使用具有较好的应用前景。使用冻干的乳酸乳球菌进行自然水体的HOCO降解,与实验室buffer条件下相比,其酶活大大降低,这是因为自然水体中营养物质匮乏、pH等条件较苛刻造成的。这也表明,利用冻干的乳酸乳球菌进行自然水体的HOCO降解,还需进行深入研究。在空气中含有100PPM的甲醛时,可诱导乳酸乳球菌中的绿色荧光蛋白进行表达,其荧光强度与菌体量呈线性关系。空气中含有20ppm的甲醛时,绿色荧光蛋白就开始表达,60ppm以上时,绿色荧光强度可定量检测。制备的滤纸片甲醛检测生物传感器,可对环境中的甲醛进行响应,在紫外灯下观察到明显的绿色荧光。构建的乳酸乳球菌基因工程菌,可以对空气环境中甲醛进行响应,从而起到检测空气中甲醛的作用,可以作为空气中甲醛检测生物传感器使用。

关键词： 基因组编辑技术   人类生殖   编辑   细胞系   基因编辑技术   脱靶效应   镶嵌现象   胚胎干细胞   人类精子   体外受精   试管授精   早期胚胎   人类胚胎   核酸酶  

摘要： 各种咨询机构、科技组织和资助机构都十分关注人类基因组编辑,医学及伦理学研究者黛布拉·马修斯(Debra ***)、罗宾·洛弗尔·巴杰(Robin Lovell-Badge)及同行们对此提出了一些需要重点考虑的问题。基因编辑工具CRISPR/Cas9的易用、准确和高效性使其在研究中得到广泛使用,而且在农业和涉及非生殖细胞(体细胞)的基因疗法中也有了初步的应用。CRISPR/Cas9及相关技术也可使用在某些

关键词： 应用型本科   基因工程   课程改革   创新  

摘要： 基因工程技术不仅是生物工程专业和生命科学专业的主干课程,也是研究生命科学极为重要的工具。但是,传统的教学方式不能满足学生学习需要。在实际教学中,笔者以传统的教学方法为基础,优化教学内容、探讨启发式和互动式的教学方法,旨在提高基因工程教学质量,提高学生的基因工程实际操作能力,从而满足应用型本科院校生物工程及生物技术专业创新性人才培养的要求。

关键词： 转基因   恒温扩增   电化学   可视化   快速检测  

摘要： 转基因作物的推广和商业化种植在带给人们巨大经济效益的同时,其潜在风险却也饱受争议,快速准确地检测转基因具有十分重要的意义,事关国际政治和经济利益。传统基于外源蛋白分析的检测方法具有明显的局限性,而基于外源核酸分析的检测方法在对操作人员有较高要求的同时又受制于专业、昂贵、体积庞大的仪器设备。为了开发简单、快速、便携基于核酸分析的转基因检测方法,本课题以抗虫转基因水稻华恢1号、科丰6号和克螟稻1号为研究材料,以交叉引物恒温扩增技术(CPA)和环介导恒温扩增技术(LAMP)为扩增方法,以核酸扩增过程中的副产物H+和磷酸根为检测对象,分别建立了电化学无标记的核酸扩增检测方法和新型可视化核酸恒温扩增方法,并在以上研究基础上提出了基于逻辑判断的转基因具体品系的快速鉴定策略,开发出纸上可视化点阵列鉴定转基因品系的方法。本文的主要内容和研究结果如下：1)针对转基因通用元件T-nos的基因序列建立了用于转基因作物快速筛选的CPA体系,设计了6条引物,包括2条外引物、2条交叉引物和2条检测引物,特异性识别’T-nos序列的8个区域;通过使用SYTO 9作为荧光染料实现了对扩增反应的实时监测,考察了该体系的特异性和检测灵敏度,并与传统实时荧光PCR的检测效果进行了对比,结果表明：所建立的CPA体系能够特异性检测转基因农作物中的nos基因;其检测限约为103拷贝水稻基因组DNA,相比传统实时荧光PCR检测,能够达到相同的检测限但需要更短的时间(节约10 min左右);除此之外,能够检测至少0.5%掺杂的实际样本,足以满足国际上大部分国家和地区对转基因检测的需求。综上所述,CPA体系能够作为快速、简便的核酸扩增方法取代传统的实时荧光PCR,表现为需要更短的时间、更简单的反应仪器。2)以核酸扩增过程中的副产物H+为检测对象,建立了基于pH变化检测的电化学无标记核酸扩增检测方法,搭建了实时分析和终点检测两种形式的检测平台,结果表明：最适合用于pH检测的CPA体系(pH-CPA)的组成为50mMK+,15mM NH4+,3 mM的KOH添加;使用商业化pH计可以对pH-CPA扩增进行实时监测,将扩增过程中的pH变化最快的点作为pH-CPA反应的信号阈值,通过对扩增过程中得到pH变化曲线进行求导,得到曲线的局部最小值即为pH-CPA的信号阈值,信号阈值所对应的时间即为"Time to threshold",用tth表示;利用tth分析,pH-CPA扩增方法表现出可靠的定量分析性能,10倍差异的模板,tth大约差3;相比实时荧光检测的方法,该电化学检测方法节省大约20%的时间;此外,通过使用可抛弃的pH敏感的丝网印刷微电极,初始模板量为103拷贝基因组DNA的阳性样本扩增前后峰值电位差△Ep发生28.3 mV的变化,对应为0.38个pH,与使用商业化pH计实时分析得到的结果大致相同(约0.35 pH)。综上可知,以溶液中的H+浓度的变化为检测对象能够实现对核酸扩增反应实时或是终点的电化学检测,无需庞大的仪器设备,与恒温扩增技术结合应用,使得核酸分析过程更便携、简单易用,由于电化学检测本身具有易于集成化的特性使得该方法具有更好的应用前景。3)通过检测核酸扩增过程中的Pi信号的产生,建立了基于Pi分析的可视化核酸恒温扩增检测方法,详细系统地考察了该方法应用于不同扩增体系的可行性,并设计了配套的可抛弃的防污染装置,建立了完整的快速、便携、可视化核酸扩增检测体系,结果表明：核酸扩增条件下非扩增特异性Pi产生的唯一来源是dNTP分解,影响dNTP分解最主要的因素是反应温度条件,传统PCR(加热／冷却热循环,40 cycles)条件下约13%的dNTP分解产生Pi,而恒温CPA扩增条件下(63℃,1 h)则仅有2%的dNTP发生分解;在扩增特异性Pi信号产生情况的研究中,经过PPase处理的CPA阳性样本约产生2.86 mM的Pi,是不经过PPase处理的阳性样本产生量的36倍,阴性样本产生量的53倍(经过PPase处理),而PCR体系阳性样本(经过PPase处理)则产生约0.5 mM的Pi,相应阴性样本(经过PPase处理)产生Pi0.15 mM;通过对dNTP利用率的计算可以得到CPA扩增体系中有大约87.5%的‘dNTPs被用于扩增,将近3.36%发生非扩增特异性降解;而PCR扩增体系则仅有22.3%的dNTPs被用于扩增反应,18.6%的dNTPs降解;使用该可视化方法检测CPA,仅需扩增15 min即可完成对103拷贝基因组DNA的检测,相比第3章基于pH变化的电化学检测核酸扩增的方法节约将近50%的时间;通过考察该方法在LAMP扩增中的应用,得知该方法并不局限于对CPA扩增体系的检测,具有能够应用于其他种类恒温扩增体系的巨大潜力。综上可知,以溶液中的Pi信号的产

关键词： 《生命科学》   目次   张文蔚   中国科学院   中科院   研究进展   专辑   胚胎干细胞   RNA   双生病毒   智能科技   肠道微生物   抗黄萎病   脊椎动物   朱卫国  

关键词： 伪狂犬病   CH/HNSMX/2012株   基因缺失弱毒疫苗   安全性   保护效力  

摘要： 伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪和多种家畜共患的一种急性,热性传染病。PRV主要感染猪,能够导致仔猪的高死亡率和种猪繁殖障碍,对养猪业危害极大。疫苗免疫是防控猪伪狂犬病的主要手段。然而自2011年底,PRV变异毒株在我国猪场出现并且流行,给养猪业造成了巨大的损失。最新的研究显示,现有商品化疫苗的保护效力显著下降,不能有效阻断这种变异株的传播和流行。本研究旨在以当前流行的PRV变异株(CH/HNSMX/2012株)为亲本,通过基因工程技术构建gI、gE、TK三基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK,通过一系列动物试验,研究了该毒株的安全性和免疫效力;为PRV变异株弱毒疫苗的研发与应用奠定了基础。1.伪狂犬病病毒流行毒株的分离鉴定和致病力研究本研究从85份病料样品中总共分离到16株PRV。空斑试验显示这16株PRV的空斑面积相似(0.4-0.8mm2),均显著高于经典毒株Ea株(0.2-0.5mm2)。对这16株PRV进行gC基因测序和进化分析,结果显示这16株PRV同源性非常高,和国内近期公布的PRV分离株的gC基因高度同源;因此可以初步判定,这16株PRV均属于PRV变异株。选择PRV CH/HNSMX/2012株作为变异株的代表,通过小鼠和仔猪感染试验研究其致病力。小鼠LD50试验结果显示CH/HNSMX/2012株和Ea株的LD50分别为19.5和154.2 TCID50。CH/HNSMX/2012株对小鼠的致病力显著强于Ea株。使用CH/HNSMX/2012株通过滴鼻途径感染60日龄仔猪,剂量分别为106.0、107.0、108.0TCID50;结果显示所有感染组均出现发热,食欲废绝,典型的神经症状和严重的呼吸道症状。106.0 TCID50感染组的5头猪中有3头仔猪死亡;而107.0和108.0 TCID50能够导致5头仔猪全部死亡。2.基因缺失病毒rSMXΔgI/gEΔTK的构建根据PRV基因组序列,选择gI/gE和TK基因两侧的序列作为同源臂,构建了重组转移载体;将重组转移载体和CH/HNSMX/2012基因组共转染PK-15细胞,获得重组病毒;通过空斑纯化,获得纯净的不带标记的基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK。RFLP和Southern Blot试验证明该毒株按照设计在gI/gE和TK两个区域发生了缺失,而基因组其他位置没有发生突变。rSMXΔgI/gEΔTK株的生长曲线和亲本株相似,但是空斑面积显著减小。细胞连续传代试验证明rSMXΔgI/gEΔTK遗传稳定。3.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK的安全性评价使用101.0-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过足垫注射接种Balb/c小鼠,观察14d,接种小鼠未见临床感染症状。使用102.0-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过皮下注射接种新西兰大耳兔,观察21d,没有兔出现临床感染症状。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过肌肉注射接种绵羊,观察21d,结果没有绵羊出现临床症状;同栏饲养的绵羊没有出现gB抗体转阳的现象。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过肌肉注射和滴鼻两种途径,接种0日龄仔猪,观察28d,结果没有仔猪出现临床症状,仔猪生长速度正常;每个感染组设置的哨兵猪gB抗体维持阴性。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过肌肉注射接种妊娠84日龄母猪;没有母猪出现发热,流产等临床症状,出生仔猪数和仔猪的健康度和生长速度完全正常,和对照组没有差异。综上所述,PRV rSMXΔgI/gEΔTK株不能导致小鼠、兔、绵羊、新生仔猪、妊娠母猪等易感动物出现症状,仅具有有限的水平传播能力,安全性较好,适合作为弱毒疫苗的候选毒株。4.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK株对仔猪的免疫保护力评价分别使用106.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株弱毒疫苗,1头份Bartha-K61株弱毒疫苗(Merial,France),或者1mL DMEM免疫28日龄PRV阴性仔猪1次,免疫后28天采血检测抗体。中和试验结果显示rSMXΔgI/gEΔTK产生的血清中和抗体水平高于Bartha-K61疫苗。Bartha-K61疫苗产生的血清中和抗体中和Bartha-K61的中和效价显著高于中和CH/HNSMX/2012株的中和效价;而r SMXΔgI/gEΔTK株疫苗没有这个现象。免疫后28天使用CH/HNSMX/2012株滴鼻攻毒,剂量107.0TCID50;攻毒后对照组症状最严重,出现典型的神经症状和呼吸道症状,全

关键词： 干细胞   人胚胎干细胞   视网膜色素上皮细胞   视网膜   干细胞治疗  

摘要： 视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmented epithelium,RPE)的功能紊乱、变性和凋亡可造成视网膜内环境的恶化,进而引起光感细胞的凋亡,最终导致退行性视网膜疾病的发生,使患者视力下降,甚至失明。但迄今为止,依然没有有效的治疗手段来治愈这些疾病。而近期临床试验表明,细胞治疗有望成为该类退行性视网膜疾病的治疗方法。其中,人胚胎干细胞(Human embryonic stem cell,hESCs)是一类能无限增殖和分化成所有三胚层细胞的细胞群体,而hESCs诱导分化获得的RPE(h ESCs-RPE)被认为是细胞移植治疗的最佳种子细胞。并且动物模型实验和临床试验结果显示,hESCs-RPE在体内具有很好的安全性,不存在致瘤和引起其它不良反应的风险,并且对视力的恢复具有一定的效果。但是,现有的hESCs-RPE培养体系,往往使用滋养层(feeder)和含有胎牛血清(Fetal calf serum,FBS)等动物源性或成分不明确成份。为hESCs-RPE的临床应用带来了污染的潜在风险和高昂的培养成本。而建立无动物源性培养体系,将有利于人们对RPE生长机制的研究和今后对hESCs-RPE相关细胞制剂的规模化、商品化生产。本文通过无滋养层feeder、无血清体系培养的hESCs。并利用免疫荧光染色,核型分析,流式细胞仪等技术手段检测hESCs的形态与多能性表达情况。hESCs经过7天的培养后,克隆块基本融合。此时,将原有的hESCs培养液更换为RPE分化培养液,利用自分化方法进行RPE诱导分化。再经过纯化、传代之后获得较纯的RPE样细胞。之后,我们利用免疫荧光染色、RT-PCR、扫描电子显微成像、核型分析等技术对hESCs分化获得的RPE细胞进行形态特征鉴定。并利用细胞吞噬实验检测hESCs-RPE是否具有吞噬功能。该无动物源性体系符合临床要求,为后续实验提供了“种子”细胞。利用无feeder无血清体系下自分化获得的hESCs-RPE,可为国内hESCs-RPE相关临床研究提供参考。

关键词： 拓展阅读   胚胎干细胞   干细胞研究  

摘要： 美国著名影星布拉德·皮特主演的影片《返老还童》曾给人留下深刻印象。主人公本杰明·巴顿一出生便如80多岁的老人一般,之后便逆着常人生长的定律成长,最后竟以婴儿的形态离开人世。现实中,想要像这样"返老还童"却几乎是奢望。然而,科学家的发现却恰如其分地诠释了一句广告词——"一切皆有可能"!这个发现就是神奇的干细胞!一个完整人体的形成,是各细胞在特定基因编码的引导下发生的分化,而这些细胞

关键词： 胚胎干细胞   增殖   多能性   mTOR   线粒体  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC),是一种可以在体内分化成其他任何一种细胞类型的细胞。在体外,它能在保持多能性的同时,无限地增殖。所以它在组织再生修复、人类疾病模型的构建和生物发育的研究中有很高的潜在价值。在本论文中,我们探讨一个保守的能量代谢感应通路mTOR和一个原始的细胞器线粒体对胚胎干细胞增殖及多能性的影响。其结果如下:一、在m TOR方面1、利用血清+Lif和2i+LIF两种培养条件下培养E14细胞株,72小时后,分别检测细胞的体积大小及增殖速度,我们发现血清+Lif培养条件下的小鼠胚胎干细胞体积及增殖速度均大于2i+Lif培养条件下的。依此我们推测血清+Lif培养条件下mTOR的活性大于2i+Lif。因为两种培养条件下的小鼠胚胎干细胞同处于初始胚胎干细胞状态,具有相同的多能性或分化潜能,所以我们推测mTOR的活性大小不影响小鼠胚胎干细胞的多能性而只影响小鼠胚胎干细胞的增殖快慢。2、我们用siRNA敲降上游mTOR抑制者的方法激活mTOR信号通路后,发现小鼠胚胎干细胞的多能性没有显著性的变化,但是细胞的增殖有一定的减缓趋势,进一步验证了m TOR的活性大小对细胞增殖的影响。二、在线粒体方面1、我们探索了线粒体对小鼠胚胎干细胞多能性的影响。通过操纵培养条件的方法,我们鉴定了shPGC1a/b能阻碍胚胎干细胞多能性的失去,同时有利于胚胎干细胞多能性的重塑。此后我们发现线粒体的总量和线粒体ROS可能是线粒体影响小鼠胚胎干细胞多能性的关键因素。2、为了充分验证上述线粒体对小鼠胚胎干细胞增殖的作用,我们利用Crispr/Cas9技术成功获三株PGC1a敲除细胞系。本论文的研究结论是mTOR信号通路的改变对小鼠胚胎干细胞的增殖有一定的影响,但是对其多能性的变化没有显著的作用。而线粒体的抑制能影响胚胎干细胞的多能性。