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关键词： 硬度   拓扑结构   胚胎干细胞   肝细胞   转染  

摘要： 胚胎干细胞(ESCs)作为多能干细胞,能在体外自我更新和分化成所有的体细胞,可作为其他细胞的种子细胞。胚胎干细胞的特殊性质使其成为非常热门的研究对象。研究显示,胚胎干细胞的生长分化无论在体内还是体外受到各种因素的影响,如细胞周围物理力学环境、可溶性因子、细胞相互作用、外源基因干扰等。已有研究围绕单一力学性质,仅硬度或者拓扑,或者仅研究定向分化,而并没有将硬度、拓扑和定向分化结合起来的研究,而在体内分化过程中微环境的力学性质并非单一存在。因此为了更好地模拟体内微环境,有必要将硬度和拓扑耦合,研究其对胚胎干细胞的生长分化调控。此外,研究揭示外源基因干扰胚胎干细胞可改变其正常生长和分化状态,可认识和了解细胞生长和分化机制,发现未知基因和已知基因新的功能,然而胚胎干细胞的基因转染效率很低,有待优化其转染载体,提高其转染效率。基于基底力学微环境和基因转染可影响胚胎干细胞的命运,本文以人胚胎干细胞(hESCs)为研究对象,探讨了硬度和拓扑耦合的微模式化基底以及基因转染载体的物理化学因素对胚胎干细胞的生长分化的影响,为了解和认识微模式化基底影响hESCs的生长和肝向分化机理、为优化设计hESCs的基因转染载体提供理论支持。研究的内容和结果如下:首先本课题选取常见的硬度可调节的聚丙烯酰胺水凝胶,通过微模式化制作技术,制备了两种硬度(分别为6.1和46.7 kPa)、四种拓扑结构(分别为柱状、沟槽、六边形、平面),硬度耦合拓扑结构的八种基底。所制备的基底经过处理后,将hESCs接种在其上,培养三天后加入不同的诱导分化因子,通过一系列的分化流程,将hESCs诱导分化为类肝细胞。对细胞形态变化、蛋白和基因水平标志物的检测和肝细胞功能的考察,发现在不同的生长分化时期,硬度和拓扑起不同的作用:在干性维持阶段,软、硬胶都有利于干性维持,软胶上的细胞比硬胶的表达更多的Nanog和Oct-4,沟槽结构不利于干性维持;确定内胚层分化阶段,硬胶上的细胞易分化,六边形和柱状对分化影响最大;在前体肝细胞分化阶段,软胶有利于类肝细胞功能维持,平面和柱状表达更多的肝细胞特异性标志物;在成熟的肝细胞阶段,软胶优于硬胶,拓扑结构对类肝细胞功能没有明显影响。硬度在分化的过程中起决定性作用,拓扑结构对分化有部分作用,研究结果提示在胚胎干细胞分化及体外肝细胞培养中,应该考虑到硬度和拓扑结构的影响,提高分化所得肝细胞的效率和成熟度。其次本文采用不同末端基团(氨基、羧基和羟基)和不同大小的五种PAMAM树枝状分子转染hESCs,考察其对hESCs转染能力、生长、干性维持和分化的影响,并动态观察hESCs胞吞胞吐FITC标记的PAMAM的过程。研究发现G5、G7、G4.5COOH和G5OH粒径在5 nm左右,G1直径最小为3.14 nm。G5、G7带正电荷,G1带微弱的负电荷,G4.5COOH和G5OH带较强的负电荷。PAMAM的末端基团对转染、生长分化影响最大,只有末端基团为氨基的PAMAM才能转染hESCs,10μM的G5转染效率最高,低浓度(0.5、1μM)的G7具有一定的转染能力。末端基团为氨基的PAMAM代数越高毒性越大;末端基团为羟基和羧基的PAMAM对hESCs的毒性低,有利于hESCs干性维持。另外,hESCs对FITC标记的G5胞吞胞吐作用明显。综上,对hESCs的转染需要综合考虑末端基团、阳离子大小、电荷等因素才能更好地转染hESCs。

关键词： 陆地棉   棉酚   RNAi   转录组测序   (+)-δ-杜松烯合酶  

摘要： 棉酚与其它保护萜类都是次生代谢物,在植物对害虫的自我保护系统中增加植物的抵抗能力。(+)-δ-杜松烯合酶基因与棉酚合成过程有密切的关系。本课题分别构建(+)-δ-杜松烯合酶基因的两个亚组CAD1-c、CAD1-a目标序列的干涉载体并进行了遗传转化。其中,CAD1-a也构建了含有种子特异启动子的干涉载体,以期望得到种子中没有棉酚,而植株中含有棉酚的棉花材料。随后,用qRT-PCR技术验证转基因材料中目标基因和棉酚合成相关基因的转录水平。获得以下实验结果:(1)通过RT-PCR分析杜松烯合酶基因与棉酚合成相关基因的表达模式得出,FPS、P450、dHG-6-OMT在根和子叶中高度表达;CAD1-c在棉花茎、叶、萼片和果皮中有所表达;CAD1-a在这些组织中均未表达。(2)分析转基因棉花材料CAD基因表达水平发现,当干涉掉CAD1-c基因后,CAD1-a基因上调表达;干涉掉CAD1-a基因,CAD1-c基因上调表达,说明基因CAD1-a和基因CAD1-c在功能上可能有一定的互补作用。同时也发现把CAD1-a基因干涉很彻底时,CAD1-c基因的表达量也会很低,说明CAD1-a基因在一定程度上可以调控CAD1-c基因的表达。(3)CAD1-c基因参与的信号传导机制可能属于PTI途径,而CAD1-a基因参与的信号传导机制可能属于ETI途径。JA可能通过抑制WRKY1转录因子的表达来调控CAD1-a基因的表达。CAD1-c基因可能影响植物激素信号ABA的传导路径,并参与了植物激素信号传导和抗病原菌等过程。(4)分析转基因材料的转录组数据发现,编号为A-2(CAD1-a)的株系有122个基因上调表达,58个基因下调表达;C-15(CAD1-c)的株系有421个基因上调表达,115个基因下调表达。其中453个基因在CAD1-c中发生变化,97个在CAD1-a中发生变化,有83个基因在两个材料中都发生变化。(5)通过对转基因材料的棉酚测定发现,CAD1-a和CAD1-c基因的干涉系棉酚都有所降低,CAD1-a的效果更好。种子特异启动子转基因后代棉籽中棉酚的含量显著降低,如果棉籽直接用于养殖业和食品加工行业等领域,可以带来巨大的经济价值。

关键词： 试管婴儿   遗传疾病   基因工程   性别选择   体外受精   人工选择   牛津词典   新名词   科学家   基因组   直埋   特质   收录   解释   技术   词条  

摘要： 事实上,“定制婴儿”并不是什么新名词.自从基因工程诞生尤其是试管婴儿出现以来,对“定制婴儿”的设想和隐忧就一直埋在科学家们心中. “定制婴儿”避免遗传疾病 早在2004年,牛津词典就收录了这一词条,对其作出解释:“定制婴儿”是那些经由基因工程人工选择过基因组并结合体外受精技术培育的婴儿,以确保某种特殊的基因、特质的存在或缺失.那时候,对婴儿的定制主要有两个方向——避免遗传疾病和性别选择.

关键词： 小鼠胚胎干细胞   miRNA   miR-142-3p   心肌细胞   分化  

摘要： 目的:胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)来源于囊胚内细胞团,能在体外无限增殖并分化成三个胚层中所有类型的细胞,包括有功能的心肌细胞。近年研究发现micro RNA(miRNA)在心肌细胞分化命运决定中起着重要作用,然而对决定心肌细胞分化命运的miRNA了解还很有限。本论文旨在筛选调控m ESCs向心肌细胞分化过程的miRNA,探讨其调控机制,进而加深对心肌细胞分化调控机制的认识。方法:悬滴培养法诱导小鼠(m ESCs)向心肌细胞分化。miRNA芯片检测中胚层、心血管前体、分化早期和中期心肌细胞的miRNA表达谱。通过建立稳定过表达m ESCs系和瞬时转染miRNA抑制剂来上调和下调miR-142-3p;通过分析碱性磷酸酶活性和m ESCs标志蛋白的表达鉴定miR-142-3p对ESCs自我更新的影响;通过MTT,Brd U和细胞周期检测鉴定miR-142-3p对ESCs增殖的影响;实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测三胚层和心肌细胞特异性基因的表达鉴定miR-142-3p对胚层命运决定和心肌细胞分化的作用。通过生物信息学分析和荧光素酶报告基因系统筛选miR-142-3p的靶基因。结果:获得中胚层、心血管前体、分化早期和中期心肌细胞的miRNA表达谱。Q-PCR验证miR-672在中胚层细胞中表达下调,miR-142-3p在中胚层细胞和心血管前体细胞中表达下调、miR-193、miR-196a、miR-196b和miR-467e在心肌细胞中表达下调。miR-142-3p在m ESCs分化过程表达逐渐下降,到分化第4天表达最低,然后缓慢回升。下调miR-142-3p不影响m ESCs自我更新,也不影响心肌细胞分化;过表达miR-142-3p不影响m ESCs自我更新和增殖,但抑制心肌细胞分化。进一步研究发现过表达miR-142-3p不影响外、中、内三个胚层的特化,但抑制心脏中胚层基因Mesp1及其下游心脏转录因子Nkx2.5、Tbx5、Mef2c的表达。过表达miR-142-3p不影响Mesp1上游基因Brachyury、Eomes的表达,也不影响上游WNT信号通路。靶基因鉴定发现miR-142-3p能靶向Acvr2a、Rarg、Tgfbr2、Tpm4、Atp2a2、Tgfb2和Mef2c m RNA的3’UTR,这些基因与心肌细胞分化和功能相关。结论:我们揭示了中胚层、心血管前体、分化早期和中期心肌细胞的miRNA表达谱。发现miR-142-3p不影响m ESCs自我更新和增殖,也不影响胚层命运决定,但通过Mesp1调控心肌细胞分化。miR-142-3p对Mesp1的调控不依赖于已知的上游基因Brachyury和Eomes,也不依赖于WNT信号通路。miR-142-3p可能通过靶向一群与心肌细胞分化和功能相关的基因调控心肌细胞分化。我们的研究为理解miRNA对ESCs向心肌细胞分化的调控机制提供了新的线索,有助于更好地了解在体心脏发育和心肌细胞形成过程,为胚胎干细胞来源的心肌细胞走向应用提供实验数据。

关键词： 生化分析   基因工程   虚拟实验室   3ds Max   Virtools  

摘要： 随着国家级虚拟实验中心建设政策的支持,虚拟现实技术飞速发展,越来越广泛地被应用于高情景三维交互式虚拟仿真教学系统的构建与研发中,融入到人们的日常生活之中。生化分析及基因工程实验涵盖了生命科学基础学科实验及研究方法等,如何利用生命活性物质进行分析以及生物化学技术进行分析是探索生命奥秘的发展趋势。但是在现实实验室中,一些传统的生化分析及基因工程实验存在耗时、操作步骤繁琐、实验结果重复性差、实验安全风险较大、仪器价格昂贵等诸多影响因素,使得一些实验的开展较为困难,由于一些仪器高昂的维护与保养费,学生动手操作仪器的机会不多。而生化分析及基因工程虚拟实验室的建设,不仅可以有效缩短实验时间、提高实验结果的重复性、让每个想要学习实验的人都可以亲自动手操作,并可以循环反复操作,真正意义上做到随时可学、随处可学、人人可学。虚拟实验与真实实验两者为互补关系,二者缺一不可,相辅相成。生物化学及基因工程虚拟实验室的构建可以有效解决传统实验中的不足之处,不同以往以课件、网络课程等教学形式,利用虚拟实验进行教学是一种新兴的教育模式,因此,构建生化分析及基因工程虚拟实验室是十分必要的。本文利用Virtools、3ds Max、Flash、PhotoShop、PHP语言、VSL语言等多种软件以及技术的融合,构建了一个集多种功能于一体的网络共享虚拟实验室。通过使用Virtools软件中自带的BB模块以及VSL编程语言实现虚拟实验的漫游、交互操作、工作站的模拟等过程,支撑整个虚拟实验室的设计与构建。利用3ds Max三维建模软件建立虚拟实验室环境以及虚拟实验仪器、人物等模型,并通过多种语言的结合,最终设计了较为完整的生化分析及基因工程虚拟实验软件。高情景三维交互式生化分析及基因工程虚拟仿真实验室以网络平台为依托,在多媒体计算机上建立可供用户模拟的虚拟实验环境以及交互操作,利用虚拟仿真技术及硬件设备呈现出高沉浸感三维立体视觉效果,达到人机一体化。同时提供用户网络化管理,实验平台开放共享等功能,集预约、选课、预习、考核评价、虚拟实验操作等多种功能于一体。通过网络共享平台,用户不再受时间、空间限制,不仅可以及时获得实验数据,也可以随时查看考核结果并进行数据分析,开拓了生化分析及基因工程教学模式的全新领域,为人才的培养、仪器的学习、实验教育教学模式奠定了基础。

关键词： 春雷霉素   调控   生物合成   高产菌株   基因工程  

摘要： 春雷霉素是由春雷链霉菌(Streptomyces kasugaensis)产生的一种重要的氨基糖苷类抗生素,能与细菌核糖体30S小亚基结合,通过有效抑制蛋白合成的肽链延长来发挥杀菌功能,因而作为高效广谱低毒的生物农药被广泛应用于农业病害防治。春雷霉素生物合成基因簇于2006年被报道,但迄今为止其生物合成和调控机制的研究十分有限。本研究在春雷霉素生物合成基因簇的左翼序列鉴定了五个与春雷霉素生物合成调控相关的基因:途径特异性正转录调控因子kasT,双组份调控系统kasW/kasX,MerR家族负转录调控因子kasV和推测编码异戊烯半胱氨酸羧甲基转移酶的基因kasS。KasT蛋白与链霉素生物合成的途径特异性转录因子StrR高度同源,前期研究显示KasT可以结合春雷霉素生物合成基因的启动子区。我们首次建立了春雷链霉菌BCRC12349(Streptomyces kasugaensis BCRC12349,LY)的遗传操作系统,成功敲除了kasT。kasT缺失后春雷霉素不再产生,春雷霉素合成基因的表达量剧烈下降,kasT回补后春雷霉素恢复产生,而kasT加倍后可以将低产菌株LY中的春雷霉素产量提高3倍。这是第一次通过体内实验证明了kasT是春雷霉素生物合成的途径特异性正调控因子。KasW和KasX分别与双组份调控系统LuxR家族的应答蛋白和组氨酸激酶具有很高的同源性。我们通过基因敲除和转录分析鉴定了kasW和kasX的功能。kasW、kasX缺失突变株中春雷霉素的产量分别提高了12%和19%,qRT-PCR结果显示,突变株中春雷霉素生物合成基因表达量均显著提高,说明kasW/X是春雷霉素生物合成的负调控基因;KasV蛋白与MerR家族转录调控因子同源性较高,kasV突变使春雷霉素产量提高194%,生物合成相关基因的表达量提高4-8倍,表明kasV是春雷霉素生物合成的关键负调控基因;kasS与kasV位于同一个转录单元,KasS与异戊烯半胱氨酸羧甲基转移酶具有较高的同源性。通过基因敲除和转录分析,我们发现kasS缺失使春雷霉素的产量提高22%,春雷霉素生物合成相关基因的转录水平提高3-9倍,说明kasS与春雷霉素生物合成调控间接负相关。因此,我们证明在低产菌株LY中敲除负调控基因kasW/kasX/kasV/kasS或加倍表达正调控基因kasT,可以有效地提高春雷霉素的产量。基于在低产菌株中成功的产量提高策略,我们尝试对高产的春雷霉素产生菌小金色链霉菌XM301(Streptomyces microaureus XM301,HY)进行基因工程改造。高产菌株HY的春雷霉素产量是低产菌株LY的10倍以上。初步的基因组序列比对发现二者基因组具有高度相似性,而且春雷霉素生物合成基因簇序列完全相同。在高产菌株HY中敲除kasW/kasX,春雷霉素产量提高了58%,但是高表达kasT并未导致春雷霉素产量的明显变化;kasV的缺失突变株中春雷霉素生物合成基因的表达量提高了4-8倍,但是产量并没有明显变化;kasS突变株的春雷霉素产量下降了43%,春雷霉素生物合成相关基因的转录水平明显降低,这与低产菌株中kasS的调控功能相反。为了寻找低产菌株和高产菌株调控功能差异的原因,我们进行了高产菌株HY和低产菌株LY的全基因组测序和转录组测定。转录组分析显示,高产菌株HY中的春雷霉素生物合成基因表达量是低产菌株LY的40-80倍,暗示高产菌株中春雷霉素生物合成基因的转录已经处于一个较高的水平,继续提高其转录具有一定局限性,应该考虑其他的春雷霉素生物合成相关因子并加以改造。综上所述,本研究在春雷霉素产生菌中首次对春雷霉素合成的调控机理进行研究,鉴定了五个与调控相关的基因,并且通过低产菌株中调控基因的功能鉴定,指导了高产菌株的高产改造。我们不仅成功地获得了春雷霉素的高产衍生菌株,同时比较了低产菌株和高产菌株的差异,为抗生素高产菌株的改造提供了借鉴。

关键词： 异氟醚   人类胚胎干细胞   自我更新   分化  

摘要： 目的:探讨异氟醚对人类胚胎干细胞自我更新能力及分化情况的影响。方法:将传代后1天的细胞随机分为实验组和对照组,每组n=5。实验组细胞暴露于2%异氟醚、5%CO2和21%O2的混合气体6h;对照组细胞暴露于5%CO2和21%O2的混合气体6h。观察两组胚胎干细胞的生长情况,对两组细胞计数并检测两组细胞干性基因及各胚层标志性基因的m RNA水平。结果:传代后第五天,两组细胞集落出现不同,实验组细胞数目明显低于对照组,差异有显著性(t=3.40,P<0.01);实验组多能性基因(Nanog,Sox2,Oct4,Lin28)对应的m RNA水平低于对照组,差异有显著性(t=2.82～3.89,P<0.05);实验组内胚层、中胚层、外胚层标志性基因(AFP,T,Nestin)对应的m RNA水平均高于对照组,差异有显著性(t=2.67～3.33,P<0.05)。结论:异氟醚能够抑制离体人类胚胎干细胞的自我更新能力,并促进其提前分化。

关键词： 兔出血症病毒   VP60   实时荧光定量PCR   基因工程疫苗   抗体   细胞因子  

摘要： 兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种高传染性,高致死性的急性烈性传染病,给养兔业和相关行业带来了巨大的经济损失。RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus),为单股正链RNA病毒,含有1条约7.4 kb的基因组和1条约2.2 kb的亚基因组。VP60是RHDV的主要结构蛋白,是病毒的免疫保护性抗原,是RHD诊断和疫苗研发的重要分子。RHD无有效的治疗手段,目前控制的主要措施为疫苗免疫预防。为了更好地控制和预防兔出血症,本论文从RHDV的检测和RHD基因工程疫苗的免疫保护机制两方面进行研究。根据VP60蛋白基因序列设计引物建立兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法,利用该方法对不同时间点不同样品中病毒含量的动态变化进行分析;另外从体液免疫应答和细胞免疫应答两方面评估兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制。主要研究内容如下:1.兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及应用根据兔出血症病毒的VP60蛋白基因序列设计引物,经过反应体系和反应条件的摸索和优化,建立了重复性好、敏感性强的RHDV SYBR Green RT-PCR检测方法,可有效检出重组质粒为14.6拷贝/μL的样品。利用该方法对RHDV感染兔6h、12h、24 h、30 h、36 h的血清、肝、脾中的病毒含量动态变化进行检测。结果表明,血清、肝、脾三种样品中病毒含量均呈现时间依赖效应,随着时间增加,其病毒含量呈现几何数增长。家兔感染RHDV12h、24h、30h及36h后,血清中病毒含量分别达到约105、106、107、108拷贝数;肝脏中病毒分别达到约105、108、108、109拷贝数;脾脏中病毒含量分别达到约105、108、108、108拷贝数左右;肝脏中的RHDV含量最高,说明肝脏是其主要的靶组织。2.兔出血症基因工程疫苗免疫保护机制的研究为研究兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制,以兔出血症基因工程疫苗免疫健康易感家兔,同时设立组织灭活疫苗免疫组和PBS空白对照组,从体液免疫应答和细胞免疫应答两个方面评估疫苗的免疫效力。分别在免疫接种后0、3、7、14、21、28 d采集各组兔血液,通过ELISA方法检测血清中RHDV特异性抗体IgG和IgM水平以及细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)的水平变化;用血凝抑制(HI)检测血液中总抗体的水平变化,于21 d对所有试验动物攻毒,以攻毒保护试验评估疫苗的免疫保护能力。试验结果表明,免疫后7天、14天和21天,组织灭活疫苗组和基因工程疫苗组血清中特异性抗体IgG、IgM均显著升高,与对照组相比差异显著(P<0.05);基因工程疫苗组与对照组相比,免疫后3天、7天和14天血清中IL-2、IL-4和IFN-y含量均显著(P<0.05)增高,组织灭活疫苗组与对照组相比,血清IL-2含量无显著(P>0.05)差异,IL-4和IFN-y含量显著(P<0.05)升高;与对照组相比,免疫后7天、14天、21天两组疫苗组血清的血凝抑制效价均显著升高(P<0.05);同时还发现,基因工程疫苗组诱导产生的特异性抗体(IgG、IgM)、细胞因子(IL-4、IFN-γ)均比组织灭活苗组高,且免疫后3天、7天、14天、21天以及28天基因工程疫苗组血清中IL-2显著(P<0.05)高于组织灭活苗组;攻毒保护试验结果显示,两种疫苗均能100%保护RHDV的攻击。因此,兔出血症基因工程疫苗可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫应答反应,有效预防兔出血症。

关键词： miR-29a   miR-505   CRISPR-Cas9系统   性发育   GT1-7细胞系   基因敲除小鼠  

摘要： 背景：MicroRNAs(miRNAs)是一类长度大约为22nt的非编码小RNAs,它能通过靶向结合mRNA3'端非编码区(3'UTR)调控大量生物学过程包括细胞增殖与凋亡、神经元分化、肿瘤产生以及个体发育。本实验室之前的研究通过比较C3H/HeJ和C57BL/6两种近交系雌鼠间阴门开启时间的差异定位到了与性发育相关的基因：miR-505。此外,有研究表明miR-29基因家族成员中的miR-29a在哺乳动物大脑中高度表达,并且随着幼年个体生长发育,其在大脑中的表达量有着明显的波动,表明miR-29a可能在哺乳动物神经系统中发挥重要作用从而调控个体的生长发育。基因敲除技术是目前研究miRNA生物学功能的主要反向遗传学方法之一。而CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)作为一种来源于细菌和古细菌免疫系统的新型基因编辑工具,能够有效地引发靶基因突变进而导致基因功能丧失。目的：本研究尝试利用miR-505基因敲除小鼠,研究miR-505敲除对雌鼠性发育和生殖力的影响；利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a进行基因敲除,检测miR-29a基因敲除GT1-7细胞的表型变化,探索miRNAs与性发育之间的联系。方法：在动物实验方面,通过sgRNA/Cas9进行胚胎注射获得miR-505基因修饰小鼠,通过与野生型C57BL/6小鼠三代回交得到稳定遗传的基因修饰小鼠。通过进一步自交,获得三种基因型的子代,最后比较不同基因型雌鼠miR-505表达量情况、性发育和生殖力表型。在细胞实验方面,构建Cas9基因稳转的GT1-7细胞,并构建sgRNA29a-EGFP质粒转染上述GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后对阳性单克隆细胞分别进行miR-29a表达量检测、表型分析和靶基因预测与验证。结果：在动物实验方面,胚胎注射获得了16只miR-505基因工程小鼠,其中有两只基因工程小鼠分别具有17bp和23bp的碱基缺失。荧光定量PCR结果显示,大片段缺失的基因工程小鼠的miR-505表达量有了显著的下降。虽然不同基因型雌鼠间miR-505表达量的显著差异没有引起性发育和生殖能力的统计学显著性变化,但是总体平均值显示雌鼠miR-505表达的缺失具有使阴门开启时间提前和增强部分生殖指标的趋势。在细胞实验方面,成功构建了稳定表达Cas9蛋白的GT1-7细胞模型,并利用该细胞模型完成了多种基因编辑。此外,流式富集后的表达绿色荧光蛋白阳性GT1-7细胞,其miR-29a突变率和表达量都发生了明显的变化。通过流式细胞仪获得了一个miR-29a基因修饰GT1-7单克隆细胞,它在miR-29a基因区段有2 bp的碱基缺失。此外,miR-29a的表达量下降程度较富集细胞更高,而且miR-29a表达量的显著下降导致了GT1-7细胞生长速率的减缓和表型的变化。靶基因验证结果发现,DCX基因受到了miR-29a表达量变化的影响。结论：利用CRIPSR-Cas9系统对miRNAs基因进行编辑能够有效降低miRNAs的表达量,即使CRISPR-Cas9系统造成的碱基缺失主要发生在miRNAs的加工区域。而Cas9稳转GT1-7细胞显著提高了基因编辑效率,并有利于后续利用流式细胞仪进行富集细胞。通过构建miR-505基因敲除小鼠模型发现,miR-505敲除对雌鼠性发育和生殖能力没有产生统计学显著的影响,但是总体平均值显示miR-505敲除雌鼠阴门开启的时间和部分生殖指标具有一致性的变化趋势。相比之下,miR-29a在GT1-7细胞中具有比较明显的生物学功能,并且可能通过调控DCX基因来实现。

关键词： 稻米品质   直链淀粉含量   Wx   RBE1   转基因技术  

摘要： 改良稻米的蒸煮食用品质已成为近年来我国水稻研究的热点和重点,稻米的蒸煮食用品质主要由直链淀粉含量(AC)决定。为了提高直链淀粉含量,目前主要通过两种途径：第一,诱导淀粉合成相关基因突变,从中选择高直链淀粉含量的突变体；第二,利用转基因的方法人工调控淀粉合成相关基因的表达,从而改变稻米淀粉的结构和组成,最终培育符合生产需求的水稻新品种。为了改良并提高现有水稻品种的直链淀粉含量,我们主要进行了以下几方面的研究,主要研究结果如下：1.本研究分别测定了5个不同AC品种稻米籽粒淀粉的理化性质,结果表明它们籽粒淀粉颗粒特征和糊化温度都不相同。接下来我们对它们发育种子(开花后3、5、7天)的10个淀粉合成关键基因进行了Q-PCR检测,结果表明,Wx、RBE1和RBE3在水稻发育中的种子中表达丰富且在不同品种间差异较大,其中Wx基因在发育中胚乳的表达丰度与AC值的大小呈正相关。2.本实验室从通过Tilling筛选和基因测序一批经EMS诱变后的中花11的突变体群体,鉴定出一个在BE Ⅱa (RBE4)基因的第四个外显子上有一个G到A的单碱基突变的纯和突变体,这个碱基的改变导致此处的氨基酸由丝氨酸(S)变为了天冬酰胺(N)。对BE Ⅱa基因进行蛋白质结构域分析发现,该突变位点位于蛋白质的非保守区域中,接下来通过对中花11和突变体的BE Ⅱa基因做定量表达分析,结果也表明该基因表达量在二者之间并无明显差异。对该突变体稻米淀粉的理化性质检测结果表明,该突变体的AC与野生型相比有一定程度增加,平均增加比例为4.97%,且突变体的糊化温度类型也由原来野生型中等(70-74℃)变为低等(≤70℃)。对它们的淀粉颗粒进行电镜扫描观察发现突变体的淀粉颗粒与野生型相比变大且轮廓不明显,此外它们的大小、形态相同且无规律,但排列较为紧凑。3.根据查阅的文献资料以及我们前期的实验结果,我们发现Wx、RBE1和RBE3这三个基因对水稻籽粒的直链淀粉含量影响较大。我们利用RT-PCR的方法,从籼稻品种IR36的未成熟种子中克隆到完整的水稻Wx基因的cDNA编码区、水稻胚乳特异性启动子GluB1以及水稻淀粉分支酶基因RBE1基因片段。构建了Wx过表达与RBE1干涉结合的多基因复合表达载体,并以GluB1启动子调控这两个基因的转录表达。将构建好水稻多基因表达载体导入受体籼稻品种IR36ae (amylose extender),筛选鉴定阳性转基因植株。