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ISBN: (纸本)9787513042949

关键词： 转基因作物   知识产权   侵权责任   专利权   植物新品种权  

摘要： 近些年来,与转基因作物相关的话题得到人们的广泛关注。转基因作物是指运用了转基因技术,将经过筛选或重新构建的优良基因片段结合到作物整体基因组上,并使这些优良基因在作物上表达出来,从而获得具有优良特性的作物。在被转入具有优良性状的基因后,转基因作物可以获得例如高产、抗虫害、抗冻等优良特性,给人类社会带来了巨大的利益。转基因作物属于植物,可以进行自我复制,因此它不同于传统的工业产品,具有一定的特殊性。在转基因作物的研发、创造、生产和销售等环节中,应运而生多种与之相关的知识产权。其相关知识产权种类各异,如商标权、地理标志等等。但是有些种类的知识产权并不会因为转基因作物的特殊性而在权利保护方面有别于传统的农业产品或者是工业产品,对于这类知识产权,本文不作讨论。本文主要针对与转基因作物特殊性有最密切联系的知识产权侵权责任展开论述,即转基因作物植物新品种权的侵权责任和转基因作物相关专利权的侵权责任。转基因作物相关的专利权有三种形式。美国等少数国家对植物本身授予专利权。而我国签订的是《国际植物新品种保护公约》1978年版本,依此公约,不授予转基因作物本身以专利权。我国采取了另外两种专利权保护形式,对转基因作物的制备方法授予方法专利权和凭制备转基因作物时所需要的相关产品(例如:优良性状的基因序列片段)申请产品专利权。对转基因作物本身,我国选择了植物新品种权的保护方式。无论是转基因作物相关专利权还是植物新品种权,都有共同的特征:它们是智力成果,是一种客观的存在,具有无形性;相对于权利人而言,是一种绝对权,支配权,具有专有性;权利保护期限是固定的,超过了保护期限其智力成果就可以被公众使用,具有时间性;权利人基于所在国家及地区的法律进行申请,并且只在申请地受保护,具有地域性;权利的类型、内容、申请程序、保护方式等都是依据法律而定的,具有法定性。转基因作物知识产权侵权责任的构成要件是认定行为人是否构成侵权行为并承担民事责任的必备要件,是侵权之债构成的基本要素。转基因作物知识产权侵权责任的构成要件含有四个基础要件和两个特别要件。其基础要件分别应为:对权利人保护范围内的权利进行侵害的侵权行为;对权利人的人身权、财产权等权利造成了占有妨碍的损害事实或者是损益损害事实;损害事实和行为人的侵权行为之间有因果关系;行为人具有故意或者过失的主观过错。其特别要件应是:要以生产经营为目的;未经权利人许可。实践中,应先分析转基因作物知识产权侵权责任的构成要件,再依据过错推定原则来确定侵权人是否应该承担侵权责任及其责任形式。侵权人占有妨害了权利人对知识产权的独占性,如制造转基因作物相关产品,应承担停止侵害等责任;对权利人的转基因作物相关产品造成了市场上的负面影响,如假冒他人专利权或植物新品种权,应承担消除影响等责任;对权利人的相关财产权造成损益损害的,如销售转基因作物相关产品,应承担赔偿损失等责任。在满足一定条件时,侵权责任也可以被予以免除,如以科研为目的生产或使用相关转基因作物产品、国家为了公共利益强制许可实施其专利权等。在存在责任免除的情形下,并非是行为人未对权利人的转基因作物知识产权产生损害,只是依法不需要承当责任。本文通过调查、分析、对比等多种研究方法,从民法、专利法、侵权责任法等多个角度,结合转基因作物的特殊性,对转基因作物知识产权的侵权行为、损害事实、因果关系等侵权责任要件进行细致梳理,对侵权责任的承担形式和赔偿等问题进行系统剖析,解答了转基因作物知识产权侵权责任的基础性问题和实践中的焦点问题。希望能对转基因作物知识产权侵权纠纷的解决起到帮助作用,为转基因作物领域相关人员提供意见,以备参考。

关键词： hESC   RPE细胞   二维诱导分化法   三维诱导分化法   视网膜色素变性   RCS大鼠   细胞移植  

摘要： 研究背景和目的视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是由视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞和视网膜光感受器细胞变性引起的遗传性致盲眼病。目前,RP的治疗尚没有明确有效的方法。RPE细胞移植是目前治疗RP最有远大前景的治疗方法。用于移植的RPE细胞大多来源于早期自体和同种异体RPE细胞及胚胎RPE细胞[1-5],存在细胞来源受限、RPE细胞活性差、免疫排斥反应及严重手术并发症等诸多问题,限制了其临床推广。近年来多能干细胞来源的RPE细胞因其来源广泛、生物学特性良好而渐渐成为RPE细胞移植的主要来源。2012年和2015年Schwartz等[6,7]两次报告使用人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)来源的RPE细胞(通过自发分化方法,本文以下统称为二维诱导分化法)移植治疗两类视网膜变性疾病:年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和Stargardt黄斑营养不良,均证实了hESCs来源的RPE细胞的安全性和有效性,这是hESCs来源的RPE细胞临床移植的首次报道,揭开了人胚胎干细胞临床转化研究的序幕。胚胎干细胞分化为RPE细胞有多种方法,各方法诱导得到的RPE细胞的纯度、活性、功能以及获得的效率都有很大差别。近年来采用无血清培养,可将小鼠或人胚胎干细胞诱导的拟胚体(Embryoid bodies,EBs)样聚集体在特制的V字底培养皿结合基质胶培养条件下快速再聚集,配合低浓度生长因子,可以有效地促进ESCs向类器官发育[8,9]。从这类胚胎干细胞来源的类器官中可以获得包括RPE细胞在内的各类治疗细胞。由于这种全新的三维诱导分化法模拟了器官的体内发育过程,从这种诱导方法得到的治疗细胞被认为可能具有更好的生物学特性、更接近原代分离的治疗细胞,但目前尚未见将hESCs经传统的二维诱导分化法和经上述三维诱导分化法得到的RPE细胞(即2D-RPE和3D-RPE细胞)的生物学特性进行系统比较研究的相关报道。本研究拟首先建立hESCs的三维视泡视杯诱导方法,从中分离出RPE细胞,观察RPE细胞的三维诱导分化过程并进行生物学鉴定,并与传统的二维诱导分化法获得的hESCs来源的RPE细胞在成熟度、细胞功能、移植后对变性视网膜的保护功能等方面进行比较,以明确三维诱导分化法获得RPE细胞的特性,为临床选择合适的诱导方式提供依据。方法1、二维分化法诱导人胚胎干细胞为视网膜色素上皮细胞(2D-RPE细胞)(1)H1人胚胎干细胞的培养与鉴定;(2)2D-RPE细胞诱导过程中细胞的形态学变化研究;(3)2D-RPE细胞免疫荧光鉴定,通过分析Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特异性标记物的表达,鉴定2D-RPE的成熟程度。2、三维法诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞(3D-RPE细胞)(1)3D-RPE细胞诱导过程中细胞的形态学变化研究;(2)3D-RPE细胞免疫荧光鉴定,通过研究Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特异性标记物的表达,鉴定3D-RPE的成熟程度。3、比较3D-RPE和2D-RPE细胞的生物学特性(1)免疫荧光染色比较3D-RPE和2D-RPE细胞在诱导40d、60d和100d后细胞PAX6的表达差异,并比较PAX6阳性细胞率,以比较3D-RPE和2D-RPE中RPE前体细胞的阳性率差异。(2)通过免疫荧光染色和免疫印迹法,比较3D-RPE和2D-RPE细胞在诱导40d、60d和100d后成熟RPE细胞标记RPE65的表达情况,以明确两种不同诱导方法中成熟RPE细胞的比例差异。4、观察3D-RPE和2D-RPE细胞移植慢性视网膜色素变性大鼠模型(Royal college of surgeon,RCS)后的安全性和有效性(1)通过Ki67、mitochondrial和Dil共标记移植后4w的细胞,观察细胞在体内的增殖情况;将3D-RPE、2D-RPE细胞和hESC细胞分别移植SCID免疫缺陷小鼠腹股沟两侧皮下,每周观察皮下情况至4个月,观察畸胎瘤的形成情况。(2)通过RPE65、mitochondrial和Dil共标记移植RCS大鼠视网膜下腔后4w的3D-RPE和2D-RPE细胞,观察细胞在体内的存活情况;同时采用Rhodopsin染色测量移植3D-RPE和2D-RPE细胞后4w、8w和12w RCS大鼠视网膜的外核层厚度、ERG电生理检测b波幅值,以分析3D-RPE和2D-RPE细胞移植对变性视网膜保护作用的差异。结果H1的鉴定(1)hESCs传代后第一天,细胞单个或多个生长,细长呈分支状;第二天换去含Y-27632的培养液后,hESC

关键词： 褐黄孢链霉菌   纳他霉素   基因工程   pimE   pimM   vgb  

摘要： 纳他霉素是一种高效、广谱、安全的多烯大环内酯类抗生素,能高效的抑制霉菌和酵母的生长,并且对哺乳动物细胞的毒性极低,因此被广泛应用于食品和医药领域中。天然生物防腐剂纳他霉素的市场需求逐渐增大,但目前纳他霉素发酵水平较低,生产成本较高,限制了其进一步的开发和应用。近几年来,纳塔尔链霉菌和恰塔努加链霉菌中纳他霉素生物合成基因簇的克隆和鉴定,为利用基因工程手段提高链霉菌属纳他霉素的产量提供了可能性。本论文以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus S139)为出发菌株,利用分子技术手段考察了褐黄孢链霉菌中途经特异性调控基因pimM,胆固醇氧化酶基因pimE及异源透明颤菌血红蛋白基因vgb对纳他霉素产量的影响。主要研究结果如下:(1)本论文以整合有红霉素启动子ermE*(Perm)的pIMEP为出发载体成功构建了六个表达载体:pIMEP:pimE、pIMEP::pimM、pIMEP::vgb、pIMEP::pimE::pimM、pIMEP::pimM::vgb和 pIMEP::pimE::pimM::vgb。(2)六个表达载体通过大肠杆菌-链霉菌接合转移的方法获得六种不同的转化菌株,并通过抗性平板、抑菌圈实验和PCR验证等方法筛选、验证基因工程菌株。六种基因工程菌株在SS平板上传代培养7代后,菌株遗传性能稳定。(3)本论文对六种基因工程菌株与出发菌株进行摇瓶发酵,结果表明:与出发菌株相比,六种基因工程菌株的菌体生长曲线与出发菌株相似,但其纳他霉素产量各有不同,其中基因工程菌株***/pIMEP::pimE、***/pIMEP::pimM、***/pIMEP::vgb的纳他霉素产量较出发菌株提高的百分比最高值分别为 19.56%、17.77%、24.08%;***/pIMEP:pimE:pimM、***/pIMEP::pimM::vgb的纳他霉素产量较出发菌株提高的百分比最高值分别为 40.28%、43.66%;然而***/pIMEP::pimE::pimM::vgb的纳他霉素产量较出发菌株提高的百分比最高值为55.69%。摇瓶发酵结果表明褐黄孢链霉菌纳他霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因pimM、胆固醇氧化酶基因pimE的过表达和透明颤菌血红蛋白基因vgb的异源表达均可以提高褐黄孢链霉菌中纳他霉素的产量,并且基因的串联表达对纳他霉素的生物合成具有叠加加强效应。

关键词： 疫苗发展   疾病预防手段   基因工程   疫苗的现状  

摘要： 科学技术的不断提高及疫苗产品的更新换代,使得疫苗越发成为生物医药学中非常重要的一部分。疫苗自从被开发出来后,便受到广泛的关注与持续的研究。如今,生物疫苗接种是预防和控制传染病的重要手段,随着近年来基因工程的发展,一些新型疫苗的发展十分迅速,为人类及动物疾病的预防和治疗带来了新的希望。本文就疫苗的发展史进行简要的归纳总结,并对如今疫苗的现状作一定的描述的概括。

关键词： 转基因作物   农业大国   陈晓亚  

摘要： 转基因作物已经在全球诸多国家普遍种植,而我国也是部分转基因作物的主要进口国。世界上其他国家对转基因作物的看法如何,我国转基因研究又有哪些问题?对此我们采访了植物次生代谢、植物抗虫和棉花生物学方面的专家陈晓亚院士。科学世界:有人认为,"转基因食品是美国的阴谋",您怎么看?陈晓亚:关于转基因的争论要从科学技术、国家发展和人民健康的角度去看,不要往别的事情上生拉硬扯。认为"转基因种子就是美国大公司为了推翻我们国家而发明出来的",这

关键词： Numb基因   过表达   慢病毒   胚胎干细胞  

摘要： 目的Numb是重要的细胞命运决定子,在决定人胚胎干细胞的分裂方式中起重要作用。本实验用含有人Numb基因的慢病毒,感染人胚胎干细胞,建立人Numb基因过表达的人胚胎干细胞系,为进一步研究人Numb基因调控干细胞“干性”的研究提供实验素材。方法1、采用本实验室之前成功构建的Lenti-EF1a-rtTA-IRES-puro慢病毒载体感染hESC,经药选后建立含有调控组分的细胞系。再将Lenti-EF1a-rtTA-IRES-EGFP慢病毒载体感染rtTA过表达胚胎干细胞,从而构建完整的四环素调控人Numb过表达的hESCs细胞系。2、采用本实验室之前构建的Lenti-EF1a-rtTA-IRES-EGFP慢病毒载体感染hESCs,建立EGFP过表达细胞系。根据EGFP所发的绿色荧光挑取Numb过表达的hESC克隆并纯化,提取纯化后的细胞的DNA,通过RT-PCR检测Numb是否成功整合至hESC。并使用DOX诱导后通过Q-PCR检测Numb的表达量。结果(1)成功建立人Numb基因过表达的人胚胎干细胞系,荧光显微镜下可见发绿色荧光克隆。(2)通过RT-PCR检测人Numb基因过表达的人胚胎干细胞系的NumbDNA,结果显示23号和44号克隆在Maker的Numb基因分子大小处有明显条带。(3)比较DOX诱导组(实验组)和未加DOX诱导组(CON组/对照组)的23号和44号克隆的Numb的表达。Q-PCR结果示可见第23号克隆DOX组Numb表达量为CON组的4.35±0.22倍,第44号DOX组Numb表达量为CON组的4.71±0.13倍。(P<0.05)。结论本实验成功完成了Numb基因过表达的人胚胎干细胞系的构建和论证。

关键词： 脱氮假单胞菌   好氧合成维生素B12   vgb基因   cob基因   氧调控  

摘要： 维生素B作为甲基转移酶的辅因子,既能增强营养代谢,也能促进红细胞的发育和成熟,使肌体造血机能处于正常状态,从而达到预防恶性贫血,维护神经系统健康的效果。因而随着生活水平的提高,对于VB的需求必将日益增加,如何提高VB的产量和质量是迫在眉睫需要解决的问题。本文针对脱氮假单胞菌好氧合成维生素B的特性,通过基因工程的手段,获得了在一定供氧条件下,具有高效合成维生素B潜力的菌株。并以Q和细胞形态变化为优化参数,提出了基于Q的维生素B发酵优化氧调控策略,对于大规模维生素B发酵过程也具有重要的参考价值,具体结果如下：在一定装液量条件下,与原始菌株相比,导入vgb基因的重组菌株,不仅在发酵产量上得到了15%的提高,也在一定程度上提高了菌体生长代谢。从基于13C标记代谢流的定量分析结果也能发现,vgb基因的导入有利于增强PP途径通量,为菌体生长提供前体和还原力。同时增强了甜菜碱代谢合成甘氨酸途径,进一步促进甘氨酸和谷氨酸合成前体物质氨基乙酰丙酸(ALA),进而加速产物维生素B的合成。在提高氧的利用的同时,过表达与维生素B合成途径中重要过程前咕啉-2合成钴啉胺酸的一系列反应相关的cobF-M, cobS-T基因。从摇瓶实验结果来看,cob基因的过表达使得重组菌株在产物单位菌体得率方面相较对照有明显的提升,说明对于重组菌株,进一步优化提高菌体量是发酵单位提升的关键。在良好的供氧条件下,单独过表达cobS-T基因有更好的表现,说明钴离子螯合过程是维生素B发酵过程一个重要的限速步骤。此外,在确定了活细胞传感仪测得的电容值与细胞干重的关系的基础上,成功实现在线Q监测。发现了发酵过程重要的调控时间节点,即生产菌株由个体生长转向菌体拉长进入合成阶段的节点,进而选择Q以及细胞形态作为发酵过程优化的标志性考察参数。通过对两个阶段Q控制的优化,结合菌体形态分析以及产量高低评估,得到了在菌体形态发生变化的时间节点,即Q下降到1.8 mmol/g/h以下,此时最佳电容值控制在10.45 PF/cm,而在转向产物合成阶段后,保持Q在1.4 mmol/g/h的氧调控策略,此时脱氮假单胞菌菌体长宽比控制在10：1。相比较之前的基于OUR和基于DO的氧调控策略,基于Q的优化控制方法带来更高,更稳定的维生素B发酵产量,在50L发酵罐中最终产量达到239.7 mg/L,相较之前的调控策略分别提高了15.2%和20.5%。

关键词： 胚胎干细胞   Filia   调控   调节控制   DNA   损伤反应  

摘要： 文章简介多能干细胞在再生医学中有巨大的应用前景,维持遗传稳定性是其临床应用的重要前提。与分化细胞相比,多能干细胞具有独特的遗传稳定性调控方式,但分子基础远未清楚。本研究发现了多能干细胞特异表达蛋白Filia,全面调控DAN损伤反应,维持多能干细胞遗传稳定性。Filia通过多个途径作用,其中包括结合Parp1蛋白并上调Parp1酶活性。Filia在多能干细胞中的表达呈异质性,该研究结果为鉴定和筛选遗传稳定性的多能干细胞提供了分子标记。

关键词： 含补肾中药大鼠血清   人胚胎干细胞   体外分化   类卵泡结构  

摘要： 目的:应用含补肾中药血清研究补肾方对人胚胎干细胞体外分化为类卵泡结构的研究。方法:以H9人胚胎干细胞为实验对象,诱导H9细胞形成拟胚体(EB),加入含22、23、24、25、26、27#方的含药血清,血清浓度为3%;另以分化诱导因子骨形成蛋白4(BMP4)作为阳性对照,BMP4终浓度为100pg/ml;以不加BMP4的完全培养液作为空白对照。显微镜动态观察H9拟胚体生长和分化的形态学变化;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测EB和分化细胞生殖分化标志基因的表达;采用免疫荧光技术检测生殖细胞分化相关的标志蛋白表达;应用酶联免疫(ELIS)A技术定量测定了分化后期培养液中E2含量。实验产生的数据均使用SPSS19.0统计学软件处理,若同时满足正态分布和方差齐性,则取用x±s表示,运用单因素方法分析和配对T检验进行检测。结果:含补肾中药血清诱导H9拟胚体生长及分化1.1各含药血清组可明显促进EB的生长和诱导EB分化,在诱导分化第3天出现与阳性对照类似的早期分化特征:大量细胞从EB游离,EB逐渐缩小呈不规则形;同时收集EB及游离细胞检测胚胎干细胞分化标志基因Oct-4 mRNA的表达。结果显示:加入含药血清前其Oct-4基因大量表达,加入含药血清培养第3天,各组EBOct-4 mRNA明显下调,表明含补肾中药血清在短期内即启动EB分化。1.2进一步检测了与生殖发育相关的基因表达,各含药血清组对生殖分化相关基因的表达有明显差异,其中23#含药血清在诱导GDF9、ZP1和SCP3的表达均强于BMP4。进一步采用免疫荧光技术检测了 23#含药血清组诱导EB分化第5天GDF9的蛋白表达。与mRNA水平检测结果一致,阴性对照组因具有自发分化特性,GDF9有较弱表达;BMP4和23#含药血清诱导的GDF9表达明显增强,且23#含药血清优于BMP4。2.含补肾中药血清诱导人胚胎干细胞向生殖特异性组织细胞分化2.1含药血清诱导分化5-7天,BMP-4阳性对照组和23、25、26#含药血清组均可观察到一类明显大于其它分化类型的细胞,该类该细胞直径大于50μm,形态酷似类卵细胞。继续延长培养分化时间至7-10天,类卵细胞直径增加,其边缘逐渐形成细小颗粒;诱导分化至11-16天,类卵细胞边缘的颗粒层随时间延长而增厚,胞体直径均大于100μm,某些颗粒层呈现扁平状结构。推定这类被颗粒细胞层包裹的细胞为类卵泡结构(follicle-like structures,FLSs)。为了证实含药血清诱导分化的类卵泡结构,选择23#含药血清诱导分化并持续16天,在显微镜下观察和记录了 FLSs形成的动态变化。综合分析结果显示,含药血清以及BMP4可在5-16天内,诱导H9胚胎干细胞形成至少3种FLSs结构,包括从始基卵泡(primordial follicles)→初级卵泡(primary follicles)→次级卵泡(secondaryfollicles)的发育。2.2补肾中药诱导分化类卵泡形成的分子标志物鉴定2.2.1原始卵泡期的分子标志物分析为了进一步证实类卵泡结构的形成,选择23#含药血清,培养H9细胞3-7天,在原始卵泡形成数量较多时,应用RT-qPCR技术检测原始卵泡形成过程中3种分子标志物表达的动态变化。23#含药血清在诱导分化3、5、7天,均上调GDF9和SCP3的表达,呈现时间依赖性;23#含药血清也诱导VASA表达,但在分化第7天表达下调。GDF9和SCP3表达的时间依赖性与原始卵泡在体外分化发育的时间基本一致;VASA基因在诱导分化第7天表达下调,提示VASA的表达与始基卵泡发育有关。另选择23#含药血清诱导培养第7天的原始卵泡,检测了GDF9的蛋白表达,与基因表达水平一致,在单个类卵泡结构中显示较强的荧光信号。2.2.2生长卵泡期的分子标志物分析另收集培养7-16天的分化细胞,检测了生长卵泡形成期间3种分子标志物表达的动态变化。23#含药血清诱导分化7、9、11天,均上调ZP1、ZP2和ZP3表达,并呈现时间依赖性。对23#含药血清诱导培养第11天的生长卵泡,检测了ZP1的蛋白表达,结果显示在单个生长卵泡结构的颗粒层与卵母细胞之间有较强的荧光信号。2.3补肾中药诱导的卵母细胞发育的形态学特征原始卵泡和生长卵泡期的卵母细胞为初级卵母细胞,具有减数分裂Ⅰ各期特征,为了证实含药血清诱导的初级卵母细胞形成的减数分裂Ⅰ特征,采用免疫荧光技术,应用β-actin染色细胞骨架,Hoechst33258染色减数分裂各期的核结构,以此鉴定被颗粒层包裹的类卵母细胞。结果显示,23#血清诱导分化7-16天的类卵细胞包括有卵原细胞和处于细线期、偶线期、粗线期的初级卵母细胞;在含药血清诱导分化过程中偶见处于双线期的卵母细胞。这从减数分裂前各期的形态学特