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关键词： 基因工程多肽   水凝胶   微凝胶   纳米水凝胶   组织工程   靶向生物成像  

摘要： 基于基因工程多肽(genetically engineered polypeptide)的水凝胶(hydrogel)作为一种新型的生物材料,具有优越的生物相容性和结构可调性,在生物医学领域中展现出广阔的应用前景。本论文主要包括多肽水凝胶的制备及作为支架材料用于三维(3 D)细胞培养和组织工程的研究;多肽微凝胶的制备及组装构建多孔水凝胶用于组织工程的研究;多肽PC10A(RGD)(P和A均为具有螺旋卷曲结构的序列,C10是一段无序的水溶性序列,RGD是精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的三肽序列)一荧光量子点(QDs)杂化纳米水凝胶的制备及用于靶向生物成像的研究;不同电荷的多肽分子作为表面配体用于QDs的修饰及其靶向生物成像的研究。具体工作如下：(1)设计并合成了一种基于卷曲螺旋多肽P和聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的光聚合物理水凝胶,作为支架材料用于3D细胞培养和组织工程的研究。多肽Pcys或RGDPcys与PEGDA通过迈克尔加成(michael加成)反应偶联构建光敏高分子单体P-PEG-acrylate/RGDP-PEG-acrylate。该单体在光引发剂I-2959和UV作用下形成光聚合物理水凝胶。水凝胶变性实验及流变检测结果均验证该类水凝胶为物理水凝胶。流变结果还表明该水凝胶具有较高的机械强度和可调谐性的弹性模量。该水凝胶还具有优良的溶胀性能和稳定性,如10%(w/v)水凝胶的溶胀率和稳定性分别是38%和15 d。愈合实验显示该物理水凝胶具有良好的自愈合特性,该特性可用于驱动介导微凝胶间的自组装。细胞毒性实验显示该水凝胶材料具有优越的生物相容性。细胞二维(2 D)表面生长实验表明多肽水凝胶材料可以通过改变多肽成分(如引入细胞整合素RGD)来调节水凝胶表面对细胞的粘附性能。3 D细胞培养实验结果显示,细胞可以在该物理水凝胶内保持较高的细胞活性,且在26 h之后可以自由伸展和迁移。这些实验结果都为多肽水凝胶在组织工程中的应用提供理论基础。(2)利用多肽物理水凝胶自愈合特性,以自下而上(bottom-up)的方式组装负载有细胞(cell-laden)的微凝胶(microgel)构建多孔水凝胶,并应用于组织工程研究。在(1)的基础上,合成光聚合物理微凝胶及cell-laden微凝胶。微凝胶表面多肽P间的动态自组装驱动介导微凝胶的组装构建多孔水凝胶。微凝胶的尺寸与形状可以通过光掩模调节控制,微凝胶的高度通过spacer(垫片)的高度来调控。此外,该微凝胶可以通过bottom-up和层层组装的形式进行组装。对比组装水凝胶和非组装水凝胶结构,发现组装水凝胶内的空隙大小与空隙连接性都远优于非组装水凝胶。组装水凝胶的多孔性非常适合营养成分及氧气的输送和代谢产物的排出,确保胶内深层细胞的高活性。3D细胞培养实验显示,细胞在微凝胶合成以及组装之后都能保持较高活性,并且在组装24 h后可以自由伸展。实验表明这种微凝胶的合成材料、合成方法及组装方法非常适合用于模拟构建“组织结构”。(3)PC1oA多肽纳米水凝胶(nanogel)作为载体包裹修饰疏水性荧光QDs,并应用于靶向生物成像研究。用“热变性-复性”方法处理低浓度多肽PC1oA水溶液制备PC1oA纳米水凝胶颗粒。透射电镜(TEM)结果显示,纳米水凝胶的尺寸可以通过多肽浓度来调控,尺寸范围从20nm到300nm。TEM和EDXS(能谱仪)实验结果表明,疏水性QDs可以均匀分散到纳米水凝胶内部,而且纳米水凝胶内的QDs负载量也具有可调性,但其具有一定饱和度。动态光散射分析显示纳米水凝胶具有良好的稳定性(大于20d),且在负载疏水性的QDs后,纳米水凝胶的稳定性稍有增加。荧光光谱分析表明,疏水性QDs被纳米水凝胶包裹转水之后,仍具有很好的荧光强度(量子产率QY=33.5%),且荧光强度随着pH值的增加而增强。MTT结果表明,单独的PC10ARGD纳米水凝胶对细胞无毒性,负载有适量疏水性QDs的PC10ARGD-QDs仍具有较好的细胞生物相容性,但是当QDs浓度超过PC10ARGD纳米水凝胶的负载范围时,PC10ARGD-QDs表现出较高的细胞毒性。激光扫描共聚焦成像表明,多肽纳米水凝胶PC10ARGD可赋予疏水性QDs良好的靶向性。因此,此种纳米水凝胶适合作为载体用于包裹修饰疏水性纳米颗粒,并赋予它们良好的生物相容性、水相稳定性和靶向性等特性,在细胞靶向成像领域内具有较大的应用潜能。(4)利用不同电荷的多肽分子修饰水溶性QDs用于肿瘤细胞的靶向生物标记。利用多肽A(带负电荷)、B(带正电荷)、ARGD和BRGD作为表面配体修饰CdSe@ZnS构建探针QD-A,QD-B,QD-BA(近中性电荷),QD-ARGD和QD-BRGD。琼脂糖凝胶电泳、粒径和zeta电位实验都证明不同电荷的荧光探针已被成功构建

关键词： 植物研究   基因工程  

摘要： 《植物研究》1959年创刊,是由东北林业大学主办,科学出版社出版的植物学专业刊物,是国内外公开发行的学术期刊。2006年变更为双月刊,后成为以植物分类、基因工程、植被生态、数量遗传学等为核心的多学科综合性学术期刊。其刊载内容为植物新种、分子生物学、基因工程、植物细胞学、植物化学、植物遗传学、植物生理学、群落生态学等基础理论研究方面

关键词： 转基因作物   超级杂草   转基因抗虫玉米  

摘要： 转基因作物的安全评价除了食用安全性之外,还要检验环境安全性,通过安全评价的转基因作物对环境是安全的。近来,有关种植转基因作物是否会引发环境风险的讨论主要聚焦在:转基因作物中的外来基因会不会随着花粉的传播而发生基因漂移,并将其传播到野生种群乃至其他物种。"墨西哥玉米事件"就是一例。一篇2001年11月发表于《自然》杂志上的文章,称在墨西哥南部地区采集

关键词： 大鼠   胚胎干细胞   自我更新   碱性成纤维细胞生长因子   bFGF  

摘要： 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是来源于囊胚期胚胎内细胞团的细胞。胚胎干细胞能根据细胞外不同的信号,分化成不同类型的细胞,因此成为了研究再生医学和人类疾病的强有力的工具。目前,尽管已经证明能从多个物种(包括小鼠、大鼠、人、猴等)中获取ES细胞,但只有小鼠和大鼠的ES细胞被证明能在体外培养条件下具有形成嵌合体动物和保持生殖细胞遗传能力。与最为常用的实验动物小鼠相比,大鼠具有个体大,实验操作方便等优势,因而被广泛的应用于生理学、行为学和药理学以及毒性测试等实验中。然而常用的小鼠ES细胞的培养条件无法分离培养获取大鼠胚胎干细胞,在小鼠中常用的基因敲除技术构建动物模型的方法在大鼠中无法实现,所以大鼠的应用受到了极大的限制。因而体外维持大鼠ES细胞的自我更新显得尤为重要。近年来的研究表明维持真正胚胎干细胞系的培养或许可以通过控制几个信号途径从而维持干细胞保持在一个未分化的状态。例如,小鼠胚胎干细胞在无饲养层培养条件下通过白血病抑制因子(Leukemia Inhibitor Factor,LIF)和两个小分子抑制剂2i(PD0325901和CHIR99021)的协同作用就能维持自我更新。同时LIF/2i的条件也可以维持大鼠ES细胞的自我更新,只是大鼠胚胎干细胞自我更新仍需要饲养层细胞的支持。饲养层细胞一般会分泌LIF、碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)等细胞因子。LIF可通过STAT3信号通路进而促进小鼠ES细胞的自我更新。bFGF主要对人胚胎干细胞的自我更新有促进作用。而人胚胎干细胞与小鼠Epiblast来源的细胞更为相似,被认为处于发育较晚的primed state。不过,最近多篇文献在尝试培养人以及猕猴na?ve iPSCs时发现bFGF信号通路对na?ve state胚胎干细胞也有调控作用。但饲养层细胞中分泌的bFGF是否能促进大鼠ES细胞的自我更新,这一问题并不清楚。本课题利用无饲养层细胞培养条件,在LIF加2I的基础上,对bFGF在大鼠ES细胞自我更新中的作用进行了探索,分析bFGF是否能调控大鼠胚胎干细胞的自我更新及其可能的下游信号通路。第一部分:bFGF调控大鼠ES细胞的自我更新将大鼠胚胎干细胞分别培养于含有或不含bFGF的无血清培养液中,通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光以及RT-PCR分析大鼠胚胎干细胞标志基因的表达和多能性。Western Blot检测bFGF对大鼠胚胎干细胞PI3K信号的激活作用。利用小分子化合物抑制bFGF激活的信号通路,观察bFGF信号通路激活或抑制后大鼠胚胎干细胞的生长状态。结果表明,在LIF加2I的基础上,bFGF能明显促进大鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下的自我更新。大鼠胚胎干细胞在此条件下能维持干性标志基因Oct-4,Nanog的表达,同时也保持了向不同胚层细胞分化的能力。Western Blot结果显示bFGF能促进PI3K的磷酸化,小分子化合物直接抑制bFGF或PI3K信号通路均能抑制bFGF对大鼠胚胎干细胞自我更新的促进作用。这些说明bFGF通过激活大鼠胚胎干细胞PI3K相关的信号通路促进大鼠胚胎干细胞自我更新。第二部分:无饲养层细胞条件下大鼠ES细胞的原代分离和培养将DA大鼠发育至4.5天的囊胚分离,在LIF+2i+bFGF和无饲养层的条件下培养,结果显示,LIF+2i+bFGF能维持囊胚生长并逐渐形成克隆和传代培养,而没有添加bFGF的条件下,囊胚没有形成明显的细胞克隆。结合第一部分的结果表明LIF+2i+bFGF不仅能维持已经建系的大鼠ES细胞自我更新,同时也能支持大鼠ES细胞的原代分离。通过研究,我们得出以下结论:首先,LIF+2I+bFGF这一培养条件可以维持大鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下的自我更新,LIF和bFGF对大鼠胚胎干细胞的自我更新均具有促进作用;其次,bFGF主要通过PI3K介导的信号通路促进大鼠胚胎干细胞的自我更新,抑制bFGF激活的PI3K信号通路能取消bFGF对大鼠胚胎干细胞自我更新的促进作用。

关键词： 转基因作物   专利保护  

摘要： 本文以转基因技术为背景,先介绍了对转基因作物专利保护的历史,再用一个假象的情景分析了对转基因作物实行专利保护的必要性,接着又以"鲍曼诉孟山都公司"这一案件为例,分析了在转基因专利保护中存在的几个备受争议的问题即:公司与农户之间、发达国家与发展中国家之间的博弈,最后简要地概述了我国现行的法律对于转基因作物的态度。在整个的论述过程中,在法学的基础上,引入了经济学的思考方法。

关键词： 转基因作物   安全性   伦理辩护  

摘要： 转基因作物是现代科技发展的产物,一定程度上解决了世界粮食缺乏问题,但也从伦理上对传统种植和生活观念带来了巨大冲击。针对这一棘手问题,应该运用专业的伦理学知识从道义论和后果论等角度对抓基因作物的伦理性进行辩护,并着重推动转基因作物由实质性伦理向程序理论研究推进,对转基因作物商业化开展的可行性进行合理预测,以期为转基因作物的安全性使用提供一定的理论依据。

关键词： 人胚胎干细胞   间充质干细胞   微囊泡   坐骨神经损伤   神经干细胞  

摘要： 目的探讨人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分泌的膜性囊泡(microvesicle,MVs)对SD(sprague-dawley,SD)大鼠坐骨神经损伤的修复作用,初步探讨其发挥作用的机制。方法1、超速离心法分离及纯化hESC-MSC-MVs,电子显微镜对其进行鉴定。2、建立SD大鼠坐骨神经压榨性损伤模型,应用坐骨神经功能指数(Sciatic nerve function index,SFI)和HE染色等方法评价hESC-MSC-MVs对大鼠坐骨神经损伤的治疗效果。实时定量PCR(Real-time PCR)检测hESC-MSCs和hESC-MSC-MVs与坐骨神经损伤修复相关的mi RNA。3、体外分离SD胎鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs),与hESC-MSC-MVs共培养,免疫荧光染色检测神经特异性标志GAP-43的表达并评价hESC-MSC-MVs对NSCs分化的作用。结果1、成功分离和纯化了hESC-MSC-MVs,通过电子显微镜观察了hESC-MSC-MVs的分泌过程。2、构建了SD大鼠坐骨神经压榨性损伤模型。神经损伤后第2周,与对照组相比,hESC-MSCs组和hESC-MSC-MVs组足印形态优于PBS组,hESC-MSCs组受损侧较正常侧仍有差异,hESC-MSC-MVs组损伤侧与正常侧足印相似。hESC-MSCs及hESC-MSC-MVs能够促使模型大鼠受损侧后肢形态恢复及再生神经纤维数量的增加,显著降低腓肠肌肌肉萎缩程度。Real-time PCR检测发现,hESC-MSC-MVs以及hESC-MSCs中含有miRNA-222、miRNA-125、miRNA-29b、mi RNA-29c,其中miRNA-222相对表达量最高。3、成功分离SD胎鼠的NSCs。hESC-MSCs及hESC-MSC-MVs都能够促使NSCs分化为神经元,神经突起较密而且长,而hESC-MSC-MVs作用效果更加明显。结论hESC-MSC-MVs对坐骨神经压榨性损伤有显著修复作用,修复机制可能与其能够显著促使NSCs分化为神经元,进而促使神经纤维的衔接有关。

关键词： 放线菌   宿主   天然产物   基因工程  

摘要： 微生物可以合成种类丰富、结构复杂的活性天然产物。然而,在许多情况下,这些次级代谢产物的产量较低,不利于产物的鉴定和新药的开发。随着功能基因组及基因工程技术的发展,微生物宿主的定向改造得以实现,通过简单的遗传操作,微生物就可以合成大量的目标产物,极大地加快了菌株改造的进程。本文主要对最重要的天然产物合成宿主——放线菌的基因工程研究展开介绍,并为放线菌的遗传操作提供全新的视角。

关键词： PAX6   真核表达载体   脂质体转染   胚胎干细胞   G418筛选  

摘要： 目的:构建眼发育关键基因PAX6的真核表达载体,初步探究其在真核细胞的表达,进而将PAX6基因转染入小鼠(m)ESCs并获得PAX6/mESCs稳株,为进一步探讨利用PAX6诱导ESCs定向分化为LSCs的可能性奠定基础,以期为角膜损伤提供种子细胞。方法:1.利用基因克隆技术获得PAX6基因并将其定向插入真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP中,获得重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP,脂质体转染法将重组质转染入293FT细胞中,倒置荧光显微镜观察细胞中GFP的表达、蛋白印迹法检测PAX6蛋白表达。2.胰蛋白酶消化法获得MEFs并进行体外扩增培养,绘制各代细胞生长曲线;用抗α微管蛋白加抗生物素蛋白-Cy5、抗鬼笔环肽-FITC、碘化丙啶(PI)分别对细胞的微管、微丝及染色体进行免疫荧光染色,对细胞进行细胞骨架分析;选择第3代MEFs用于制备饲养层,用三个不同浓度丝裂霉素C(10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)分别处理MEFs 1、2、3小时,MTT法筛选最佳处理条件;接种C57BL/6-mESCs于饲养层中进行扩增培养。3.稳定传代后的mESCs按0-800μg/ml8个浓度G418进行筛选获得最佳筛选浓度;Lipofectamine?2000转染试剂进行转染,设立未转染组、空质粒转染组及重组质粒转染组,转染24h后用200μg/ml G418结合GFP荧光进行筛选,100μg/ml G418维持培养,最终获得PAX6稳定表达的细胞株PAX6/mESCs;对转染后的细胞进行PAX6、GFP免疫荧光染色鉴定,Western-blot检测PAX6蛋白在mESCs内表达;AP染色鉴定转染后mESCs细胞干性。结果:***1α-PAX6-IRES-AcGFP经PCR和SalI/BamHI双酶切均得到大小为1269bp的条带,测序鉴定该序列与GenBank中PAX6基因序列的同源性达100%,插入基因的大小和方向正确;脂质体转染结果显示,重组质粒转染组293FT细胞内GFP表达,Western blot结果显示PAX6蛋白表达。2.胰酶消化法成功分离昆明小鼠MEFs,生长曲线结果显示P3-5细胞增殖能力较好;细胞骨架免疫荧光染色结果显示第1-3代细胞微管微丝排列整齐,5代以后的细胞微管微丝排列紊乱;10μg/ml丝裂霉素C处理2小时的饲养层细胞利于mESCs细胞的培养;3.200μg/ml G418为mESCs最佳筛选浓度;对转染后的细胞用200μg/ml G418结合GFP荧光进行筛选,获得PAX6稳定表达的细胞株PAX6/mESCs;PAX6/mESCs细胞内有GFP、PAX6荧光表达,Western blot结果显示在PAX6/mESCs中有PAX6蛋白表达,AP染色呈阳性。结论:成功构pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP并可在293FT细胞中的表达;成功制备饲养层MEFs用于mESCs培养;成功获得PAX6/mESCs稳株,且PAX6/mESCs在表达PAX6的同时并维持其干细胞的多能性,为进一步研究PAX6诱导mESCs定向分化奠定较好的基础。

关键词： RNA   复合物   基因组   选择性剪切   转录组   基因工程  

摘要： CRISPR-Cpf1结合crRNA的复合物晶体结构哈尔滨工业大学生命科学与技术学院黄志伟研究团队揭示了CRISPR-Cpf1识别CRISPR RNA(cr RNA)以及Cpf1剪切precr RNA成熟的分子机制,相关结果发表在《自然》杂志上。CRISPR-Cas系统是细菌编码的适应性免疫系统,该系统通过RNA引导的效应蛋白剪切病毒的DNA或者RNA从而抵抗病毒的感染。该系统之一的CRISPR-Cas9系统被用来作为可编程的基因编