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关键词： 转基因作物   农民   不发达国家   劳动者   生物技术作物   播种面积   种植面积  

摘要： 生物技术仅用了20年的时间,便取得100倍的增长。这让这项技术成为近年来发展最为迅速的农作物技术,也反映出农民对生物技术作物的满意程度。近期,国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)发布的一份报告,引起了大家的注意。这份关于转基因作物应用情况的年度报告——《转基因作物全球商业化20周年(1996年至2015年)纪念暨2015年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》显示,转基因作物的种植面积从1996年的170万公顷,上升至2015年的1.797亿公顷。生物技术仅用了20年的时间,

关键词： 高甲硫氨酸贮藏蛋白基因   同源克隆   启动子区克隆   基因工程  

摘要： 植物尤其是植物种子是人类和牲畜所摄食的蛋白质的重要来源,其营养品质往往由于部分必需氨基酸的缺乏而不够完全。禾本科作物种子蛋白质通常缺乏色氨酸和赖氨酸,而在豆科植物中,甲硫氨酸(methionine,Met)为第一限制性氨基酸。获取异源高Met蛋白(methionine-rich protein,MRP)基因,通过基因工程的方法提高贫硫植物尤其是豆科作物的Met含量具有重要意义。本研究通过同源克隆技术,从禾本科不同植物中克隆到MRP基因及芦苇MRP基因5’端启动子区,通过生物信息学分析,确定该MRP基因为贮藏蛋白基因;进一步将芦苇MRP基因转化大豆,并对转化再生大豆植株进行分子生物学检测和氨基酸含量分析。本文主要研究结果如下:1.从禾本科水稻、野生稻、芦苇、稗等不同亚科和属中分别克隆到一条长度为400-450 bp,高度同源的MRP基因,其编码的多肽序列中甲硫氨酸的含量均在10%以上,远远超过豆科等贫硫植物中甲硫氨酸的含量,也大大超过了WHO所规定的食物中甲硫氨酸的平均含量。2.多重序列比对及在线Blast比对结果显示本研究中克隆的MRP基因序列与其他高甲硫氨酸贮藏蛋白基因序列存在较高同源性,极有可能是种子贮藏蛋白基因序列。3.对该基因编码的氨基酸序列进行蛋白质二级结构、motif、3-D结构及贮藏蛋白特征性结构域的模拟,发现本文中克隆的基因编码的蛋白质也含有2S清蛋白、致敏结构域、转脂蛋白和蛋白酶/淀粉酶抑制剂等几种贮藏蛋白的特征性结构域,并且通过蛋白互作模拟发现可能与高粱、水稻和玉米等10 kD醇溶蛋白结构极为相似,这也说明本文中克隆的MRP基因序列应为贮藏蛋白基因序列。4.为了进一步确认上述MRP基因就是贮藏蛋白基因,本研究根据芦苇MRP基因编码区序列设计引物,用染色体步移的方法成功地从芦苇中克隆到该基因的5′端启动子区序列。对该序列的分析表明,本文克隆的芦苇MRP基因5′端启动子区不仅具有典型的Kozak(ACACC ATG)、起始子(CAT)、TATA盒(TATAAA)、CAAT盒(CCAAAT)和GC盒(GGCGGC)等启动子特征性元件,还有高度保守的种子特异性表达的顺式作用元件,如RY repeats、GCN4盒、Prolamin盒、E盒、ABRE盒、Skn-1基序、P盒、O2-site和GARE等。这说明本文克隆芦苇高甲硫氨酸蛋白基因即为种子中特异表达的贮藏蛋白基因。启动子区的多重序列比对的结果也为证明该序列为贮藏蛋白基因序列提供了重要佐证。对信号肽序列的比对结果表明,分子量相等的MRP信号肽序列近乎一致,这可能与种子形成过程中胚乳贮藏蛋白的合成及分泌途径有关。5.本文将芦苇MRP基因编码区与双元载体pBI121构建重组质粒pBI121-LW,然后通过液氮冷激法转化农杆菌,进而侵染大豆子叶节,经过暗培养、丛生芽诱导、发状根诱导后,进行炼苗长成新的植株。GUS组织化学染色、PCR检测、荧光定量PCR检测和抗性苗叶片氨基酸含量检测等结果显示,前期克隆的芦苇高Met贮藏蛋白基因已经顺利转入大豆抗性苗中,并得到成功表达。在不同抗性苗中,转LW-MRP基因大豆植株的甲硫氨酸含量有不同程度的提高,最高达到51.11%,甲硫氨酸含量提高的平均值达到27.81%。本研究克隆的MRP基因将进一步的丰富了富Met蛋白目的基因,也为以提高Met含量为目的的植物营养蛋白基因工程提供更多的目的基因的选择,同时也为同源克隆、批量扩增相关基因找到了一条简便易行的途径。MRP基因转化大豆的研究结果为下一步大豆品质改良的育种工作奠定了一定的基础,也为下一步开展基因工程改良贫硫植物蛋白质品质提供了理论支持。

关键词： Tfcp211   46C mESCs   自我更新   MTA1  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)可以在体外进行自我复制式的增殖(自我更新),并且同时保持着能够分化成有机体各种类型细胞的能力,因此胚胎干细胞ESCs在再生医学领域具有着广泛的应用前景。前期的实验我们已经发现了转录因子Tfcp211 (Transcription factor CP2-like 1,Tfcp211)是LIF/STAT3信号通路的关键下游的靶基因,Tfcp211表达水平的变化能够大大地影响LIF/STAT3信号通路促进小鼠胚胎干细胞(mouse ESCs, mESCs)自我更新的功能,但是Tfcp211作用的具体分子机制国内外尚无报道。是否存在对于mESCs自我更新至关重要的、全新的转录因子。截至目前,在众多已揭示的STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)下游靶基因中,只有下调Tfcp211的表达,才可以削弱STAT3信号促进mESCs自我更新的功能,从而诱导细胞分化,而至今鉴定出能够诱导mESCs分化的基因并不多。基于Tfcp211对mESCs自我更新的重要作用,结合本课题组多种高效的基因编辑工具,如慢病毒表达系统和PiggyBac Transposon系统等,有可能发现新的,并且对于维持mESCs未分化状态至关重要的基因。本课题通过初步筛选,发现MTA家族(包括MTA1,MTA2,MTA3)中MTA1和Tfcp211具有相互作用,其表达量的变化能够大大影响Tfcp211促进mESCs的自我更新能力。本课题具体的实验方案流程如下：首先是46C mESCs的培养,本课题所使用的46C mESCs,由剑桥大学Wellcome Truet Center研究所Austin Smith教授馈赠。46C mESCs培养在含有明胶包被的培养板里,培养基主要成分含有10%的胎牛血清和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),当细胞密度长至70%左右时,用胰酶进行消化。其次我们构建过表达Tfcp211的46C mESCs,主要分为以下几个过程：首先构建PB-Tfcp211载体：设计Tfcp211引物、获取目的基因Tfcp211、目的基因与PB-Tfcp211质粒的连接。构建好的载体即重组PB-Tfcp211空载体对照转化DH5a感受态细胞。挑取单克隆后扩大培养再抽提PB-Tfcp211质粒。得到PB-Tfcp211重组质粒的测序正确的,再使用脂质体转染法把PB-Tfcp211重组质粒转染46CmESCs,、此时过表达Tfcp211的46C mESCs构建完成,接着我们利用碱性磷酸酶(AP)染色和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法鉴定Tfcp211转入46C mESCs的过表达情况。过表达Tfcp211的46C mESCs构建成功后,我们再挑选过表达PB-Tfcp211的46C mESCs的单克隆细胞株,然后鉴定过表达PB-Tfcp211的46CmESCs单克隆细胞株在无LIF条件下的自我更新能力,使用的检测方法为AP染色和qRT-PCR。为了寻找Tfcp211促进46C mESCs自我更新的潜在相互作用蛋白,我们参照了Debbie L.C在期刊cell stem cell上面报道的关于Tfcp211蛋白免疫共沉淀的质谱鉴定结果。我们首先选取MTA1,MTA2, MTA3三者作为我们的候选基因来研究其是否与Tfcp211存在相互作用来促进46C mESCs自我更新。首先我们使用RNA干扰技术来对MTA1, MTA2,,MTA3三者的表达水平进行调控,即下调***2, MTA在46C mESCs中的表达,来看其是否影响46C mESCs自我更新能力。此时使用的46C mESCs均是Tfcp211过表达的46C mESCs单克隆细胞株。我们构建了MTA1,MTA2,MTA3的shRNA慢病毒载体：即针对Mta1、Mta2、Mta3三个基因设计RNA干扰引物,并重新连接至Plko.1-shRNA慢病毒载体。重组后的质粒Plko.1再转化DH5a感受态细胞,挑克隆扩大培养后进行重组质粒Plko.1-shRNA质粒抽提,测序鉴定正确的Plko.1-shRNA质粒用于下一步的病毒包装。病毒的包装使用Plko.1-shRNA质粒,包装细胞使用293FT细胞(其培养基的主要成分含有10%的胎牛血清)。转染使用的是lipofection LTX脂质体。病毒收取后感染Tfcp211过表达的46C mESCs。之后再使用AP染色和qRT-PCR鉴定Tfcp211过表达的46C mESCs的自我更新能力。最后使用免疫共沉淀技术鉴定Tfcp211和MTA1在mESCs中的相互作用。整个实验方案

关键词： 葡萄酒   高级醇   葡萄酒酵母   基因工程   糖代谢合成途径   氨基酸分解代谢途径  

摘要： 高级醇是葡萄酒中重要的风味物质,但含量过高会影响葡萄酒的风味和人体健康。本实验筛选出一株生长、发酵性能优良且高级醇生成量较低的出发菌株WY-1,将高级醇的氨基酸分解代谢途径(Ehrlich途径)和糖代谢合成途径(Harris途径)相关基因ILV2(编码α-乙酰乳酸合酶催化亚基)、ILV3(编码二羟酸脱水酶)、ILV5(编码乙酰羟酸还原异构酶)、ILV6(编码α-乙酰乳酸合酶调节亚基)、BAT2(编码细胞质支链氨基酸转移酶)和BAT1(编码线粒体支链氨基酸转移酶)进行敲除或者过表达,研究了改造这些基因对高级醇生成量的影响。(1)分析了 8 株葡萄酒酵母 WY-1,WY-2,WY-3,WY-4,WY-5,WY-6,VL1和QA23的高级醇生成量,并利用杜氏管发酵比较各菌株的耐受性,通过葡萄酒发酵比较各菌株的生长、发酵性能。结果表明WY-1高级醇生成量较低,为206.31 mg/L;且分别在乙醇体积分数16%、pH为2.65、葡萄糖浓度为400 g/L以及S02浓度为400 mg/L时都有很好的耐受性;生长速率较快、发酵性能较好,酒精度高于其他菌株,为11.01%(V/V)。筛选出了一株生长、发酵性能优良且高级醇生成量较低的出发菌株 WY-1。(2)针对Harris途径,分别对ILV2、ILV3和ILV5基因进行敲除,对ILV6基因进行过表达,获得了一系列重组菌株WY-V21、WY-V22、WY-V23、WY-V31、WY-V32、WY-V51、WY-V52、WY-V53和WY-V6。进行葡萄酒发酵,各重组菌株的生长、发酵性能均与出发菌株相差不大。发酵结果表明:与出发菌株WY-1相比,敲除ILV2三个等位基因的重组菌株WY-V23的正丙醇生成量提高了 38.46%,异丁醇生成量降低了 31.42%,异戊醇生成量降低了10.24%;敲除ILV3两个等位基因的重组菌株WY-V32的正丙醇生成量提高了 15.87%,异丁醇生成量降低了 22.76%;敲除ILV5三个等位基因的重组菌株WY-V53异丁醇生成量降低了 21.10%;游离过表达ILV6基因的重组菌株WY-V6的高级醇生成量没有差异。(3)针对Ehrlich途径,分别对BAT2和BAT1基因进行了敲除,获得了一系列重组菌株 WY-T21、WY-T22、WY-T11、WY-T12 和 WY-T22T11。进行葡萄酒发酵,敲除BAT1两个等位基因的重组菌株WY-T12的生长、发酵性能明显低于出发菌株,其他重组菌株与出发菌株相差不大。发酵结果表明:与出发菌株WY-1相比,敲除BAT2两个等位基因的重组菌株WY-T22的异丁醇生成量降低了 41.02%,活性戊醇生成量降低了 25.54%;重组菌株WY-T12正丙醇生成量提高了 37.57%,异丁醇生成量提高了 26.24倍,异戊醇生成量提高了 3.42倍,活性戊醇生成量提高了 2.61倍;敲除BAT2两个等位基因同时敲除BAT1 一个等位基因的重组菌株WY-T22T11正丙醇生成量降低了 19.52%,异丁醇生成量降低了 35.51%,活性戊醇生成量降低了 30.54%。

关键词： 骨肉瘤   miRNA-34a   原位肿瘤模型   细胞凋亡   细胞周期   重组RNA   骨肉瘤   miR-34a   多柔比星   联合化疗   原位肿瘤  

摘要： 第一部分：基因T程方法制备的miR-34a前药通过诱导凋亡与细胞周期捕获抑制骨肉瘤生长背景：骨肉瘤是发生在儿童及青年的最常见的骨科恶性肿瘤,microRNA-34a(下文简称miR-34a)是一种基于微小RNA的新型抗癌药物。我们最近开发了一种用来合成miR-34a前药新的生物工程方法。实验第一部分的目的即为了评估所制备的miR-34a前药在原位裸鼠骨肉瘤模型中的抑癌安全性及有效性。方法：在体外实验中,利用miR-34a转染骨肉瘤细胞系,细胞的增殖活性采用MTT实验来评估；肿瘤的侵袭及转移能力采用细胞基质侵袭小室实验来量化；细胞凋亡及各细胞周期细胞的分布情况均采用商业化试剂盒处理后流式细胞仪检测；miR-34a作用于肿瘤细胞的靶靶蛋白表达采用western blot来检测；体内实验中,我们采用骨肉瘤的原位种植模型来评估miR-34a的体内安全性及有效性,miR-34a先用商业化的in vivo-jetPEI(以后简称PEI)来混合均匀,再通过静脉注射入负荷肿瘤的裸鼠,定期监测肿瘤的大小,在实验的最后获取裸鼠的血液并检测血液肝功能、肾功能及相关生化指标。结果：与对照组相比,miR-34a可以显著地抑制骨肉瘤细胞系(143B与MG-63)在体外的生长情况,这种抑制作用存在明显的量-效关系；在相应的流式细胞仪检测中,可以观测到与细胞增殖实验结果相一致的细胞凋亡现象与细胞周期捕获现象。进一步western-blot实验表明,与细胞凋亡和细胞周期捕获的相关miR-34a靶蛋白如SIRT1, BCL2, c-MET,和CDK6都相应降低。在动物实验中,经过两周,共6次经尾静脉给药可显著抑制骨肉瘤的生长,实验结束时的生化检查也表明,治疗剂量的miR-34a静脉给药不会带来明显的毒副反应；结论：基因工程获得的miR-34a前药可抑制骨肉瘤生长,并且不会带来明显的全身毒副作用：可能机制为miR-34a可相对特异地诱导骨肉瘤细胞凋亡与细胞周期捕获。第二部分：联合应用基因工程制得的miR-34a前药与多柔比星可协同抑制骨肉瘤增长目的：第一部分结果表明,应用基因工程方法制取的miR-34a在体内和体外实验中均能抑制骨肉瘤细胞或者瘤体的生长。在第二部分的实验中,我们我们主要来验证miR-34a在骨肉瘤的治疗中是否与传统化疗药物多柔比星存在协同作用；方法：在体外实验中,运用Chou-Talalay方法设计miR-34a与多柔比星药物联用的多种组合模式,运用MTT法测定联合用药后肿瘤细胞的增殖活性,原始数据导入Compusyn软件并通过计算药物联用指数来了解两种药物是否存在协同作用；然后,利用细胞基质侵袭小室实验来评估药物对肿瘤的侵袭及转移能力的影响；细胞凋亡及各细胞周期细胞采用流式细胞仪检测;利用Western-Blot技术检测药物相关靶点的表达改变；在体内实验中,首先建立骨肉瘤的原位种植模型,然后将miR-34a单独或者与多柔比星联合系统应用于载瘤裸鼠,监测肿瘤的生长,在实验的最后获取动物血液标本进行药物安全性分析,并切取肿瘤标本进行病理学检查。结果：结果显示,miR-34a与多柔比星联合应用存在协同作用,这种协同作用在早期、同时给药时达到最大；与单一用药相比,二者联合用药都能更有效地抑制143B细胞细胞增殖抑制、细胞周期捕获以及细胞侵袭等；与这些细胞活动相对应的miR-34a靶点SIRT1,c-MET,与CDK6也都相应降低；在体内实验中,联合应用miR-34a及多柔比星时对肿瘤的抑制效果也明显优于单一用药；在药物安全性方面,经过两周的给药,小鼠的肝功能及肾功能均未见明显损害,体内总体蛋白水平也没有明显降低；结论：上述结果表明,联合应用miR-34a及多柔比星在细胞及动物体内试验均能达到一定的肿瘤抑制协同作用,在治疗剂量下二者联用不会产生明显的毒副作用。

关键词： 基因工程   淀粉   品质改良   途径  

摘要： 在人们的营养与能量来源中,淀粉是非常重要的一种物质,同时它也是工业生产中的重要原料。而在淀粉应用研究中,淀粉的加工、使用以及合成等,一直是非常重要的内容。淀粉是马铃薯块茎、粮食作物的种子以及植物块根组成的主要成分,其含有重要的多糖。因此,对基因工程改良淀粉品质进行了深入的研究,并从淀粉含量、淀粉质量等两个方面,详细地阐述了基因工程改良淀粉品质的主要途径。

关键词： 转基因粮食作物   中华人民共和国   基因工程   转基因技术   特朗普   媒体   希卡  

摘要： 01中国转基因食品政策英《经济学人》4月23日多年以来关于是否应该允许转基因粮食作物在中国大量种植的讨论一直不绝于耳。2013年,中国国家主席习近平在一次讲话中指出,中国的食品安全仍然面临很大挑战,中国需要掌握转基因技术的命脉。20年前,一些访问中国的欧洲科学家看到中国在转基因技术方面的巨大发展感到十分惊讶,当时他们为了申请几百平方

关键词： 乳腺癌   数据挖掘   生物信息学分析   肿瘤体细胞突变目录   癌症基因组图谱   转移性乳腺癌   游离DNA   数字PCR   基因组当量   疗效监测   转移性乳腺癌   循环肿瘤DNA   靶向捕获   高通量测序   疗效监测  

摘要： 无论从发达国家还是从发展中国家,无论从每年新发病例数量出发还是从每年死亡情况来看,乳腺癌都是威胁女性健康最常见的癌症。其中,转移性乳腺癌(Metastatic Breast Cancer, MBC)仍是不可治愈的疾病,治疗目的主要是为了减轻症状,改善生活质量和延长生存期。因此,为了避免无效治疗的持续、为了预防不必要的医疗毒性、为了明确治疗应答、合理搭配宝贵的医疗资源,筛选高灵敏并且强特异的生物标志物用于监测转移性乳腺癌患者治疗过程中肿瘤负荷的变化,具有重要的科学及社会意义。随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的深入研究,以及检测技术手段的快速发展,循环肿瘤标记由于检测的便利性和非侵入性正逐步取代受到标本采集以及无法连续监测追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记用于肿瘤治疗过程中反应的监测。如癌抗原15-3(CA 15-3)和循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTC)等标志物已得到广泛研究。随着“液体活检”概念的推广,携带有肿瘤特异性变异的循环肿瘤DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)逐渐被人们所重视,并成为肿瘤细胞生物学及分子生物学研究领域的热点和亮点。第一章基于数据挖掘技术的乳腺癌靶向外显子的筛选和验证背景：对于癌症来说,发生突变的基因仅占整个基因组的很小一部分,这表明只有有限数量的基因参与了某一类型癌症的发生和发展。因此,只有这些与癌症相关联的一组基因是监测治疗过程中肿瘤负荷变化所必需的。但遗憾的是尚无一种能够科学完整而又非常集约化的策略来明确这些与特定肿瘤类型相关的目标基因区域。目的：本部分拟基于生物信息学和数据挖掘技术筛选出与乳腺癌高度相关的目标基因区域,为后续的靶向捕获测序提供靶标,减少盲目性,节约实验成本,使检测技术的针对性更强,适用性更广。方法：从癌症基因组图谱库(TCGA)中963例乳腺癌患者中,随机选取776例作为训练集,剩余的187例作为预测集；基于肿瘤体细胞突变目录(COSMIC)数据库,筛选出乳腺癌相关基因突变所在的基因功能区域；用筛选出的潜在“靶向区域(Selector)",覆盖训练集中乳腺癌患者的遗传学改变信息进行；应用迭代算法使"Selector"在覆盖训练集中尽可能多的患者的同时达到尽可能的精简；使用生物信息学分析技术对"Selector"所涉及基因,进行KEGG pathway和Gene Ontology分析；最后通过预测集乳腺癌患者和临床生物标本对已筛选出的"Selector"进行覆盖度验证并优化完善。结果："Selector"共计包含了834个乳腺癌相关基因,961个外显子,23982049个单核苷酸变异(SNVs),134个Indels,52个Fusions,长度为118.24kb,遍布在所有编号染色体上。按照生物学过程分类："Selector"所涉及基因所属的GO-BP分类有1348个,最多的5种途径分别是：cellular component organization or biogenesis,cellular component organization,collagen catabolic process, single-organism developmental process和multicellular organismal catabolic process。按照细胞组件注释："Selector"所涉及基因所属的GO-CC分类有239个,前五位分别是:cell projection, cytosol, endoplasmic reticulum lumen, membrane region和cytoplasm。按照分子功能注释："Selector"所涉及基因所属的GO-MF分类有269个,前5种功能分别是：ATP binding, adenyl ribonucleotide binding, adenyl nucleotide binding, anion binding和extracellular matrix structural constituent.."Selector"所涉及基因可能参与调节的KEGG信号通路包括73条,前五位主要涉及黏着斑、子宫内膜癌、小细胞肺癌、阿米巴病和促性腺激素释放激素信号通路。"Selector"在训练阶段可以覆盖100%的乳腺癌患者,预测集验证阶段亦可以覆盖高达88.7%的乳腺癌患者,平均识别每位患者2个及以上SNVs。40例独立转移性乳腺癌患者不同治疗阶段的72份生物标本验证结果显示,该区域可以覆盖100%的患者和生物标本。结论："Selector"有效的将乳腺癌相关的靶向测序区段浓缩至整个基因组大小的3.7/10万,使得后续深度测序得以实现,为后续研究提供了靶标,减少了实验测

关键词： S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)   一氧化氮(NO)   胚胎干细胞(ES细胞)   亚硝基化   蛋白质组学   过氧化物还原酶(Prdx)   过氧化氢(H2O2)   磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)   X-box binding protein(XBP)  

摘要： 胚胎干(Embryonic Stem, ES)细胞是全能性干细胞的典型代表,其心肌分化过程可以用来研究心肌发育过程,而其分化而来的心肌细胞可以作为细胞治疗的供体或作为药物筛选平台。近年来,一氧化氮(Nitric Oxide, NO)作为一种气体信号分子,成为基础生物学、生物医学及转化医学领域的明星分子,在逐步揭开其生理作用的同时,围绕其进行的临床研究也取得了丰硕的成果,开发出了多种药物和治疗方法,为人类健康做出了重要贡献。由于在几乎所有人体组织中都有NO合酶(NOS)的表达,而且NO在干细胞增殖分化、表观遗传学调控和免疫反应等方面都发挥重要作用,所以NO必然和干细胞基础研究及临床应用有着密切的相关性。本研究论证了NO供体S-亚硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione, GSNO)短时间处理可以通过亚硝基化作用促进心肌分化。亚硝基化修饰是指NO基团与蛋白质巯基,尤其是半胱氨酸上活性巯基的结合,可以发挥多种生物学功能,如调节蛋白质稳定性、反应活性,干扰蛋白质间相互结合以及细胞内定位,甚至与其他种类翻译后修饰竞争等。GSNO作为体内广泛存在的亚硝基硫醇类NO供体,是NO在体内的主要承载体,也是细胞内蛋白质亚硝基化修饰功能的主要承担者。在心脏中,GSNO是一种内源性保护性物质并且可以对多种蛋白进行亚硝基化修饰,对于心肌组织中多种离子通道、酶类发挥正常功能,维持心肌细胞内氧还平衡等至关重要。那么,研究GSNO在干细胞心肌发生中的作用有着非常重要的价值,将有可能对再生医学和心肌修复领域提供有意义的参考。至今为止,绝大多数关于NO在干细胞生物学方面的研究集中于sGC/cGMP途径,而忽视了对蛋白亚硝基化可能发挥的作用。亚硝基化修饰靶点多样,功能各异,在干细胞心肌分化过程中可以发挥何种作用值得探究。在本研究中,发现短时间GSNO处理ES细胞衍生的拟胚体(Embryoid Body,EB)可以提高心肌细胞分化率,并阐明亚硝基化在这一过程中发挥的关键作用。通过定量亚硝基化蛋白组学和生物信息学分析,发现Prdx-2的亚硝基化可以导致过氧化氢(H202)积聚并启动X-box binding protein-1s/PI3K/AKT信号通路,最终促进了心肌细胞的分化。这些发现对干细胞分化的调控提供了新的认识,并对再生医学和诱导多能干(iPS)细胞治疗提供了有益的借鉴。一.S-亚硝基谷胱甘肽促胚胎干细胞心肌分化及亚硝基化蛋白组学目的：探索GSNO对小鼠ES细胞心肌分化的影响,同时论证GSNO起作用的方式。方法和结果：采用悬滴、悬浮、贴壁三步法诱导心肌分化体系,在形成EBs后,对EBs进行2h的GSNO处理,然后继续贴壁培养并考察心肌分化情况。结果发现,25μM GSNO处理可以显著提高贴壁培养3d后EBs搏动率和心肌特异蛋白a-actinin表达,免疫荧光也显示GSNO可以诱导形成结构完整的肌小节结构。通过亚硝基化还原剂DTT、sGC抑制剂ODQ和GSNO合用,发现DTT可以拮抗GSNO的促心肌分化作用,而ODQ不能拮抗,说明GSNO的促分化作用是依赖于其亚硝基化作用。继而采用氨基酸稳定同位素标记(Stable Isotope Labeling with Amino Acidsin Cell Cultures, SILAC)法对细胞进行同位素标记,然后在GSNO处理后提取亚硝基化蛋白,通过质谱检测GSNO处理导致亚硝基化蛋白靶点并定量分析亚硝基化程度,通过生物信息学分析对亚硝基化蛋白进行分类。GSNO处理后,发现104个亚硝基化上调蛋白,其中既具有酶活性又与氧还平衡密切相关的Prdx家族1和2型蛋白亚硝基化分别上升2.66和3.06倍,是被亚硝基化程度较高的蛋白。结论：GSNO可通过蛋白质亚硝基化作用促进心肌分化,明确了104个蛋白亚硝基化靶点,通过蛋白功能分类,选择亚硝基化修饰程度高,同时既具有酶活性又与氧还平衡密切相关的Prdx-1,2为后续论证的候选靶蛋白。二. Peroxiredoxin-2亚硝基化促进心肌分化机制研究目的：探索Prdx-2亚硝基化在GSNO促心肌分化中的作用方法和结果：首先对质谱结果进行免疫印迹确认,发现相对于Prdx-1, Prdx-2是拟胚体时期高表达的Prdx类型;继而考察GSNO处理后,Prdx-2底物过氧化氢(H202)含量变化情况,发现GSNO处理后,EB内H202积聚,而前体超氧阴离子(02·-)并没有增加。同时发现p38 MAPK并没有被GSNO激活,而PI3K/Akt信号通路被激活。通过对P13K不同亚基的检测,发现p-p85 PI3K亚基在GSNO处理后,在胞浆胞核的含量发生变化,更多地聚集在胞浆中,同时与p110 PI3K亚基结合上升,激活P13K通路。对p85 PI3K亚基入核分子伴侣XBP-

关键词： 转基因   认知度   襄阳  

摘要： 为了考查襄阳市公众对转基因作物的认知度,文章通过对襄阳市194位公众进行问卷调查,以此来了解襄阳市公众对对转基因作物的认识情况,并为后期转基因作物的发展提供理论依据。