关键词：
脱细胞支架
生物材料
去细胞化
再细胞化
胚胎干细胞
肾脏再生
摘要：
随着慢性肾功能不全发病率的逐年增高,终末期肾病(ESRD)已经成为严重困扰公众的社会问题。目前对于ESRD的治疗方式主要有两种：血液透析及肾脏移植。血液透析容易引起较多的并发症且效率较低,长期治疗效果较差,容易给患者带来较大的痛苦以及经济负担。而肾脏移植能够完整替代肾脏的功能,但是存在肾源短缺严重以及严重的免疫排斥反应问题。干细胞与肾脏再生医学的发展为这一难题带来了新的希望。其中细胞-脱细胞支架技术的发展成为近年来肾脏再生领域研究的热点。所谓细胞-脱细胞支架技术是指将动物天然肾脏进行去细胞化,获得无细胞的肾脏细胞外基质(ECM)—肾脏脱细胞支架,然后应用干细胞或者成体细胞对脱细胞支架进行再细胞化,进行体外或体内培养后,获得有功能的再生肾脏。肾脏细胞种类复杂,因此,选用合适的干细胞在支架内进行分化,是选择种子细胞的依据。胚胎干细胞是一种多能干细胞,拥有强大的增殖能力与分化能力,且在体外已能够向肾脏细胞系分化,是一种良好的种子细胞。本研究拟采用胚胎干细胞,对肾脏脱细胞支架进行再细胞化,获得有功能、可移植的肾脏。第一部分 肾脏脱细胞支架的建立与生物学特性的检测目的建立快速有效的脱细胞支架流程,获得适合细胞种植的肾脏脱细胞支架。方法：1.肾脏的获取：实验动物选择雄性Wista大鼠,体重在200-300g之间。应用10%水合氯醛麻醉后,取腹正中切口,暴露腹主动脉,应用24G套管针插入,将肾脏血液冲出,然后取出肾脏。2.脱细胞支架的制备：应用0.5%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液以及蒸馏水对肾脏进行持续灌注,速度为0.5ml/min,肾脏变为白色半透明时换PBS溶液冲洗,将残留的SDS溶液冲洗干净。3.脱细胞支架鉴定：(1)形态学及免疫学检测：应用HE以及Masson染色检测的方法鉴定脱细胞支架中细胞去除情况。应用免疫组化检测肾脏脱细胞前后Ⅳ型胶原及纤连蛋白的表达情况。扫描电镜检测显微结构保留情况。(2) 分子生物学检测：应用DNA及胶原检测试剂盒检测肾脏脱细胞支架中DNA及胶原的含量;应用ELISA的方法检测脱细胞支架中HGF、TGF及VEGF的含量。(3)血管系统检测：应用血管造影的方式在体外检测血管系统的完整性;将肾脏脱细胞支架原位移植到大鼠体内,进一步检测其通畅性及严密性。结果：1.大体观：肾脏经过SDS及双蒸水灌注后,逐渐变为白色半透明状。***及Masson染色：显示细胞成分去除彻底,仅剩胶原成分。3.免疫组化：显示脱细胞支架中Ⅳ型胶原以及纤连蛋白保留较好。4.扫描电镜显示肾小球的基底膜等膜性结构保留完整。5.分子生物学检测：DNA含量在脱细胞之后低于正常的5%以下;胶原含量在脱细胞前后变化不明显;HGF、TGF以及VEGF等细胞因子的含量变化不明显。6.血管系统检测：血管造影显示肾脏血管系统保留完整,无造影剂漏出,血管分支结构显示清楚。脱细胞支架原位移植血管夹放开后,血液运行通畅,无明显漏出。HE显示血液充盈到肾脏内部,2月后形成血栓及炎性细胞浸润。结论：应用SDS等脱细胞剂及自制设备灌注大鼠肾脏,能够获得完整的肾脏脱细胞支架,建立了有效的肾脏脱细胞支架制备流程。第二部分 肾脏脱细胞支架的再细胞化及再生肾脏的功能鉴定目的：应用胚胎干细胞对肾脏脱细胞支架进行再细胞化,获得有一定功能、可移植的肾脏。方法：1.种子细胞选用小鼠胚胎干细胞,在体外进行培养,应用免疫组化检测干细胞标志物,如***等干细胞标志物,以确保其在细胞种植之前保持干细胞特性。2.将胚胎干细胞消化、收集,调整其细胞浓度至1×107/ml。经肾动脉灌注3ml,在-50cmH2O负压下经输尿管灌注3ml。静置过夜,连续灌注2天。3.再生肾的培养：肾脏脱细胞种植再细胞化后,通过自制灌注设备,应用DMEM/F12培养基进行循环灌注培养,温度37℃,连续培养7天。4.再生肾的鉴定：再生肾脏经过体外培养后,进行HE染色鉴定;体外制备改良的Hank‘s液,进行功能鉴定;将再生肾脏移植到大鼠体内,收集静脉血及尿液,进行肾脏功能的体内测定。结果：1.胚胎干细胞经过鉴定,***以及SOX2等干细胞标志物表达良好,表明其干细胞特性保持较好。2.经过细胞种植以及再生肾脏体外培养,肾脏脱细胞支架的肾小球部位以及部分肾小管部位有较多细胞贴附。3.经过功能测定,再生肾脏较脱细胞支架产生尿液(1.8±0.7ul/min vs 4.9±1.4ul/min)更少,但其中排出肌酐(1.4±1.4mg/dl)以及尿素氮(26.5±1.6mg/dl)较脱细胞支架更多。结论：胚胎干细胞为良好的肾脏组织工程种子细胞,经过再细胞化,获得了有一定形态结构及功能、可以移植的再生肾脏。
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