关键词：
干酪乳杆菌噬菌体
基因组
基因工程
启动子
复制子
摘要：
乳酸菌(LAB,lactic acid bacteria)是革兰氏阳性兼性厌氧细菌,能大量发酵碳水化合物并产生乳酸,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌,因其不具有致病性及其在食品工业领域中的长期应用,被公认为安全级(GRAS,generally recognized as safe)微生物。噬菌体是细菌病毒的总称,对乳酸菌噬菌体的研究在过去十年虽有显著进展,但仍落后于其他细菌噬菌体的研究。特别是在乳酸菌噬菌体功能基因的挖掘上相对滞后,这也是制约乳酸菌噬菌体在实践中应用的主要因素之一。本研究以干酪乳杆菌为宿主菌,利用双层琼脂法从酸菜制品中进行了乳酸菌噬菌体的分离纯化。实验结果显示,分离纯化获得的乳酸菌噬菌体phage LJ为多面体头部,直径约37.9nm,非收缩柔软可弯曲的尾部长约216.83nm,根据形态将其归为Siphoviridae科B1类。该噬菌体基因组不含粘性末端,其包装机制属满头包装,即pac-型。在进行噬菌体感染特异性研究中,将戊糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌和干酪乳杆菌分别与phage LJ混合培养,观察其对不同宿主细菌的裂解情况,结果显示,噬菌体仅感染干酪乳杆菌,不感染其它几种乳酸杆菌,说明分离的噬菌体具有较强的宿主特异性。在裂解菌体的效力上,当噬菌体感染复数MOI=0.01时,噬菌体phage LJ效价最高可达1010 PFU/mL,裂解量为121 PFU/cell。噬菌体稳定性和吸附性检测结果显示,噬菌体对不同温度的敏感性表现不同,37℃处理60min不能灭活phage LJ;45℃处理15min、56℃处理3min均可使90%的phage LJ被灭活;63℃以上处理2min后,检测不到活的噬菌体颗粒。在噬菌斑形成特性上,其合适的温度是32℃,而在37℃时,不能形成噬斑。为深入挖掘分离噬菌体phage LJ基因组中相关功能基因的特征,利用噬菌体保守序列进行了噬菌体基因组全序列的扩增,设计了 8对引物,每对引物扩增序列约5000bp。PCR产物经测序拼接,获得了噬菌体全基因组序列44348bp。基因组中GC含量为44.78%,共有65个开放阅读框,其中57个具有功能注释。通过基因进化树分析,该噬菌体与鼠李糖乳杆菌噬菌体Lrml和干酪乳杆菌噬菌体A2的基因组同源性最高,其中基因组核苷酸序列同源性分别为72%和74%。phageLJ基因组中功能相关的基因排布在一起形成不同模块。分别为噬菌体的头部、尾部、复制、裂解和包装的模块,且与鼠李糖乳杆菌噬菌体Lrml和干酪乳杆菌噬菌体A2的基因组功能基因模块排布顺序相似。在预测分离噬菌体phage LJ结构基因的基础上,扩增获得了 phage LJ 8个结构基因的启动子序列,分别为噬菌体头尾结合蛋白(HK1)、噬菌体衣壳蛋白(HK3)、噬菌体病毒粒子蛋白(HK2)、噬菌体尾蛋白(TTM)、噬菌体头尾结合蛋白(PT)、噬菌体粒子蛋白(PPP)、噬菌体主要尾蛋白(MTP)和噬菌体核蛋白(ET)。另外,利用生物信息学方法预测获得了噬菌体phage LJ的8个启动子序列,分别是35800、15700、17600、24300、33300、43200、Flpa和Sigma。本实验共扩增了 16个序列进行了启动子活性功能验证,结果表明,结构基因启动子均具有启动蛋白表达的功能活性,其中启动子HK-]、HK-3、TTM和ET具有较好的启动功能,而软件预测获得的8个启动子序列并不全部具有启动活性。其中35800、Flpab和Sigma具有较强的启动子活性,能显著提升蛋白表达水平,而另外的5个预测序列没有启动活性。此外,本研究选择鉴定的弱启动子ET及强启动子Sigma,以EGFP作为模式抗原,构建重组乳酸菌表达系统,经流式细胞术、Western blot、间接免疫荧光等方法进行进一步的表达验证。结果显示,启动子Sigma的启动活性显著强于ET启动活性,与前述鉴定结果相符。噬菌体复制模块基因包括单链结合蛋白(SSB)、噬菌体解旋酶(DnaB和DnaC)等基因,PCR扩增获得噬菌体SSB、DnaB和DnaC等复制相关的基因,构建到乳酸杆菌表达载体pPG612质粒上,使pPG612质粒同时具有RepA和RepC两个复制蛋白,使其增加噬菌体复制相关基因,即单链结合蛋白(SSB)和解旋酶(DnaB和DnaC)。以质粒上的氯霉素抗性基因为实时荧光定量的靶基因,以乳酸杆菌基因组16sRNA基因为内参基因。以含有质粒pPG612的乳酸菌为对照组,实验结果表明含有噬菌体复制基因的质粒拷贝数升高,细菌培养14h后质粒拷贝数相对提高量比值最大为14.8。当14h后质粒拷贝数开始下降,22h后细菌质粒拷贝数最低。本研究获得了 7个具有中等强度的乳酸杆菌质粒
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