关键词:
表观遗传
DNA去甲基化
5-羟甲基胞嘧啶
HMCES
肽酶
晶体结构
DNA损伤
重组修复
RecT
纯化
晶体筛选
摘要:
1.人类胚胎干细胞5-羟甲基胞嘧啶识别蛋白HMCES的结构初探表观遗传学修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等,其中DNA甲基化研究的最为深入。由于在甲基化以及去甲基化过程中的重要作用,5-甲基胞嗡啶(5mC)被称为第五种碱基,5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)被称为第六种碱基。5mC被TET酶进一步氧化为5hmC后,HMCES作为一个5hmC识别蛋白,能通过结合5hmC从而招募下游蛋白发挥功能,最终将5mC转换为普通的胞嘧啶。在这个过程中HMCES有肽酶活性,能通过自剪切来调控下游信号。这也是其独特之处。本实验首先在体外克隆了HMCES的全长基因,构建了HMCES-MBP与HMCES两个载体,然后通过原核表达系统在体外进行了表达鉴定。我们首先对HMCES-MBP进行了纯化,发现蛋白在TEV酶酶切之后降解消失,因此我们又针对性地对HMCES的表达进行了优化,发现了HMCES的持续性降解现象。通过质谱分析、二级结构预测等手段找到HMCES稳定的酶解片段HMCES-276之后,我们对HMCES-276又重新进行了克隆、表达与纯化。在解决了HMCES-276的聚合问题之后,经过多次优化,通过晶体初筛最终得到了晶体,下一步衍射收到数据之后,即可通过结构解析揭示其功能基础,后续的工作正在进展当中。2.大肠杆菌单链DNA结合蛋白RecT的表达纯化外界环境和细胞内部的诸多因素经常会导致DNA分子的损伤或改变。为了应对DNA损伤,减小对细胞的影响,细胞在长期进化过程中,形成了多种DNA损伤的修复系统,包括光复活修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、重组修复、SOS修复、双链断裂修复等多种修复方式。其中重组修复途径在真核生物与原核生物中是不同的。在原核生物中,主要是通过Rec蛋白系列完成的,包括:RecABCD, RecFOR及RecET。RecT存在于大肠杆菌中,通过结合单链DNA,与RecE互相作用来促进互补的ssDNA复性。对于该部分的工作,我们试图通过结构生物学的方法阐明RecT促进ssDNA复性的结构基础。我们首先采用原核表达系统,对RecT进行体外克隆以及表达纯化,但晶体筛选之后并没有得到晶体。我们又对初筛过程进行了优化,分别加入了稳定RecT的Mg2+以及RecT的底物ssDNA孵育,仍然没有长出晶体。此时我们转换思路,尝试对RecT的截短片段进行研究。我们分别克隆了RecT的两个截短片段,但在纯化过程中发现,只有RecT (94-C)可以稳定表达,随后对RecT-C片段进行了晶体筛选,目前后续的优化正在进行中,以期能拿到晶体通过X射线衍射晶体学的方法解析RecT结构,揭示其是如何发挥功能的。