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关键词： Brazzein   Gnd＿v2融合标签   TEV剪切酶   蛋白表达   超滤纯化  

摘要： 甜味蛋白布那珍(brazzein)是从西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的果实中提取的天然甜味蛋白,以其高达蔗糖500至2000倍的甜度和极低的热量著称,使其成为糖尿病患者和减肥人群的理想替代品。这种54个氨基酸组成的蛋白质,因其在不同的p H和温度下的高稳定性,在食品和饮料行业中有巨大应用潜力。但由于该西非植物不能广泛种植,限制了brazzein的商业化。本研究利用基因工程的方法,试图实现brazzein在大肠杆菌内的可溶表达。本研究将密码子优化的brazzein序列克隆在p ETDuet-1载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,发现其表达量极低。为了解决这一问题,本研究提出了两种解决办法,首先对宿主菌株BL21(DE3)进行基因组的编辑,构建了宿主菌株BL21(DE3)的生长与目的蛋白的表达解耦联的系统,将T7噬菌体衍生的2 gene、5.7 gene(大肠杆菌RNA聚合酶抑制基因)整合到大肠杆菌BL21(DE3)基因组中。利用这个策略使大肠杆菌生长与生产分离,经荧光蛋白(RFP)验证,RFP在菌株生长与蛋白表达生产解耦联的系统中的表达量是亲本菌株BL21(DE3)表达量的1.8倍,但brazzein表达量极低。其次,为了实现brazzein在大肠杆菌内的表达,本研究引入一个高度可溶的标签Gnd(6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)并优化其序列得到Gnd＿v2可溶标签,用来提高brazzein的可溶性表达。本研究将Gnd＿v2与brazzein融合表达,将其克隆到p ACYCDuet-1载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并且与常用的可溶标签小泛素样修饰物(SUMO)和翻译起始因子(Inf B)进行对比,经image J(1.54D)分析,Gnd＿v2＿brazzein可溶表达量约是Inf B＿brazzein的2.2倍,约是SUMO＿brazzein的2.1倍。此外,本研究在烟草蚀刻病毒蛋白酶TEV的基础上进行突变,设计了突变体TEV Max,用作分离brazzein与Gnd＿v2标签,TEV Max实现高效率切割P1'位点为谷氨酰胺残基的Gnd＿v2＿brazzein融合蛋白。本研究基于构建的高brazzein表达体系和TEV酶的高剪切效率,构建了基于超滤的brazzein纯化方法。纯化的TEV酶和brazzein的裂解上清混合物经4℃,16 h反应后,先用30 k Da的膜超滤初步纯化,再用10 k Da的膜二次超滤纯化,两步超滤纯化后brazzein纯度大于90%。利用标准的甜度双盲法测定brazzein的甜度,按质量计算,brazzein的甜度约是蔗糖的2500倍。本研究基因基因工程方法,利用融合蛋白实现brazzein的高可溶表达,构建了具有广谱剪切能力的TEV Max酶。结合以上两个改造,实现了表达纯化的一体化,摇瓶发酵产量约为1.5 mg/L,为未来甜味蛋白brazzein的高效合成与工业化生产奠定了基础。

摘要： rhBMP-2定量的骨修复材料[结构特征]以重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)为原料,以药用明胶、大豆磷脂及羟基磷灰石为载体材料复合而成。[作用机理]通过填充骨组织缺损、发挥骨诱导作用,“促进骨和软骨的生成”,达到组织修复,并在体内可被降解吸收。[应用范围]用于骨缺损、骨不连、骨延迟愈合或不愈合的填充修复以及脊柱融合、关节融合及矫形植骨修复。[禁忌症]1、有严重心、肾功能不全、肝功能损害及造血功能障碍者禁用;2、有严重肿瘤史者禁用;3、需要全身联合应用糖皮质激素者慎用;4、代谢性骨病患者慎用;5、妊娠、哺乳期妇女、儿童慎用。

关键词： 基因工程抗体   呕吐毒素   玉米赤霉烯酮   免疫层析   双特异性抗体  

摘要： 玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）是粮食中常见的真菌毒素,对生物体具有生殖毒性和遗传毒性等,因而建立快速检测方法限制受真菌毒素污染的粮食流入市场十分必要。基因工程抗体作为三代抗体,能够克服传统抗体制备的限制,实现高效制备,有效定向改造进化,可广泛地应用于免疫快速检测中。 大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115、哺乳动物细胞Expi293F作为成熟的重组蛋白表达体系,广泛应用于基因工程抗体的制备中。本文以3种表达系统制备了ZEN和DON的单特异性和双特异性抗体。基于单特异性抗体构建胶体金免疫层析方法并应用于粮食谷物检测,基于ZEN和DON双特异性抗体构建同步免疫检测试剂盒,实现ZEN和DON的同时定量检测。 本文的主要研究内容如下: （1）大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115表达系统的评价。从NCBI库获取DON和ZEN抗体可变区的基因序列（NCBI登录号:AAC53026.1,AAC53027.1;Y151141,AY151140.1）,将重链可变区和轻链可变区用（Gly4Ser）3连接构建单链抗体（single chain antibody,sc Fv）,并分别于大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中表达。结果表明,大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115表达的ZEN单链抗体（ZEN-sc Fv）均有活性,而DON的单链抗体（DON-sc Fv）对抗原均无识别活性。基于大肠杆菌BL21表达产物建立的酶联免疫吸附检测方法（Enzyme-Linked immunosorbent assays,ELISA）标准抑制曲线方程为Y=-0.009752X+1.275（R2=0.9735）,IC50为79.47 ng/m L;基于毕赤酵母GS115的表达产物的ELISA标准抑制曲线方程为Y=-0.01045X+1.218,R2=0.9585,IC50为68.71 ng/m L。 （2）基于Expi293F哺乳动物细胞表达的ZEN和DON sc Fv、全长抗体（Immunoglobulin G,Ig G）以及双特异性单链抗体的评价研究。基于载体p CMV和p TT5,Expi293F细胞瞬时表达获得了ZEN和DON的sc Fv、Ig G、双特异性单链抗体,且基于p CMV载体表达产量更高。基于ZEN-sc Fv和ZEN-Ig G构建ELISA方法检测灵敏度分别为6.46 ng/m L和6.27 ng/m L;基于DON-Ig G和DON-sc Fv构建的ELISA方法灵敏度分别为140.35 ng/m L和69.01 ng/m L。双特异性单链抗体Bis-sc Fv对ZEN和DON具有结合活性,基于其构建的ELISA方法对ZEN和DON灵敏度分别为20.64 ng/m L和132.29 ng/m L,且具有较强的特异性。 （3）基于基因工程抗体构建免疫检测方法。基于ZEN-Ig G,构建了检测谷物中ZEN的胶体金免疫层析方法,其视觉检测限为60 ng/m L,经HPLC方法学验证,该方法就有良好的准确性;基于双特性单链抗体建立双联酶联免疫检测方法,其ZEN和DON的定量范围分别为1 ng/m L～100 ng/m L和10 ng/m L～500 ng/m L,线性方程分别为Y=-0.4028Lg X+0.9614(R2=0.9467,IC50为13.98 ng/m L)和Y=-0.5275Lg X+1.585(R2=0.9681,IC50为113.99 ng/m L),该方法对玉米粉中的ZEN和DON的加标回收率为86.02%～108.14%,相对偏差小于15%。 综上,基于大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和哺乳动物细胞Expi293F三种宿主生物成功表达了ZEN和DON的单特异性抗体以及双特异性抗体,并基于哺乳动物细胞Expi293F表达抗体构建快检方法并实现应用,为高效的抗体制备和应用研究奠定了基础。

关键词： 脊髓损伤   NEP1-40   神经干细胞   慢病毒载体   透明质酸水凝胶生物支架  

摘要： 目的1.构建NEP1-40基因慢病毒载体修饰神经干细胞(Neural stem cell,NSC),验证其增殖分化潜能以及对背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞轴突生长的调节作用;2.通过检测Rho/ROCK信号通路关键调控蛋白的表达,明确NEP1-40-NSC促进轴突再生的机制;3.通过3D打印技术构建透明质酸(Hyaluronic acid,HA)水凝胶支架,检测其物理性能、细胞负载潜能以及对NEP1-40-NSC分泌能力的影响,探究NEP1-40-NSC联合HA支架促进轴突再生的可能,为SCI修复和轴突再生的基础研究提供新的思路。 方法***1-40基因慢病毒载体的构建:从基因库检索大鼠NEP1-40基因序列,通过PCR对基因序列进行扩增;连接目的基因与线性化酶切载体后转化DH5α感受态细胞;测序验证结果为阳性的克隆菌落;将构建好携带目的基因的质粒与两种病毒包装辅助质粒共转染293T细胞;收集含慢病毒颗粒的细胞上清液并进行纯化浓缩,测定病毒滴度后-80℃分装保存。***的培养、分化及鉴定:从E18天SD大鼠(孕)的胎鼠大脑皮质分离原代NSC进行培养,稳定培养后行CCK8增殖检测和Nestin免疫荧光染色鉴定;诱导分化后,行β-TublinⅢ、GFAP及MBP免疫荧光染色鉴定其分化潜能。***1-40基因慢病毒转染NSC分化及表达检测:设置NSC组、空载病毒(aSV-NSC)组和NEP1-40慢病毒(NEP1-40-NSC)组,按最适MOI值进行NSC转染,通过CCK8法检测细胞增殖情况,转染72h后进行Nestin荧光鉴定。诱导分化3、5、7天细胞行免疫荧光检测,分别计算β-tubulinⅢ、GFAP、MBP阳性细胞所占的比例,研究细胞分化情况;通过RT-PCR、Western blot、Elisa等方法分别检测NEP1-40在转录、翻译水平及细胞外的表达情况。***1-40-NSC与DRG细胞共培养:从SD大鼠(孕)的胎鼠脊髓旁分离DRG细胞培养后,采用Nogo-A干预。设置Control组、NSC组和NEP1-40-NSC组。共培养5天后行NeuN、Phalloidine和Tuj-1免疫荧光染色观察神经元的生长锥和丝状伪足结构,Western Blot检测体外轴突再生蛋白标记物GAP-43、MAP-2、APP的表达以及NgR信号通路关键调控蛋白Rho、ROCK、LIMK、Cofilin以及MLCⅡ的蛋白和磷酸化水平。5.3D打印透明质酸水凝胶支架构建:将制备好的透明质酸水凝胶材料分装入低温料筒,加入光敏剂混匀后排气泡采用3D打印技术制成横纵交联孔状结构的HA水凝胶支架,通过测定孔隙率、吸水率以及降解实验检测支架的生物-物理学特性。***1-40-NSC与支架材料共培养研究:将HA水凝胶支架置于48孔板接种NEP1-40-NSC,进行扫描电镜观察NSC在HA支架上的附着情况。设置NSC组、NEP1-40-NSC组、NEP1-40-NSC-HA组,采用CCK8法检测细胞在支架上的增殖情况,以及ELISA检测共培养体系上清液中NEP1-4的含量。 结果1.成功构建NEP1-40基因慢病毒载体,测序结果显示载体NEP1-40序列与预知序列完全一致。***大鼠原代NSC聚集生长呈球状,Nestin、β-tubulinⅢ、MBP、GFAP免疫荧光鉴定神经球为NSC,并且具有分化成不同细胞的能力;***1-40基因慢病毒转染NSC后,通过免疫荧光检测确定MOI值为10时荧光强度以及转染率最高,并且细胞活力不受影响;各个水平检测NEP1-40表达量均高于未转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。连续培养3、5、7天后在荧光结果显示NEP1-40慢病毒组神经元和少突胶质细胞数量逐渐增多,而星形胶质细胞逐渐减少。***1-40-NSC与DRG细胞共培养后,免疫荧光染色显示NEP1-40-NSC组DRG细胞神经元、轴突、生长锥和伪足数量增多并且长度延长,Western Blot结果显示NEP1-40-NSC组轴突再生标记蛋白GAP-43、MAP-2表达量显著高于其他组,而APP蛋白则相反(P<0.05)。NgR信号通路关键调控蛋白Rho、ROCK表达显著下降,并且LIMK、Cofilin以及MLCⅡ的磷酸化水平显著低于其他组(P<0.05)。5.成功制备HA水凝胶生物材料,通过3D打印技术成功构建HA水凝胶支架,吸水率、孔隙率以及降解实验结果显示HA支架具备一定的物理特性和生物降解性。***1-40-NSC组与HA水凝胶支架共培养,CCK8结果显示复合支架组细胞生长良好,支架无细胞毒性作用;扫描电镜显示NSC附着于HA支架上并且存活,Elisa检测共培养体系上清液NE

关键词： ZnONPs   植入前胚胎   胚胎干细胞   H3K9me3  

摘要： 目的 纳米氧化锌颗粒（ZnONPs）具有防紫外线、抗菌、除臭、耐热等性能,其广泛应用对人类的健康是否产生影响引起了广泛担忧。因其纳米材料属性,更易分散和侵入人体生理屏障,所以在生殖健康方面及生物安全性方面受到了广泛关注。有研究表明,NPs可以转移到卵巢、子宫和胎盘,对女性生殖潜力和胎儿健康产生负面影响。因此,探讨NPs对胎儿的影响机制对开发生殖创新疗法非常重要。 有研究发现,ZnONPs可以在卵巢中蓄积,进而可能影响植入前胚胎的发育。然而,目前尚无关于ZnONPs对哺乳动物植入前胚胎发育及胚胎干细胞（ES）多能性影响的研究报道,并且鲜少在多组学水平上对ZnONPs毒性机制进行研究。 本研究从ZnONPs对植入前胚胎发育及胚胎干细胞多能性影响入手,从表观遗传学机制的角度探讨ZnONPs暴露对人类生殖健康的影响机制,对生殖健康创新疗法提供了新思路。 方法 1.通过对小鼠受精卵发育至囊胚的发育率、发育时间、发育速度、植入前胚胎出生率及m ESCs碱性磷酸酯酶克隆形成、畸胎瘤的形成能力、畸胎瘤的分化能力、嵌合鼠的研究探究ZnONPs对植入前胚胎及m ESCs的毒性作用。 2.免疫荧光实验和流式细胞术实验探究ZnONPs对植入前胚胎和m ESCs产生毒性作用本质。 3.对ICM和m ESCs进行测序,相关性分析对测序数据的质量进行检测,利用生物信息学统计方法对测序数据进行分析,对基因进行差异分析。 ***对下调基因进行富集分析,GSEA分析ZnONPs对特异性基因的影响,荧光定量PCR实验对下调基因进行验证。 5.对CUT&Tag实验中的测序数据进行相关性分析,进行质量检测,基因差异分析探究下调基因与其相近H3K9me3的关系。ATAC-seq实验对测序数据进行生物信息学统计方法分析,探究ZnONPs对染色质可及性的影响。 6.透射电子显微镜观察ZnONPs进入细胞的位置,体外Pull-Down实验和IP实验对ZnONPs与H3K9me3的作用方式进行探究。 结果 1.临床研究结果表明,接受辅助生殖技术（ART）治疗的患者其尿液锌元素浓度与妊娠率呈负相关关系。 ***在体内和体外的暴露会显著降低植入前胚胎的发育。ZnONPs对植入前胚胎的发育率、发育时间、发育速度、出生率及m ESCs的碱性磷酸酯酶克隆形成、畸胎瘤的形成能力、畸胎瘤的分化能力、嵌合鼠的嵌合均具有毒性作用。 ***通过释放Zn2+产生毒性作用,Zn2+螯合剂TPEN可以减轻ZnONPs对植入前胚胎及m ESCs的毒性作用。 ***释放的Zn2+可以通过与H3K9me3直接结合来上调H3K9me3表达,该组蛋白抑制剂Chaetocin可以减轻ZnONPs对植入前胚胎及m ESCs的毒性作用。 5.上调的H3K9me3可以影响染色质ICM开放区域的可及性,下调特异性基因的表达,进而影响植入前胚胎的发育和m ESCs的多能性。 结论 本研究首先通过探究ZnONPs对植入前胚胎的发育及m ESCs的多能性的影响的表型研究发现ZnONPs具有毒性作用,之后通过探讨机制发现ZnONPs释放的Zn2+与H3K9me3直接结合后导致H3K9me3上调,该组蛋白影响染色质ICM开放区域的可及性从而导致特异性基因的下调,进而影响植入前胚胎的发育及m ESCs的多能性。

摘要： 在人类揭开自然界神秘面纱的征途中，基因工程已经从科幻小说中的幻想变成了现实中最令人心潮澎湃的科学实践。从古代农业中简单的育种选择到当代科学家对基因精准的编辑，人类对遗传技术的掌握已经实现了革命性的飞跃。设想一下，如果我们能够更精准地操控生命的基础代码，那么治愈那些曾被认为是绝症的遗传疾病、大幅提升粮食生产效率、“定制”