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关键词： DNA提取   商品化试剂盒   凡纳滨对虾   肠道菌群   高通量测序  

摘要： 【目的】通过高通量测序技术,评价不同DNA试剂盒提取引起的对虾肠道菌群结构偏差,了解健康凡纳滨对虾肠道菌群结构特征。【方法】分别以细菌、粪便和组织DNA试剂盒3次重复提取凡纳滨对虾肠道总DNA(分别编号为SIB,SIS和SIT),检测DNA含量、纯度及其16S r DNA V4区可扩增性,进一步采用Illumina Mi Seq高通量测序比较SIB和SIS样品菌群组成和多样性。【结果】细菌试剂盒提取的虾肠总DNA效果最好,粪便试剂盒次之,而组织试剂盒所提DNA含量低且难以被扩增。从SIB和SIS样品分别获得52151±5085和55296±5147条有效序列,同一(46800条)测序深度下,SIS样品OTU(operational taxonomic unit)数量和Shannon多样性指数均显著高于SIB的,而SIB样品间OTU重复性则优于SIS样品间的。从SIB和SIS样品鉴定的优势门一致,均包括变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)和蓝细菌门(Cyanobacteria),但不同分类水平上绝大多数优势菌群丰度在两种样品间差异明显。【结论】高通量测序分析表明对虾肠道菌群结构因DNA提取方法不同而呈现显著偏差;本研究健康凡纳滨对虾肠道核心菌群主要由发光杆菌属(Photobacterium),乳球菌属(Lactococcus),弧菌属(Vibrio),Aliivibrio和3个分类未定属构成。

关键词： 胰腺   人胚胎干细胞   胰岛素分泌细胞   定向分化  

摘要： 人胚胎干细胞自建立以来就被认为是研究细胞分化、发育、进行药物筛选和推动再生医疗的有力工具。人胚胎干细胞具有在体外无限增殖的能力以及分化为三胚层所有细胞的潜能，这些特性使得需要大规模细胞移植的治疗手段成为可能。\n 在本课题中我们研究发现通过在培养基中添加ActivinA和分别过表达胰腺内分泌祖细胞标记因子Ngn3和成熟胰岛β细胞标记因子Mafa，可高效诱导人胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞。整个分化的过程经历了多能胚胎干细胞、定性内胚层、原肠管、前肠后部、胰腺内胚层和终末分化的胰岛素分泌细胞这几个阶段，这与成熟的在体外通过添加细胞因子和小分子将人胚胎干细胞分化成为胰岛素分泌细胞的方法过程类似。通过分别对Ngn3和Mafa持续过表达时间的控制我们发现外源基因持续表达9天的时间就足以诱导人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化。据我们所知，这是首次通过单个转录因子诱导人胚胎干细胞在体外分化为胰岛素分泌细胞。一方面，这为人胚胎干细胞在糖尿病治疗中的应用打下一定基础。另一方面，这也可以可以帮助我们更好地理解胰腺在发育和分化过程怎样决定细胞的不同命运的机制。

关键词： 玻璃纳米孔器件   DNA测序   结构稳定性   拉伸实验   力学模型   粘弹性理论  

摘要： 基于纳米孔的纳流体器件是第三代DNA测序的基础，这一器件被用于DNA测序，也可以用于检测单个DNA核苷酸和药物筛选。目前用于DNA测序的纳米孔有两类：一种是固态纳米孔，另一种是生物纳米孔。相对于生物纳米孔，固态纳米孔在结构稳定性、强度和寿命上具有显著的优势，并且其成本低廉，适合在实验室以外的工业应用。这篇文章以玻璃基毛细管纳米孔的制造方法为研究对象，研究拉玻璃基纳米孔成形过程的流变特性，以及可控因素对玻璃纳米管成型的影响规律。具体工作如下：\n 采用玻璃基材料实现纳米孔的跨尺度制造是本课题的主要任务。\n 1.首先，分析了激光加热玻璃毛细管成形三维纳通道的成形机理；再次，利用粘弹性理论建立了玻璃基纳米孔成形过程的宏观上的力学模型，采用广义Maxwell模型来描述熔融玻璃管的流变特性，构造了其在等温条件下的三维积分型本构方程和确定了本构方程的剪切模量与体积模量等相关参数。并利用 COMSOL软件对熔融玻璃毛细管拉锥流变制造过程进行了热力耦合有限元分析。在恒定砝码重力作用下，得到了玻璃毛细管的拉伸流变形状以及拉伸长度与毛细玻璃管内径变化的规律。\n 2.研究了基于激光加热毛细玻璃管拉伸实验中几个可控因素（加热时间、占空比和砝码质量）对拉制出的玻璃纳米管的影响和这几个可控因素之间的主次关系。采用了均匀试验设计方法来设计试验，得出了这三个可控因素之间的主次关系，且得到了较优的实验组合。\n 3.利用激光加热系统拉制出的玻璃纳米管外径在1μm以下，针对其尖端出现堵塞封闭的情况。设计出了一套磨针仪系统，利用此系统磨制出了外径在2μm以下的纳米管。而且利用自制的电测系统证实了拉制出的纳米管确实一个3D纳通道。

关键词： biological insecticide   Cry protein mode of action   Cry1Ab protein   GM plant  

摘要： Biological insecticides are an effective method used in plant protection. One of the most widely used active substances in biological insecticides is Cry1Ab protein, which is toxic for lepidopteran insects. This protein is produced during bacterial sporulation by [Bacillus thuringiensis.] Other sources of Cry1Ab protein are genetically modified plants (GM) with expression of [cry1Ab] gene. Cry1Ab protein in both bioinsecticides and GM plants is present in the form of protoxin, which requires activation by enzymatic treatment in the gut of susceptible insects. So far, Cry1Ab mode of action is not fully understood, but there are 3 main concepts describing it. Two of them assume that a toxic protein after binding to receptors in the insect gut penetrates into the cells, causing pore formation in the gut, which leads to the death of the sensitive insect. In the third model Cry1Ab toxic action is a result of toxin-induced chemical processes initiating a cell death pathway. This work describes the structure and mode of action of Cry1Ab protein, present in biological insecticides and genetically modified plants.

关键词： 转基因作物   生物安全   转基因食品  

摘要： 通过对美国Web of Science数据平台的全部转基因作物生物安全SCI论文的检索,研究了有关转基因作物生物安全的科学证据。得出科学家比消费者更关心转基因技术的安全性;批准商业化生产的转基因技术经过了有史以来最为严格的生物学安全检验与检测,并建立了有史以来最为严格的监管体系;在所发表的全部9333篇转基因生物安全论文中,90%以上的论文证明转基因技术的安全性与传统非转基因作物无显著差异;而对于所有得出转基因食品不安全结论的论文的追踪研究发现,其研究结论被证明是在错误的研究材料或方法条件下得出的。

关键词： 星油藤   α-亚麻酸   启动子   基因工程   农杆菌介导   遗传育种  

摘要： α-亚麻酸(α-linolenic acid，ALA)作为必需脂肪酸，对预防心血管疾病、癌症、高血压等慢性疾病具有重要的生理功能。然而，大部分食用油料作物种子ALA的含量都很低，提高种子ALA的含量一直是油料作物品质改良的重点内容之一。星油藤(Plukenetia volubilis Linneo)是一种大戟科植物，其种子中富含ALA，占种子含油量的50％以上，是一种具有重要开发前景的油料植物。前期的研究发现其种子高效累积ALA主要与关键功能基因PvFAD3的高度表达有关，但是关于PvFAD3的转录调控机理还不清楚。解析星油藤高效累积ALA的分子机理不仅能够为提高油料作物种子品质的遗传改良提供理论参考，而且可以利用基因工程提高油菜ALA含量、改良油菜的品质。本研究主要从转录水平来研究星油藤PvFAD3的调控，并应用于甘蓝型油菜的遗传育种，主要研究结果如下:\n 1.通过荧光定量PCR的方法调查不同温度处理的星油藤种子基因表达的变化情况，发现ALA形成的脱饱和关键同工酶基因PvFAD3、PvFAD7-2和转录因子PvbZip124的表达在10℃低温下的表达较高，特别是PvFAD3和PvbZip124表现出相似的表达模式，结合前期的研究结果，我们推测PvFAD3的表达与PvbZip124的调控有关。而与PvFAD7-2不同，PvFAD7-1的表达则随温度的增加而增强，说明基因不同拷贝具有不同的表达模式。\n 2.基于前期已有的PvFAD3启动子序列，利用生物信息学分析发现PvFAD3启动子序列上游包含两个G-box顺式作用元件，可能与共表达转录因子PvbZIP124有潜在结合位点。为了验证PvbZIP124是否直接调控PvFAD3的表达，我们克隆并分析了星油藤PvbZIP124基因全长，利用酵母单杂交实验在体外验证了PvbZIP124能够与PvFAD3启动子上的G-box顺式作用元件结合。进一步构建植物效应表达载体p35s∷PvbZip和植物报告表达载体pPvFAD3∷GFP进行烟草瞬时激活表达实验，在体内验证了PvFAD3的表达受bZIP124转录因子的调控。这些结果说明PvbZIP124直接参与了PvFAD3的表达调控。\n 3.为了验证星油藤PvFAD3是否能够应用于油料作物旨在提高种子ALA的基因工程实践，通过农杆菌介导法将35S组成型启动的和napin种子特异性启动的星油藤PvFAD3基因分别转入甘蓝型油菜中。我们共从1714个外植体中获得了12株pCambia2300-35S-NPTII-napin promter-PvFAD3过表达材料，从1737个外植体中获得了6株PCXN-35S-HPTII-35S promter-PvFAD3过表达材料，转化效率分别为0.70％和0.35％。通过对T0代转基因植株进行FAD3基因表达分析，发现了8株上调表达，为进一步研究PvFAD3在油菜中的基因工程应用提供了基础。

关键词： 转基因作物   中科院院士   生物育种   生命科学学院   宏   安全问题   育种技术   国际竞争  

摘要： “如果我们陷入‘转基因安全问题’之争而止步不前,将失去难得的发展机遇.这不仅会让我国的生物育种技术与市场受制于人,农业生产在激烈的国际竞争中也将受到严重影响.”在日前举行的中科院机关转基因科普报告会上,北京大学生命科学学院教授、中科院院士许智宏道出了对于转基因作物研发未来的忧虑.

关键词： 角膜内皮样细胞   人胚胎干细胞   定向诱导   细胞分化  

摘要： 目的:外伤、感染、先天性遗传病等原因可导致角膜内皮细胞发生不可逆损伤，定向诱导胚胎干细胞向角膜内皮细胞进行分化，对治疗角膜内皮相关疾病及重建组织工程角膜具有重要临床意义。目前国内外已有研究表明，利用小分子化合物或基因重编程方法，可诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮样细胞，但诱导内皮细胞的效率仍不理想，诱导方案有待进一步改善。本研究旨在利用人胚胎干细胞的多向分化潜能特性，探索新的诱导方法促使人胚胎干细胞向人角膜内皮样细胞分化。\n 方法:利用AggreWellTM板将人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)制备成具有向三个胚层分化潜能的拟胚体（embryonic bodies，EBs），将EBs转移至超低吸附六孔板中进行3D培养，加入维甲酸(retinoid acid，RA)促使EBs向神经嵴细胞(neural crest cells，NCCs)方向分化，之后接种于包被了硫酸软骨素、层粘连蛋白及纤粘连蛋白的六孔板中，更换为人角膜基质细胞条件培养基（贴壁培养第一阶段诱导分化培养基）培养3天，使其分化为眼周间充质前体细胞（periocular mesenchymal precursors，POMPs），而后更换培养基为人角膜内皮细胞分化培养基（贴壁培养第二阶段诱导分化培养基）继续培养4-12天，使其进一步分化为人角膜内皮样细胞。利用免疫荧光染色方法检测POMPs相关标记物FOXC1和PITX2，以及角膜内皮细胞分化标记物Na+/Ka+ATP酶（Na+/Ka+ATPase），N型钙黏素(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，紧密连接蛋白(ZO-1)等。流式细胞仪检测Vimentin阳性细胞比例，Western blotting方法检测HCEC标志蛋白Na+/Ka+ATP酶的表达，证实目的细胞具有角膜内皮样特性。\n 结果:EBs经RA处理后，更换第一阶段诱导分化培养基进行贴壁培养，观察细胞形态，可见大量梭形细胞自EBs中向周边迁出，NCCs相关标记物呈阳性;第一阶段诱导分化3d后，免疫荧光染色结果显示大部分细胞对POMPs相关标记物PITX2及FOXC1呈阳性表达。更换贴壁培养第二阶段诱导的条件培养基对细胞进行诱导分化4d后可见EBs周边出现少量紧密排列的六边形细胞，细胞数量随培养天数逐渐增加，8d后可见EBs周边出现大量与人角膜内皮细胞（humancorneal endothelial cells，HCEC)形态一致的六边形细胞;在第二阶段诱导细胞的8d，进行细胞内HCEC相关标记物N-cadherin，Na+/K+-ATP酶，ZO-1及Vimentin的免疫荧光染色，部分细胞对以上四种标记物均表达阳性结果;分别在第二阶段诱导分化的4d、8d及12d对细胞进行流式细胞仪进行Vimentin检测，结果显示细胞对Vimentin的表达在第二阶段诱导的8d达到峰值。采用Western blot方法检测Na+/K+-ATP酶，其结果显示细胞在第二阶段诱导分化的8d，表达目标蛋白的阳性细胞达到峰值，与流式检测结果一致。\n 结论:本研究通过小分子化合物与条件培养基联合、三维与二维培养相结合的方法，成功将hESCs诱导分化为人角膜内皮样细胞，根据免疫荧光染色结果，该角膜内皮样细胞可同时表达HCEC相关标记物N-cadherin，Na+/K+-ATP酶，ZO-1及Vimentin，流式细胞检测显示HCEC标志物阳性细胞率超过40％，为之后构建组织工程角膜、角膜内皮相关疾病的临床治疗提供了细胞来源。

关键词： 鸭坦布苏病毒病   PrM/E基因   临床特征   抗体检测  

摘要： 鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease）是一种以蛋鸭的产蛋量急剧下降为主要临床特征的疫病，病禽体重下降、高热、食欲下降、产蛋量下降甚至停止产蛋以及部分死亡是坦布苏病毒病的主要眼观特征。\n 鸭病毒性肠炎（Duck Virus Enteritis，DVE）又名鸭瘟（Duck Plague，DP），是由鸭肠炎病毒（Duck Enteritis Virus，DEV）引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性接触性传染病，其特征为血管破坏、组织出血、消化道粘膜破溃、淋巴器官损伤和实质器官变性。病禽体温升高，两腿麻痹，下痢，流泪，部分病鸭头部肿大。该疾病传播迅速，因其发病率和死亡率特别高，对养鸭业甚至水禽养殖业造成了严重威胁。\n 目前鸭瘟的预防主要依靠接种弱毒苗实施。鸭肠炎病毒本身具有成为病毒载体的潜力，而且将其开发为病毒载体具有以下优势：其全基因组中具有很多非必需基因，因此该病基因组具有很强的容纳外源基因的能力；同时该病毒的宿主较少，因此该疫苗对于人及其他家畜来说相对安全；另外，鸭瘟病毒能潜伏在三叉神经节、淋巴样组织和外周血淋巴细胞中，并且能持续地诱导机体产生相关细胞免疫和体液免疫。\n 本研究前部分对某地区的两鸭场进行了采样调查，并分别对坦布苏病毒抗体E蛋白与PrM蛋白间接ELISA方法进行了评估及差异性分析，得到以下结论：\n （1）经过3次鸭坦布苏病毒病疫苗免疫的种、蛋鸭场一，抗体保持在了一个比较高的水平，并很好的做到了全进全出。而未免疫疫苗的肉鸭场二，呈现了坦布苏病毒的大面积感染情况，证明鸭坦布苏病毒在该地区呈现流行趋势，蛋鸭种鸭应及时做好相关免疫工作。\n （2）从品种对疫苗的敏感性上来说，樱桃谷鸭比麻鸭对疫苗的敏感性更强，更易产生较高的抗体水平。\n （3）两种蛋白包被的ELISA板均能较好地检测鸭坦布苏病毒的抗体水平，并且呈现了一致性，增加了鸭坦布苏病毒间接ELISA检测的多样性和准确性。\n 以上采样调查结果同时反映了两种蛋白均存在良好的免疫原性，于是我们将鸭坦布苏病毒PrM基因与E基因串联插入鸭瘟病基因间隙中，构建得到一种可以同时表达PrM和E蛋白的基因工程二联疫苗。\n 本研究后部分借助CRISPR/Cas基因编辑技术的启发，运用CRISPR/Cas9系统对鸭瘟病毒进行修饰和同源重组，将坦布苏病毒的主要免疫源性基因PrM基因与E基因成功插入到鸭肠炎病毒的US7、US8基因之间的基因间隙，开发了鸭肠炎病毒和坦布苏病毒的基因工程二联苗，大大降低了工作量，同时提高了重组效率，并通过一系列实验验证了该二价苗的蛋白表达效果。主要研究结果如下：\n （1）构建含有重组同源臂的克隆载体\n 本研究在鸭肠炎病毒US7和US8之间插入克隆片段，分别将750 bp左右的上下游同源臂用PCR扩增，再将大约1.8 kb的筛选标记红色荧光蛋白RFP扩增，运用重叠PCR的方法将上述三个片段连接起来，之后将该连接片段克隆到载体pMD-18T上。\n （2）目的病毒C-KCE-RFP的筛选及稳定性测试\n 运用CRISPR/Cas9系统同源重组后的鸭瘟病毒，在US7和US8基因之间存在红色荧光蛋白RFP表达基因，以红色荧光蛋白RFP作为筛选标记，筛选到重组成功的鸭肠炎病毒，并通过逐步拯救纯化该病毒，并通过实验验证其荧光能够稳定表达。\n （3）将坦布苏病毒Prm基因整合到鸭肠炎病毒载体上\n 分别将750bp左右的上下游同源臂用PCR扩增，再将大约1.8 kb的PrM/E片段扩增，运用重叠PCR的方法将上述三个片段连接起来，之后将该连接片段克隆到载体pMD-18T上，运用相同的CRISPR/Cas9系统，重组红荧光病毒C-KCE-RFP，使得PrM/E替换RFP红色荧光表达基因，并通过逐步拯救纯化该病毒。\n （4）目的病毒C-KCE-PrM/E的稳定性及效果检测\n 得到的纯化后的目的病毒C-KCE-PrM/E经稳定性检测发现该病毒能够稳定传代，经体外实验表明PrM蛋白和E蛋白能随着该病毒的复制而表达。

关键词： 类胡萝卜素   代谢调控   基因工程  

摘要： 类胡萝卜素是高等植物必不可少的一类色素物质,能够保护植物组织勉受强光破坏,同时还是合成维生素A的前体,对人类的营养和健康起着重要的作用。类胡萝卜素的代谢途径已经清楚,近十几年来的研究主要集中于类胡萝卜素代谢的调控机理。本综述介绍了植物类胡萝卜素代谢的调控机理及基因工程方面的研究进展,并对今后类胡萝卜素的代谢调控研究进行了展望。