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关键词： 哺乳动物   胚胎干细胞   中胚层   心肌分化   组蛋白去甲基化酶   细胞凋亡  

摘要： 目的及内容:\n 胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)具有在体内和体外均能分化为三胚层及多种不同类型细胞的能力，获利于此种特性，对体外ESC分化机制的研究将有助于解释哺乳动物发育过程中细胞自主分化的机制和调控网络。而ESCs作为重要的心肌供体细胞来源，其向心肌向分化效率低及有限的调控研究等原因使细胞移植的临床研究、应用等受到巨大限制。此外，早期ESC分化（体外）同胚胎及胚泡形成（体内）一样，伴随着细胞增殖能力的下降和凋亡的上升，例如MAPK通路激活介导的凋亡和钙离子通道三磷酸肌醇受体IP3R3调控的钙离子释放。这些报道证明了调亡对早期发育中细胞谱系的命运决定作用。\n 然而，相比于已被广泛揭示的受信号通路调控的凋亡机制，表观遗传修饰尤其是组蛋白去甲基化酶对ESC分化中凋亡的调控作用，及该调控是否会影响ESCs特异的谱系分化尤其是心肌向分化的了解非常有限。因此，揭示组蛋白去甲基化酶在ESCs向心肌分化过程中的调控作用，以及其如何通过凋亡通路调控细胞的命运决定将有助于我们理解表观遗传修饰在ESC分化及凋亡中的作用，并进一步揭示分化与凋亡之间的联系。\n 在本论文中，我们利用稳定敲减jmjd3的mESCs系、稳定敲除phf8的mESCs系及在敲除phf8基础上构建的稳定过表达系，研究组蛋白去甲基化酶JMJD3及PHF8在mESCs向中胚层及心肌细胞分化过程中对细胞分化及细胞凋亡的作用。\n 方法:\n 本论文利用pLKO-1慢病毒载体构建jmjd3稳定敲减的mESCs系;利用同源重组技术构建phf8基因稳定敲除的mESCs系（phf8-/Y mESCs），利用pCDH慢病毒载体构建hPHF8或pmaip1稳定过表达的phf8-Y mESCs系（phf8-hPHF8-/+或phf8-pmaip1-/+ mESCs）;利用siRNA介导的基因沉默技术获得pmaip1瞬时下调的mESCs(si-Pmaip1 mESCs)，通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光、未分化状态标志基因表达等指标分析其未分化状态;利用悬滴法体外分化模型及特异诱导外胚层/内胚层分化模型，通过胚层和终末分化细胞标志基因的表达、mRNA芯片及流式分析等方法鉴定其分化能力;通过ChIP技术鉴定PHF8的靶基因并进行验证，以此来研究PHF8参与细胞凋亡及细胞命运决定的机制并探讨二者的关联。\n 研究结果:\n ***3在mESCs向心肌细胞分化分化过程中表达水平显著上调，其缺失并不影响mESCs的自我更新但对其向中胚层及心肌细胞的分化具有至关重要的作用;\n 2.未分化状态的mESCs表达PHF8，但PHF8缺失并不影响mESCs多能性基因的表达水平、碱性磷酸酶活性等多能性指标，表明PHF8并不影响mESCs的自我更新;\n ***8在mESCs向心肌细胞分化过程中的表达水平有所变化，敲除phf8促进中胚层及随后的心肌细胞特异标志基因表达，所形成的类胚体(embryoidbodies，EBs)中心肌跳动的比例显著高于野生型，但其并不影响mESCs向早期外胚层或内胚层的分化，证明PHF8特异性的参与调控mESCs向中胚层及心肌细胞分化;\n 4.心肌细胞分化过程中，PHF8敲除型细胞的细胞数目显著多于野生型细胞，但无论未分化状态或分化状态，二者的BrdU染色和细胞周期水平都没有显著差异，即PHF8并不影响mESCs的增殖;\n ***8敲除导致的心肌细胞分化过程中凋亡水平的下调才是其细胞数目多于野生型的原因，早期凋亡指标AnnexinⅤ、晚期凋亡指标TUNEL和DNALadder等分析结果证实PHF8敲除显著下调细胞凋亡，同时，PHF8敲除显著下调心血管前体标志物FLK-1阳性细胞的凋亡比例，且这种凋亡并不依赖于Caspase-3介导的信号通路;\n ***芯片分析发现促凋亡基因pmaip1在敲除型细胞的表达水平显著低于野生型，进一步ChIP实验验证pmaip1为PHF8的靶基因，且PHF8通过结合在其启动区域上、去除其上抑制基因表达的H3K9me2位点来激活其转录表达，而在特异诱导外胚层或内胚层分化的模型中PHF8敲除并不改变pmaip1的表达水平，验证PHF8特异的促进促凋亡基因pmaip1在mESCs向中胚层及心肌细胞分化过程中的表达;\n 7.瞬时下调pmaip1有效抑制mESC向心肌细胞分化过程中的细胞凋亡，并促进其向中胚层及心肌细胞分化;\n ***8-/Y mESCs稳定过表达hPHF8或pmaip1均显著上调被抑制的凋亡水平，并显著下调被促进的中胚层及心肌分化，证实PHF8通过调控pmaip1表达，影响细胞凋亡从而参与mESCs向中胚

关键词： 黑鲷   饲料添加剂   大黄鱼抗菌肽   基因工程产品   安全性  

摘要： 抗菌肽是一类普遍存在于各类生物体中的小分子多肽，具有广谱抗菌活性，且不易产生细菌耐药性，被视为未来抗生素的有效替代品。在前期研究中，本实验室利用基因工程技术获得了毕赤酵母表达的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）抗菌肽Hepcidin基因工程表达产品Pc-hepc，并以Pc-hepc作为饲料添加剂饲喂海水养殖鱼类黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)，进行为期一年的环境释放试验，本项研究运用生物学技术对Pc-hepc的应用进行了系统的安全性评价研究，获得了一年应用Pc-hepc的环境释放试验数据，为基因工程产品Pc-hepc在海水养殖业的开发利用奠定了基础。主要研究成果如下:\n 1.发现长期饲喂Pc-hepc不会影响黑鲷的正常生长。饲料中添加Pc-hepc饲喂黑鲷，为期一年，期间每隔两周时间随机测量对照组和实验组黑鲷的体重与体长，统计黑鲷体长与体重随投喂时间的变化趋势。结果显示，实验组黑鲷比对照组有一定的生长优势，表明饲喂抗菌肽Pc-hepc不会影响黑鲷的正常生长，甚至在一定程度上还会促进黑鲷的生长。\n 2.长期饲喂Pc-hepc不会引起黑鲷肝脏和肠道的组织形态变化。每隔两周时间随机采取对照组和实验组黑鲷的肝脏和肠道，制作两种组织的石蜡切片，进行H&E染色。显微镜观察黑鲷肝脏和肠道的生理结构和细胞形态，发现实验组肠道切片中的内壁和间质形态正常，小肠绒毛排列整齐、分布均匀，未发现异常变化。实验组肝脏切片中细胞排列整齐，肝细胞和细胞核大小均匀，结构显示良好，亦未发现异常变化。这些结果表明，长期饲喂基因工程产品Pc-hepc不会导致黑鲷肝脏、肠道组织形态的异常变化。\n 3.长期应用基因工程产品Pc-hepc，无外源基因的扩散转移现象。每隔两周时间随机采集黑鲷各组织样品及养殖土池水样、土壤、植物等环境样本，提取基因组后，用PCR方法特异检测外源的酵母基因及Pc-hepc基因，确定这些基因是否有向黑鲷组织和周围环境的转移和扩散情况。结果显示没有扩增到与阳性对照大小一致的条带，表明在投喂Pc-hepc过程中没有出现外源基因的转移情况，表明长期应用基因工程产品Pc-hepc是安全的。\n 4.实验室条件下，发现饲喂不同剂量抗菌肽Pc-hepc对所测定的黑鲷生理生化指标和不同功能基因的表达无显著影响。使用不同剂量(0mg/kg，10mg/kg，100mg/kg，300mg/kg) Pc-hepc饲喂黑鲷，分别检测了几种黑鲷肝脏生理生化指标如ROS、SOD、CAT、GR;几种不同功能基因(如BCL2L1，G6Pase，HNF4α，HLF，MyD88，IκBαA，Histone1)的表达情况。发现饲喂不同剂量抗菌肽Pc-hepc对所测定的几种黑鲷的氧化和抗氧化指标无显著性影响，不会影响黑鲷的糖代谢，也不会引起黑鲷的免疫应激，但有可能表现促凋亡的作用。这些结果也从另一方面证实了使用Pc-hepc的安全性。\n 5.发现长期饲喂抗菌肽Pc-hepc对黑鲷肠道菌群无显著影响。利用高通量测序技术研究了长期饲喂抗菌肽Pc-hepc对黑鲷肠道菌群的影响，研究发现变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门（Firmicutes）是黑鲷肠道细菌中的两个主要门类，长期饲喂抗菌肽Pc-hepc对黑鲷肠道菌群多样性的无显著影响，但是会降低肠道中梭菌纲(Clostridia)的相对丰度，说明长期饲喂抗菌肽Pc-hepc不会引起黑鲷肠道菌群失调，且能在一定程度上抑制肠道有害微生物，从而维持黑鲷肠道的正常代谢和免疫功能。说明饲喂基因工程产品Pc-hepc安全有效，不会引起养殖鱼类肠道菌群的紊乱。\n 综上，抗菌肽基因工程产品Pc-hepc可长期安全应用于鱼类养殖业。

关键词： 生物丁醇   混合醇发酵   丙酮丁醇梭菌   基因改造  

摘要： 生物丁醇属于第二代生物燃料，通过梭菌属微生物（Clostridiumacetobutylicum）ABE（丙酮-丁醇-乙醇）厌氧发酵生产丁醇目前仍然存在诸多瓶颈，如原料成本高、溶剂产率低、副产物多等。其中副产物丙酮含量达到总溶剂的30％左右，其热值远低于丁醇与乙醇并具有腐蚀性，不适合作为燃料，必须加以分离，使燃料丁醇的提取成本与燃料乙醇相比显著增加。异丙醇作为一种可持续的生物燃料，具有较高的燃烧值，因此，将副产物丙酮转化为热值更高的异丙醇，使ABE发酵转变为IBE（异丙醇-丁醇-乙醇）混合醇发酵，将有利于降低生物丁醇燃料的制备成本。\n Clostridium acetobutylicum XY16是由本实验室自主诱变筛选得到的一株产丁醇菌株。本文以*** XY16为出发菌株，通过基因工程手段对其丙酮通路进行代谢改造将其转化为异丙醇，构建混合醇生产的细胞工厂，实现丁醇-异丙醇-乙醇的混合醇发酵生产。针对混合醇代谢过程中存在辅酶NADH、NADPH供给不足的问题，采用不同发酵调控方式(pH调控、碳酸钙调控、外源电子载体)对胞内还原力进行调节，并考察了胞内辅酶水平及关键酶活的变化情况，进一步增强还原力的供给能力，实现混合醇的高产。结果如下:\n (1)通过表达次级醇脱氢酶基因（sadh），将传统的ABE发酵转化为IBE发酵。结果表明，重组菌株*** XY16(pSADH)能够产生IBE混合醇，且无丙酮积累。但是将丙酮催化成异丙醇的过程需要增加消耗1分子的还原力，这将降低胞内还原力供给水平，同时，由于梭菌进入产醇期后需要消耗大量的还原力来合成醇类物质，因此，菌株的生长及产醇性能均受到了影响，OD600最高达到4.24，混合醇总产量只有3.88 g/L。\n (2)通过pH、添加碳酸钙及电子载体调控方式对菌株进行发酵调控优化进而建立了高产混合醇发酵调控策略。结果表明:在pH=4.8时，混合醇和丁醇浓度分别达到了16.70 g/L、10.07 g/L，比未调控时分别提高了3.3和3.8倍。在加入10 g/L的碳酸钙后，混合醇产量达到17.77 g/L，比未调控时提高了3.6倍。当甲基紫晶及中性红的添加浓度分别为0.03 mM、0.4 mM时，混合醇产量分别提高到了5.35 g/L、7.13 g/L，与未调控相比，分别提高了38％、83％。\n (3)通过pH调控后，胞内还原力的供给能力增强，进而产醇能力得到了提高。添加碳酸钙不但可将pH控制在5.0左右，同时钙离子的存在激活了NAD激酶，加强了NADH向NADPH的转化，胞内还原力水平、丁醇脱氢酶、NADK的活性相较于未调控时有了明显提高。添加外源电子载体(MV、NR)重塑了代谢途径的产物分布，降低了电子以生成氢气的方式逸出，增强了还原力供给并提高了混合醇的产量。\n 通过构建混合醇生产的细胞工厂及调节胞内还原力的策略，结合代谢流分析手段，考察了整个代谢过程中各个产物的变化情况，结果表明还原力调控可显著增强混合醇生产性能，其中碳酸钙的调控作用较优，这为进一步优化混合醇发酵生产提供了一定的参考。

关键词： 胚胎发育   纺锤体基质   Rbm14蛋白   胚胎干细胞   相变功能  

摘要： 胚胎干细胞是一类尚未分化的，具有自我复制能力的多潜能细胞，能通过有丝分裂进行自我更新或产生分化的子代细胞。胚胎发育是由一个受精卵发育为整个个体的过程。在胚胎干细胞分化为各种类型细胞、胚胎由一个受精卵细胞发育为成体各个类型细胞中，都涉及到细胞命运决定的调控。\n 涉及细胞命运调控机制的研究中，有丝分裂发挥着重要作用，细胞可以通过不对称分裂产生不同命运的子代细胞。纺锤体是有丝分裂中一种高度动态结构，它帮助遗传物质分离进入子代细胞。人们发现除了纺锤体，还存在纺锤体基质的结构，它作为一种弹性基质成分，在有丝分裂过程中帮助纺锤体的组装和染色体的分离。纺锤体基质除了维持有丝分裂正常进行，是否还有新的功能尚未可知。\n 通过对纺锤体基质蛋白大规模筛选，我们发现了一个新的命运调节因子Rbm14。Rbm14在胚胎干细胞中高表达，抑制Rbm14的表达会导致胚胎干细胞走向分化的命运。Rbm14的缺失会抑制BMP信号通路，导致BMP下游组分Smad4，Smad5，Id1，Id2表达水平下调。在斑马鱼中，通过注射morpholino抑制Rbm14表达，会导致斑马鱼BMP信号通路被抑制，出现背部化畸形。Rbm14能通过C端的PLD结构域进行相变，形成微滴，其中PLD结构域上多个重复性的酪氨酸起着关键作用。相变功能对斑马鱼背腹轴建立是必须的。另外，Rbm14-/-小鼠在囊胚晚期原始内胚层和上胚层细胞谱系发育异常，小鼠在E8.5天之前死亡。\n 我们的研究为纺锤体基质的功能拓展了一个崭新的方向:纺锤体基质除了调控有丝分裂，还在干细胞命运决定和胚胎发育中发挥功能。同时也展示了相变功能在发育中的重要作用。另外，我们的研究也加深了对Rbm14功能的理解。

关键词： 猪伪狂犬病   病毒变异株   基因工程疫苗   安全性   保护效力   动物试验  

摘要： 伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪和多种家畜共患的一种急性，热性传染病。PRV主要感染猪，能够导致仔猪的高死亡率和种猪繁殖障碍，对养猪业危害极大。疫苗免疫是防控猪伪狂犬病的主要手段。然而自2011年底，PRV变异毒株在我国猪场出现并且流行，给养猪业造成了巨大的损失。最新的研究显示，现有商品化疫苗的保护效力显著下降，不能有效阻断这种变异株的传播和流行。本研究旨在以当前流行的PRV变异株（CH/HNSMX/2012株）为亲本，通过基因工程技术构建gI、gE、TK三基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK，通过一系列动物试验，研究了该毒株的安全性和免疫效力;为PRV变异株弱毒疫苗的研发与应用奠定了基础。\n 1.伪狂犬病病毒流行毒株的分离鉴定和致病力研究\n 本研究从85份病料样品中总共分离到16株PRV。空斑试验显示这16株PRV的空斑面积相似（0.4-0.8mm2），均显著高于经典毒株Ea株(0.2-0.5mm2)。对这16株PRV进行gC基因测序和进化分析，结果显示这16株PRV同源性非常高，和国内近期公布的PRV分离株的gC基因高度同源;因此可以初步判定，这16株PRV均属于PRV变异株。\n 选择PRV CH/HNSMX/2012株作为变异株的代表，通过小鼠和仔猪感染试验研究其致病力。小鼠LD50试验结果显示CH/HNSMX/2012株和Ea株的LD50分别为19.5和154.2 TCID50。CH/HNSMX/2012株对小鼠的致病力显著强于Ea株。使用CH/HNSMX/2012株通过滴鼻途径感染60日龄仔猪，剂量分别为106.0、107.0、108.0TCID50;结果显示所有感染组均出现发热，食欲废绝，典型的神经症状和严重的呼吸道症状。106.0 TCID50感染组的5头猪中有3头仔猪死亡;而107.0和108.0 TCID50能够导致5头仔猪全部死亡。\n 2.基因缺失病毒rSMXΔgI/gEΔTK的构建\n 根据PRV基因组序列，选择gI/gE和TK基因两侧的序列作为同源臂，构建了重组转移载体;将重组转移载体和CH/HNSMX/2012基因组共转染PK-15细胞，获得重组病毒;通过空斑纯化，获得纯净的不带标记的基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK。RFLP和Southern Blot试验证明该毒株按照设计在gI/gE和TK两个区域发生了缺失，而基因组其他位置没有发生突变。rSMXΔgI/gEΔTK株的生长曲线和亲本株相似，但是空斑面积显著减小。细胞连续传代试验证明rSMXΔgI/gEΔTK遗传稳定。\n 3.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK的安全性评价\n 使用1010-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过足垫注射接种Balb/c小鼠，观察14d，接种小鼠未见临床感染症状。使用102.0-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过皮下注射接种新西兰大耳兔，观察21d，没有兔出现临床感染症状。使用1080 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过肌肉注射接种绵羊，观察21d，结果没有绵羊出现临床症状;同栏饲养的绵羊没有出现gB抗体转阳的现象。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过肌肉注射和滴鼻两种途径，接种0日龄仔猪，观察28d，结果没有仔猪出现临床症状，仔猪生长速度正常;每个感染组设置的哨兵猪gB抗体维持阴性。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒，通过肌肉注射接种妊娠84日龄母猪;没有母猪出现发热，流产等临床症状，出生仔猪数和仔猪的健康度和生长速度完全正常，和对照组没有差异。综上所述，PRV rSMXΔgI/gEΔTK株不能导致小鼠、兔、绵羊、新生仔猪、妊娠母猪等易感动物出现症状，仅具有有限的水平传播能力，安全性较好，适合作为弱毒疫苗的候选毒株。\n 4.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK株对仔猪的免疫保护力评价\n 分别使用106.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株弱毒疫苗，1头份Bartha-K61株弱毒疫苗(Merial，France)，或者1mL DMEM免疫28日龄PRV阴性仔猪1次，免疫后28天采血检测抗体。中和试验结果显示rSMXΔgI/gEΔTK产生的血清中和抗体水平高于Bartha-K61疫苗。Bartha-K61疫苗产生的血清中和抗体中和Bartha-K61的中和效价显著高于中和CH/HNSMX/2012株的中和效价;而rSMXΔgI/gEΔTK株疫苗没有这个现象。免疫后28天使用CH/HNSMX/20

关键词： 土壤农杆菌   根瘤农杆菌   根瘤农杆菌基因工程   植物基因工程  

摘要： 根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一类存在于土壤中的革兰氏阴性植物病原菌。根瘤农杆菌通过Ti质粒上的一系列vir基因表达毒性Vir蛋白将其自身的转移DNA(T-DNA)转移整合到植物基因组,进而达到侵染植物的目的。基于这一基因转移功能,改造后的根瘤农杆菌被广泛应用于植物基因工程。本文重点回顾了以在植物基因工程领域应用根瘤农杆菌为目的对根瘤农杆菌基因组进行的遗传改造。这些改造包括T-DNA区的卸甲,双元载体的应用,其他基因组基因的敲除等。通过回顾和展望为进一步在植物基因工程中应用根瘤农杆菌提供新的研究思路。

关键词： 胚胎干细胞试验   胚胎和发育毒性   替代方法   预测  

摘要： 小鼠胚胎干细胞试验(EST)是通过ECVAM正式验证的胚胎和发育毒性的动物试验替代方法。在新技术的推动下,多项优化的EST方法通过基因转染、利用人来源的干细胞、增加检测通量、组合检测终点、量化检测指标等方式,提高了EST方法预测胚胎毒性的科学相关性和检测效率。在整合测试策略的原则之下,经过大规模化学物质的前验证和标准化试验,新的EST方法可单独或作为组合试验的一部分可以应用于先导药物的研发和化学品的胚胎毒性预测及机制研究。

关键词： 农作物   5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶   基因诱变   EaGOX1基因   抗草甘膦性   SOS1基因   抗盐能力  

摘要： 随着环境的恶化以及化学产品的使用，植物在生长过程中面临的威胁越来越多。除了生物胁迫外，干旱、洪涝、冷害、热害、盐害、重金属胁迫等非生物胁迫也对植物的生存造成了重大影响。同时，在除草剂和杀虫剂等化工产品的使用过程中，不仅杂草和害虫被毒杀，作物也受到了一定程度的伤害。为了增加作物对胁迫的抗性，降低环境和人为因素对作物生长和产量的影响，本研究主要包含三方面的内容:(1)抗草甘膦基因的筛选和功能验证;(2)水稻EPSPS基因诱变;(3)对大豆SOS1基因的修饰和功能验证。\n 草甘膦是孟山都公司设计生产的一种广谱除草剂，于十九世纪七十年代开始投入使用。由于草甘膦与磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)结构相似，它能够竞争性结合莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)上PEP的结合位点，从而导致PEP不能与EPSPS结合，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP）的合成受阻，继而影响到植物芳香族氨基酸的合成，导致植物因缺乏必须的芳香族氨基酸而死亡。为了筛选抗草甘膦的EPSPS基因，我们从不同环境中取了土壤样本进行培养和筛选，得到一个能耐受100mM草甘膦的菌株Enterobacter aerogenes。将该菌株的EPSPS，GOX1和GOX2克隆并在大肠杆菌中表达，用含有不同浓度草甘膦的培养基培养发现，只有转入了EaGOX1基因的大肠杆菌可以在含50mM草甘膦的培养基中生长。这一结果表明，GOX1基因可能是导致Enterobacter aerogenes对草甘膦有耐受性的主要基因，但该菌株能耐受100mM草甘膦可能是EaGOX1与其他基因共同作用的结果。后续研究将检测EaGOX1基因能否提高作物对草甘膦的抗性。\n 此外，我们还将经过了随机突变的水稻EPSPS基因通过多次硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）诱变或者紫外线(ultraviolet，UV)诱变来筛选抗草甘膦的变异基因。但是最终没能筛选到抗草甘膦的OsEPSPS突变型。\n SOS1(Salt Overly Sensitive1)是位于细胞膜上的Na+/H+反向转运体，它是拟南芥维持细胞内低钠状态的一个关键蛋白，其在大豆中是否与抗盐相关，特别是位于SOS1蛋白C-末端的自抑制结构域的改变是否会对大豆抗盐有影响尚不清楚。为了研究这一问题，我们使用目前比较成熟的CRISPR/Cas9体系对大豆中编码SOS1蛋白C-末端的基因序列进行编辑，并筛选出SOS1基因被修饰的植株进行抗盐检测。结果表明，CRISPR/Cas9体系能够对大豆的SOS1基因进行编辑并且这些突变是可遗传的。同时，SOS1蛋白C-末端的改变影响了大豆的抗盐能力，这直接证明了GmSOS1与大豆抗盐性相关。此外，我们的结果也为提高作物抗盐能力提供了一种可选途径。

关键词： 基因工程多肽   杂化纳米水凝胶   生物成像   靶向药物输送   光热治疗  

摘要： 治疗诊断学是一种将治疗学与诊断学结合起来的一种治疗策略。近年来，由于具有很高的药物装载效率和可控释放等优点，纳米水凝胶用于同时装载治疗药物和诊断试剂的载体而备受关注。特别是具有较高生物相容性和性质可调谐的基因工程多肽形成的纳米水凝胶颗粒。此外，无机纳米材料具有易于制备、稳定和独特的电学、光学和机械强度等特性而被广泛应用于生物成像、药物的转运及肿瘤的治疗中。基于此，本论文主要研究基于基因工程多肽和无机纳米材料的杂化纳米水凝胶颗粒的制备及研究其在生物医学中的应用。论文完成的工作如下：\n （1）设计和合成了一种新型的多功能QDs-多肽纳米水凝胶颗粒用于肿瘤的靶向成像和药物输送。杂化纳米水凝胶颗粒是将一种含有一个寡聚基蛋白P片段、一个拉链结构的片段A和一段水溶性的无序结构C10的卷曲人工多肽（PC10A或 PC10ARGD）通过其N端的六个组氨酸和CdSe/ZnS QDs表面的锌离子通过配位结合制备。杂化纳米水凝胶颗粒表面的人工多肽PC10A具有刚性结构，从而形成一种含有两层憎水性层（分别由P和A组成）和中间是一层亲水性C10层的“三明治”结构的杂化纳米颗粒。通过CE和动态光散射测量粒径及电位结果证明了QDs-PC10A和QDs-PC10ARGD杂化纳米水凝胶颗粒的“三明治”结构。我们能通过基因工程的方法构建不同结构的多肽来调节QDs-多肽杂化纳米水凝胶颗粒的物理特性，包括尺寸、形状、粘附区域和表面电位等。憎水性和亲水性的药物分别被装载在杂化纳米水凝胶颗粒的憎水层和亲水层内。QDs-多肽杂化纳米水凝胶颗粒能够作为一种同时应用于装载憎水性和亲水性药物的通用载体。QDs表面修饰的具有温度和pH敏感的多肽能够作为温度和pH控制释放杂化纳米水凝胶颗粒内装载的憎水性药物。QDs–PC10ARGD纳米水凝胶颗粒在αvβ3整合素受体过表达细胞的内吞要比αvβ3整合素受体低表达的细胞要高很多。QDs–PC10A比谷胱甘肽修饰的QDs对细胞具有较低的非特异性结合。相比于原始QDs，QDs-多肽纳米水凝胶颗粒对HeLa细胞和NIH3T3细胞的细胞毒性小很多。此外，靶向性的QDs-多肽纳米水凝胶颗粒对NIH3T3正常细胞比HeLa癌细胞的细胞毒性要低。这些结果表明QDs-多肽杂化纳米水凝胶体系将可能为靶向成像和药物输送提供一种新的方式和方法。\n （2）设计和构建了一种新颖的基于基因工程多肽修饰的金纳米棒用于近红外光控制释放其上修饰的生物活性配体和光热治疗联合疗法。感兴趣的生物活性配体通过基因工程的方法被融合到一个具有亮氨酸拉链结构的多肽A的C端。含有生物活体配体的多肽通过N端引入的一个半胱氨酸上的巯基和金形成金-硫键固定到金纳米棒表面。修饰了含有生物活性配体的多肽A的金纳米棒能够通过互补的亮氨酸拉链结构进一步和含有亮氨酸拉链结构的B-聚乙二醇（B-PEG）结合。多肽A上的活性配体能够被B-PEG上的PEG遮蔽。这种设计的优点是A和B能形成异二聚体使生物活体配体和PEG能在分子水平上一一相对应被固定在金纳米棒上。当多功能的金纳米棒聚集到靶向癌细胞或肿瘤后,金纳米棒的光热效应产生的热传给共固定在金纳米棒上的B-PEG使其变性而被移除从而释放被遮蔽的生物活性配体用于癌症的治疗。此外,功能化的金纳米棒能同步体现光热治疗效果。研究结果表明，通过810 nm的近红外激光照射，遮蔽的B-PEG能够被移除从而释放被遮蔽的RGD活性配体，并且对HeLa细胞具有较好的体外光热治疗效果。因此，我们设计的基于多肽修饰的金纳米棒采用近红外光控制控释系统将可能在靶向生物分子的输送和光热治疗领域具有很大的潜力。\n （3）采用带正电荷的金纳米棒和带负电荷的三段式多肽PC10ARGD通过静电吸附构建了一种新的杂化纳米水凝胶颗粒用于肿瘤的化疗-光热治疗。吸附在金纳米棒表面上的PC10ARGD多肽通过自组装的形式形成水凝胶。PC10ARGD形成的水凝胶除了能增加生物相容性外，还能增加纳米颗粒的稳定性。化疗药物DOX能够被装载在复合纳米水凝胶颗粒的水凝胶层内。构建的杂化纳米水凝胶在水、PBS、无血清的DMEM和含血清的DMEM中均具有较好的稳定性。杂化纳米水凝胶仍然保持良好的光热效应。其中包被的DOX能在低pH值和高温下具有较快的释放速度和较大的释放量。相对于CTAB包裹的金纳米棒，金纳米棒-多肽杂化的纳米水凝胶颗粒对HeLa细胞表现出较小的细胞毒性。化疗和光热治疗实验表明装载了DOX的金纳米棒-多肽杂化纳米水凝胶颗粒具有较好的化疗和光热治疗效果，其化疗和光热治疗效果都同复合颗粒的浓度相关，并且化疗和光热治疗存在协同效应。我们设计的这种杂化纳米水凝胶颗粒将为肿瘤的治疗提供一种新的思路和方法。\n （4）三段式的PC10A和PC10ARGD多肽在低浓度下能形成纳米水凝

关键词： 异常血红蛋白   高效液相色谱   DNA测序   筛查   分子诊断  

摘要： 目的应用高效液相色谱法(HPLC)检测异常血红蛋白(Hb)并对各异常Hb进行分子诊断。方法收集6 297例血样,采用HPLC检测各种异常Hb,应用Sanger测序法对各异常Hb进行DNA测序。结果共发现7种异常Hb,分别为Hb E(37例)、Hb Q(18例,其中3例为Hb Q-Hb H)、Hb S(2例)、Hb C(2例)、Hb D-Iran(3例)、Hb J-Bangkok(8例)、Hb J-Mexico(2例)。经DNA测序,Hb E、Hb Q、Hb C及Hb J-Bangkok得到确诊;2例Hb S中1例为Hb S纯合子,另1例为Hb G-Makassar;3例Hb D-Iran中2例为Hb G-Taipei,1例为Hb G-Coushatta;2例Hb J-Mexico被证实为Hb Ube-2。结论虽然HPLC能快速检测异常Hb,但只能进行"假设性诊断",确诊还需通过分子生物学方法。