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关键词： 乳腺癌   胚胎干细胞   抗肿瘤作用   Stat3信号通路   分子影像  

摘要： 在胚胎发育过程中，细胞的微环境对干细胞的增殖、分化起着重要的作用，并决定了干细胞的迁移以及分化方向。同时，在肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞可与周围微环境包括间质细胞和一些细胞因子等相互作用，直接地影响肿瘤细胞的增殖及生长，被认为与肿瘤的发生和转移是密切相关的。乳腺癌，作为一种恶性肿瘤，肿瘤细胞可以从原发部位，经淋巴循环等途径，到达其他部位形成转移灶。在这个过程中，乳腺癌细胞的微环境在肿瘤的发生和转移中起着至关重要的作用。\n 肿瘤细胞与正常干细胞具有类似的特性，如自我更新和定向分化，共同表达一些干性基因并分享类似的信号转导通路。但是肿瘤干细胞与正常干细胞不同，肿瘤细胞是一种失去分化可塑性的不可控制的增殖，二者命运的不同主要是由于所处细胞环境不同导致的。最近的研究报道了胚胎干细胞微环境对具有侵袭性的肿瘤细胞具有一定的抑制作用，但是这种作用的分子机制仍然不清楚。\n 在本项课题的研究中，应用小鼠胚胎干细胞培养上清作为微环境来培养小鼠乳腺癌细胞。探讨其能否产生抑制肿瘤生长的效果，并进一步探讨其作用机制。首先，为了利用分子影像技术对移植的细胞进行体内跟踪，对小鼠乳腺癌4T1细胞进行了基因转导。分别将携带有泛素启动子驱动的萤火虫荧光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的载体，以及连接的7个重复Stat3结合序列（增强子）增强启动的海肾荧光素酶基因的慢病毒载体进行4T1细胞的转染。利用能实时活体监测的分子影像技术分别在体外和体内水平上，对小鼠胚胎干细胞的抗肿瘤作用进行了研究。小鼠胚胎干细胞的条件培养液，能够抑制肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭和血管形成。对于大多数肿瘤而言，其恶性相关的特征与Stat3信号通路的激活紧密相关。因此，利用分子影像技术不仅在体外水平，也在活体内，对Stat3的激活情况做了实时监测，并发现小鼠胚胎干细胞抑制了乳腺癌细胞Stat3的激活，从而导致肿瘤发生和侵袭能力的降低。本课题为肿瘤细胞的研究提供了良好的平台并为将来乳腺癌的治疗提供可行的策略。

关键词： 干细胞   转化型研究   组织工程   移植   诱导多能干细胞   间充质干细胞   骨髓间充质干细胞   神经干细胞   胚胎干细胞   精原干细胞   肌肉干细胞   贴壁培养   共培养   三维培养   支架   增殖   分化   转化  

摘要： 背景:干细胞转化技术研究已成为干细胞研究的一个活跃领域,对干细胞基础研究及临床研究均产生巨大的推动作用。目的:对干细胞转化技术研究现状及进展做一综述。方法:在标题和摘要中,以"Stem cells,Transformation,differentiation"或"干细胞,转化,分化"为主题检索词,检索中国期刊全文数据库(CNKI)、PubM ed数据库中2000年1月至2015年4月关于干细胞分化技术的文章。优先选择近期发有或发表在权威杂志上的文章。初检得到121篇文章,根据纳入标准,选择其中的64篇进行综述。结果与结论:干细胞转化技术近些年来取得了较大的进展,包括改进培养液的配比,增加特定的诱导因子、蛋白质、酶、受体,注射特定的基因,使用新氧化剂,改善培养微环境,在低氧环境下培养,使用支架,采用转基因技术,三维球形培养,共培养等。干细胞转化新技术的诞生和使用,显著提高了干细胞的转化率,为人类难治性疾病的治疗带来希望。

关键词： 胚胎干细胞   多能性   细胞更新   ULK1蛋白  

摘要： 自噬是真核细胞中的一种高度保守的降解胞内组分的分解代谢过程。在应激条件下，自噬及时地降解胞内冗余的蛋白质，损伤的细胞器，以及其他有毒有害的大分子物质，保护了细胞免予走向衰老与死亡。而在正常生理条件下，自噬也为维持细胞内环境的稳定，确保细胞正常的生长、发育以及重塑提供保障。\n 干细胞因其独特的自我更新和多向分化潜能有别与其他种类的细胞。近年来，有研究发现自噬在成体干细胞的静止、自我更新、多能性的维持和分化过程中都有重要的调节作用。而在胚胎干细胞中，自噬是如何调控胚胎干细胞自我更新与多能性的尚不清楚。本研究选取在自噬起始阶段的一个重要调控蛋白ULK1，来探究自噬如何调控胚胎干细胞(ES)的多能性。研究结果发现，ULK1缺失的ES细胞的自噬流相比于野生型ES细胞是降低的。进一步检测发现，ULK1敲除的ES细胞自我更新能力和多能性基因的表达也都有显著的降低。当在ULK1缺失的ES细胞中过表达ULK1，ES细胞的自噬得到恢复，同时，其自我更新能力和多能性基因的表达水平也有显著的回升。提示ULK1通过自噬调控了ES干细胞的自我更新与多能性。ULK1的活性能够被AMPK磷酸化所激活，而被mTOR磷酸化所抑制。我们进一步研究发现AMPK与其磷酸化激活型ULK1(Ser555)，而不是mTOR抑制型磷酸化ULK1(Ser757)在ES细胞中的表达水平显著高于体细胞。为此，我们构建了激活型磷酸化位点突变的ULK1(S317A，S555A，S777A)和抑制型磷酸化位点突变的ULK1(S757A)在ULK1缺失的ES细胞稳定表达的两种细胞系，结果发现在稳定表达ULK1激活型磷酸化位点突变的ULK1-/-ES细胞中，ULK1无法被AMPK所激活，导致其自噬流低于过表达野生型ULK1的ES细胞，与之对应的是其自我更新能力与多能性基因的表达水平也显著低于过表达野生型ULK1的ES细胞。而在稳定表达抑制型磷酸化位点突变的ULK1-/-ES细胞系中，ULK1虽然无法被mTOR所磷酸化，但其自我更新能力与多能性基因的表达水平没有受到影响。综上所述，我们研究发现，在ES细胞中，AMPK通过磷酸化ULK1激活自噬，从而调控了ES细胞的自我更新与多能性。

关键词： 肝脏疾病   细胞治疗   人胚胎干细胞   源性肝细胞   分化体系  

摘要： 目前，肝脏的常见疾病包括肝纤维化、肝炎、肝硬化及肝脏肿瘤等，在临床上的常规治疗手段包括抗病毒治疗、肝脏移植及人工肝辅助装置。此外，一些针对肝脏疾病的细胞治疗已经进入临床试验阶段，为肝脏疾病治疗带来新的希望。目前可用于移植的细胞类型主要有干细胞和肝细胞，干细胞主要包括脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs)等成体干细胞，而肝细胞根据来源可分为成体肝脏分离肝细胞和胎儿肝脏分离肝细胞。成体肝脏分离肝细胞资源有限，胎儿肝脏分离肝细胞存在功能不完全和伦理问题，因此人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)或人诱导性多能干细胞(human inducedPluripotent Stem Cells，hiPSCs)来源的肝细胞成为细胞治疗新的细胞来源。但是hiPSCs因为引入外源因子存在安全问题，所以hESCs更适合制备肝细胞。在本研究中，我们模拟肝脏体内发育过程，使用三段分化的方法，将临床级人胚胎干细胞分化成为肝细胞。这些临床级人胚胎干细胞源性的肝细胞具有正常肝细胞的形态、基因表达、蛋白表达等方面的特性，并具有代谢相关基因表达、白蛋白分泌、脂肪聚集、糖原储存等功能，无致瘤性风险，符合生物安全性标准。通过用胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、维生素C镁盐将分化第二阶段的血清替代物（Knock-out Serum Replacement，KOSR）替换，我们建立了一种成分简单的稳定的分化体系。我们获得的临床级人胚胎干细胞源性的肝细胞和建立的分化体系，将为临床上肝脏疾病的治疗提供重要的细胞资源和技术平台。

关键词： 裂殖壶菌   基因组测序   苹果酸酶   基因过表达   油脂组分  

摘要： 二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，简称DHA)属于ω-3系列的多不饱和脂肪酸，是神经系统细胞生长维持以及大脑和视网膜的重要组成成分，具有增强视力、预防高血压、动脉硬化、心血管疾病、老年痴呆、抗炎、抗癌等功效。而裂殖壶菌是常用的DHA生产菌株，经发酵后油脂积累可以达到产品干重的50％，DHA在成品油脂中的比例能占到40％或更多。\n 本论文是在对裂殖壶菌全基因组测序的基础上，对编码基因进行功能注释，筛选出关键的编码基因，并利用本实验室已构建的裂殖壶菌遗传转化系统，对裂殖壶菌中苹果酸酶基因(EC1.***.1.40)进行过表达，获得高油脂产量的裂殖壶菌重组菌，主要的研究内容和结果如下:\n 1、基于illumina Hiseq2000测序平台，对裂殖壶菌Schizochytrium ***-308全基因组进行测序分析，得到裂殖壶菌基因组大小为39.09Mb，GC含量含量56.06％。对所测得并组装好的基因组进行基因预测以及编码区分析，共获得9142个编码基因，并对基因功能进行注释，从注释结果中筛选得到了功能注释为苹果酸酶(EC1.***.1.40)的基因序列。\n 2、采用酶切连接手段构建了过表达苹果酸酶表达框（含泛素启动子，苹果酸酶基因和泛素终止子），将表达框导入本实验室已经构建好的裂殖壶菌遗传转化体系，并转入裂殖壶菌中表达，促进NADPH的生成，从而使得裂殖壶菌中的油脂产量能有所提高。对HX-ME菌株进行摇瓶发酵考察，发酵结果显示原始菌株和HX-ME菌株的最终生物量分别为61.05 g/L和67.29 g/L，油脂含量分别达到25.79 g/L和29.12 g/L。对油脂组分分析之后发现，工程菌和原始菌所产的油的组分分布基本一致。并且通过发酵过程中对细胞形态大小观察可以发现，HX-ME菌株的细胞明显比原始菌株大，由此可说明苹果酸酶基因的过表达对细胞的生长代谢产生了一定改变，提高了油脂产量。\n 3、在5L发酵罐中对原始菌株HX-308和重组菌HX-ME菌株进行培养，考察基因表达的稳定性同时，对菌体发酵生长过程中生物量，糖耗，油脂产量以及油脂组分等进行了考察，发酵结束时HX-308和HX-ME菌株消耗葡萄糖分别为209 g和235 g，积累的油脂产量分别达到52.78g/L和59.23 g/L，HX-308的糖油转化率为25.25％，而HX-ME的转化率为25.20％，两者相差不大。重组菌HX-ME相比于野生菌HX-308油脂产量提高了12％，耗糖速率也快了12.4％。随后对油脂组分进行了分析，HX-308和HX-ME相比较，其中脂质中含量最高的饱和脂肪酸十六烷酸的含量占总油脂的比例都在25％左右，不饱和脂肪酸DHA的含量也都在40％左右。脂质分布的相似说明了苹果酸酶的过表达对裂殖壶菌中脂肪酸合成途径并没有什么影响，由此可以得出结论，苹果酸酶的过表达对油脂的积累确实有促进作用，一定程度上提高了油脂产量。

关键词： 市场规模   肿瘤   中国   医疗   临床应用   人口死亡率   基因组图谱   DNA测序  

摘要： 据生物探索网消息报道,肿瘤是全球人口死亡率最高的疾病。得益于DNA测序和肿瘤基因组图谱项目的突破,人们对引发肿瘤分子变化的理解更加深入,对致癌基因组信息的新理解已影响到了药物和抗体设计过程中。国际医药巨头和风险投资者早已瞄准了这一炙手可热的领域。Illumina公司的数据显示,全球NGS（二代基因测序）的应用市场规模预计为200亿美元,药品研发和临床应用是增速最快的领域。

关键词： 胚胎干细胞   Tet酶   调控端粒   基因组   稳定性  

摘要： Tets家族催化5-甲基胞嘧啶转变为5-羟甲基胞嘧啶。Tets对于维持胚胎干细胞的自我更新能力和多能性是必需的，通过介导DNA的甲基化影响整个基因组水平的重编程。Tets在体内的功能可以通过Tets敲除的小鼠得到验证，然而有意思的是缺失Tet1和Tet2的小鼠，如果可以逃脱发育缺陷并存活下来，不会立即有表型显现。端粒可以维持基因组的稳定性，对于维持胚胎干细胞和诱导多能干细胞的无限自我更新能力和多能性是至关重要的。端粒长度缩短或端粒功能异常会导致衰老和肿瘤的发生。本文中的结果表明Tet1和Tet2对维持端粒功能和基因组稳定性是必要的。在小鼠胚胎干细胞中单独干扰Tet1或Tet2，尤其是同时干扰Tet1和Tet2，导致端粒长度缩短，端粒丢失和染色体融合频率上升造成基因组稳定性异常，端粒长度缩短与重组频率下降是相吻合的，最终导致破坏了小鼠胚胎干细胞的体内发育能力。\n Tet1和Tet2同时敲除的细胞也表现出端粒长度缩短，但是与对照相比端粒缩短的程度没有同时干扰Tet1和Tet2引起端粒长度缩短的程度大。5mC在亚端粒区的富集水平和亚端粒区的甲基化水平在同时敲除Tet1和Tet2的细胞中是升高的。更明显的是Tet1/2/3同时敲除的细胞表现出端粒长度的异质性，端粒丢失和染色体融合频率的上升。\n 机制上分析，干扰或敲除Tets（Tet1和Tet2）提高了Dnmt3b的表达水平，降低了DNA羟甲基化水平(5hmC)，导致亚端粒区的甲基化上升。相吻合的是干扰Dnmt3b可部分恢复缺失Tet1和Tet2造成的端粒缩短。有意思的是同时敲除Tet1和Tet2和同时敲除Tet1，Tet2和Tet3的细胞与对照相比都是Zscan4表达上调，而Zscan4可以通过调节重组延长端粒，所以Zscan4的上升中和了端粒缩短。总之Tets通过调节亚端粒区的甲基化水平在维持端粒功能和基因组稳定性方面发挥重要作用。研究结果揭示Tets通过维持端粒功能与胚胎干细胞的多能性，发育潜能，衰老和肿瘤发生联系在一起。

关键词： 脊髓损伤   胚胎干细胞   基因转染   Mash-1   神经分化   小鼠  

摘要： 目的观察过表达Mash-1基因的胚胎干细胞在脊髓损伤部位向神经细胞分化的情况及其对脊髓神经损伤的修复作用。方法采用鼠干细胞病毒将Mash-1基因转染CE3小鼠胚胎干细胞稳转株。4周龄雄性SPF级昆明小鼠钳夹法建立急性脊髓损伤模型。造模后3 d向脊髓损伤部位注射生理盐水(模型组,n=12)、CE3胚胎干细胞(CE3组,n=12)、转染Mash-1基因的CE3小鼠胚胎干细胞(CE3-Mash-1组,n=12)。术后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d检测小鼠后肢功能评分。术后14 d、28 d分别处死小鼠,HE染色观察脊髓剩余面积;CE3组、CE3-Mash-1组行Oct3/4、nestin、β-tubulinⅢ、神经胶质酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色,观察移植细胞的分化。结果与模型组比较,移植CE3和CE3-Mash-1细胞的小鼠运动功能均提高(F>84.471,P<0.05),脊髓剩余面积增加(F>49.990,P<0.05)。与移植CE3细胞相比,移植CE3-Mash-1细胞在损伤的脊髓部位Oct3/4阳性细胞数显著减少(t=5.439,P<0.001),而nestin(t=-7.536,P<0.001)和β-tubulinⅢ(t=-9.941,P<0.001)阳性细胞数显著增加,GFAP阳性细胞数无显著性差异(t=1.701,P=0.120)。结论过表达Mash-1基因可促进CE3细胞在脊髓损伤部位分化成神经元,促进小鼠后肢运动功能的恢复。

关键词： 转基因作物   产业化   动态博弈   动力机制   策略分析  

摘要： 准确把握供方、消费者及政府等关联主体在转基因作物产业化过程中的利益诉求及相互关系,有利于看清问题的经济学本质。基于三者不同的成本收益特征,通过动态博弈策略分析方法,分析转基因作物产业化行为及其动力和时机选择问题。结果表明:是否应该实施转基因作物产业化以及以哪种方式产业化并不是由单个经济主体决定的,而是供方、消费者和政府3方共同作用的结果;同时,刚性的责任行政机制及涉及转基因作物安全的民间组织建设有利于克服政府监管低效的弊端。

关键词： 生物技术   种植业   养殖业   基因工程  

摘要： 生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程等,在农业领域有着广阔发展前景。生物技术可保障粮食安全,促进农村农业经济的发展,提高农业产出效益,同时能为医药工业及其它产业提到原料。农业生物技术是新兴的现代技术,还不能在传统农业中大规模推广应用。