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关键词： 基因   转基因   转基因作物   转基因作物污染   侵权责任  

摘要： 随着人口增加,粮食、环境、土地等资源危机的日益严重,20世纪50年代开始,农业领域发生了两次绿色革命,即以农作物杂交、化肥与灌溉的普及为主导的第一次绿色革命以及21世纪转基因技术兴起带来的转基因农作物种植的第二次绿色革命。两次绿色革命都极大地提高了粮食的产量,解决了最关键的粮食安全问题,促进了社会的发展。但是随着第二次绿色革命的进一步发展,转基因农作物商业化种植也带来了一系列问题,如因环境释放不当(1)造成的污染侵权以及对农民人身权益、财产权益的侵权即是其中的重要问题。本文在大量阅读相关文献的基础上,主要分两部分对转基因农作物污染侵权进行论证:一是对生态环境的侵害。转基因农作物种植过程中不适当的存储环境、运输环境以及环境释放,造成的基因污染侵权。二是对农民权益的侵害。首先,对农民留种权的侵犯;其次,转基因农作物混入他人非转基因农作物中,该权利人为清除污染增加了种植成本;再次,转基因农作物与他人的非转基因农作物发生杂交,导致传统农作物受到转基因农作物的污染,提供有机农产品的农民丧失了其市场机会。综上,本文将以转基因农作物安全问题为视角,以转基因农作物种植过程中造成的“基因污染”以及对种植者造成的损害为切入点,通过深入了解转基因技术及转基因农作物的发展,审视现行侵权责任法相关理论,提出转基因农作物基因污染是一种新型环境侵权。本文主要包括以下四个部分:文章第一部分首先对转基因相关概念进行了简明的阐释,其次对转基因农作物种植在国内外的发展现状进行简单的介绍,为转基因农作物种植污染侵权事件的发生奠定了现实基础,最后对我国与转基因农作物种植污染侵权的相关法律规范进行解析,得出我国在对这一侵权行为进行规制时缺少全方位立法的结论。文章第二部分主要是针对英美法系、大陆法系典型国家关于转基因农作物种植活动的法律规制予以研究。对两大法系关于转基因农作物种植过程中的侵权问题的研究现状进行考察,通过对两大法系主要国家关于转基因农作物种植过程中防范侵权损害的法律实践的研究发现,这些国家在开展转基因农作物种植活动中存在着共性。这些域外经验对我国转基因农作物的种植具有重要的借鉴意义。针对转基因改造技术,我国应参考域外的经验,在发展转基因农作物种植活动中,既要慎重又要大胆,不能因噎废食(1)。文章第三部分主要是从归责原则、构成要件两个方面对转基因农作物基因污染侵权理论研究进行重构。对转基因农作物污染侵权责任的归责原则以及构成要件进行建构:转基因农作物污染侵权是一种新型的环境侵权行为,与一般的环境侵权相比较有自身的特殊性,笔者认为,在该类侵权事件中,在对相关责任人进行责任认定时,不能直接照搬一般环境侵权的相关规则,而是应该针对特定情形进行分析。文章第四部分在对转基因农作物基因污染侵权相关理论介绍的基础上,笔者首先提出在我国现行《侵权责任法》中对转基因农作物污染侵权进行专门规制。其次,笔者提出在转基因农作物商业化种植已成趋势的今天,我国应借鉴相关国外立法制定专门的《转基因生物安全法》,为转基因农作物种植提供明确的法律依据,促进我国转基因技术在农业领域的发展。

关键词： 菌影   递呈系统   Cap蛋白   佐剂  

摘要： 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的重要病原,PCV2含有2个主要的开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF2编码的衣壳蛋白(Cap)是主要结构蛋白,具有良好的免疫原性,是发展新型亚单位疫苗的良好靶蛋白。细菌菌影(Bacterial ghost,BG)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。一方面,BG也可以作为佐剂,增强机体对抗原的免疫反应;另一方面,BG可以做为递呈系统,把目的蛋白更好的递呈给抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)。本实验中,利用两种不同的递呈系统,分别把Cap蛋白锚定在菌影的周质与外膜上,并进行了免疫效果评价。为了评价递呈在菌影周质与外膜上的Cap蛋白对猪的免疫效果,本研究将Cap蛋白分别与Gene III和INP信号序列融合表达。同时把裂解基因E盒克隆于同一个载体中,分别构建重组载体p MD-GKB-Cap-E和p MD-28a-Cap-E,然后转化BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达。结果表明,递呈在菌影周质中与外膜上的Cap蛋白均可有效表达。然后分别以BL21(p MD-GKB-Cap-E)与BL21(p MD-28a-Cap-E)菌影免疫4-6周龄的仔猪,一免三周后二免,并监测抗体水平。二免二周后,ELISA检测免疫组抗体水平显著高于对照组,表明菌影可以良好的递呈Cap蛋白,并具有很好的免疫原性。PCR检测攻毒后每周猪体病毒血症的变化,BL21(p MD-28a-Cap-E)菌影免疫组没有检测到病毒血症。然而,对照组在攻毒后2周到4周都可以检测到病毒血症。攻毒后28 d,免疫组腹股沟淋巴中病毒载量比对照组的病毒载量大大减少,且差异显著(p<0.01)。同时,对照组与免疫组相比表现出更低的体重增长率(p<0.05)。以上表明,菌影递呈外源Cap蛋白可以起到良好的免疫保护效果。为了评价APP菌影作为Cap蛋白佐剂的免疫效果,我们以500μg r Cap蛋白分别与1010CFU APP菌影以及ISA 61佐剂混合乳化作为亚单位免疫组,同时设灭活苗免疫组免疫4-6周龄仔猪并进行免疫效果评价。r Cap+APP菌影免疫组通过血清学检测抗体表明,它可以刺激机体产生体液免疫反应,比r Cap+ISA61佐剂免疫组诱导出更高的抗体水平(p<0.05)。PCR检测攻毒后猪体病毒血症的变化,r Cap+APP菌影免疫组没有检测到病毒血症,然而,对照组在攻毒后2周到4周都可以检测到病毒血症。攻毒后28 d,r Cap+APP菌影免疫组腹股沟淋巴中病毒载量比对照组和r Cap+ISA61佐剂免疫组的病毒载量显著减少,且差异显著。同时,r Cap+APP菌影免疫组比对照组表现出显著增高的体重增长率(p<0.05)。以上结果表明,APP菌影可以作为良好的佐剂显著增强机体免疫反应,提高机体的抗病原感染能力。为了研究猪传染性胸膜肺炎与圆环病毒病二联苗,我们还尝试把Cap蛋白递呈表达于APP菌影中。首先我们把递呈质粒的表达元件从p MD19-T载体上克隆到穿梭载体p LS88与p GZRS-18上,然后把构建成功的两个质粒电转化到APP S8菌株中,Western blot和SDS-PAGE均没有检测到目的蛋白的表达,考虑到可能是Cap基因的启动子在APP中没有被识别。然后我们把APP外膜脂蛋白oml A基因启动子克隆到两个表达载体上,依然没有检测到目的蛋白的表达。我们推测可能是Cap蛋白在APP中表达量太小,不容易检测到。我们根据文献报道,又分别把sodc与T4启动子克隆到Cap基因上游,依然没有检测到目的蛋白。根据以上结果,我们推测,APP的RNA聚合酶可能不识别外源启动子,利用本身的启动子也很难大量表达外源蛋白。

摘要： Technology guides the practice of scientific inquiry. In the biological sciences, DNA sequencing has encouraged the commingling of traditional experimental biology and computer science. In this thesis, I describe computational and biochemical methods for DNA sequencing technology. Nanopore DNA sequencing is an single-molecule technology that shows promise in the area of read lengths, instrument portability, and, as shown in this work, chemical modification detection. A nanopore sequencing device contains a nanometer-sized pore that separates two electrolyte buffer reservoirs. A voltage potential is applied across the nanopore and the device records the ionic current through pore. As DNA polymers translocate through the pore they modulate the ionic current by partially obstructing the pore in a sequence-dependent manner. In Chapter 2 I describe a hidden Markov model for the nanopore ionic current and how a hierarchical Dirichlet process can be used to model new non-canonical (modified) bases affording a HMM-HDP model. In chapter 3 I show how the model can detect multiple chemical modifications to DNA. The last section of the paper describes a biochemical method to re-read DNA sequences using a nanopore and a helicase enzyme.

关键词： 胚胎干细胞   杂合二倍体   大鼠   异种   小鼠   小家鼠  

摘要： 文章简介物种间杂交个体因其具有独特的杂合遗传背景和性状,而为研究物种形成、基因调控进化和X染色体失活的机制提供了重要模型。然而由于物种间存在生殖隔离——即不同物种间的个体即使交配也不能产生后代或者产生的后代不可育,种间杂交只在近亲物种间发生。以往人工创造出的哺乳动物远亲物种间的杂合细胞,

关键词： 人胚胎干细胞   神经嵴细胞   ALX基因   细胞迁移   细胞增殖   细胞凋亡  

摘要： 研究背景:人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)是从囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离培养得到的一类具有亚全能分化能力的干细胞,具有自发向三胚层来源细胞分化的潜能[1],并能向特定方向诱导分化,因此hESCs在基因治疗、组织工程学和药学研究等众多领域具有广泛的应用价值[2]。神经嵴细胞(neural crest cells,NCCs)是脊椎动物胚胎发育过程中短暂存在的一类多能细胞群。在早期胚胎发育过程中,NCCs出现在神经管隆起的神经褶,而后广泛迁移到各处[3],在环境的作用下可向内、中、外三个胚层分化成多种细胞类型,包括感觉神经元、骨细胞、软骨细胞、色素细胞、肾上腺髓质细胞以及平滑肌细胞等[4]。由于NCCs可以分化发育成颅面部绝大部分骨、软骨以及结缔组织结构,因此NCCs可以作为体外研究胚胎早期颅面发育过程和机制的细胞模型。ALX基因家族属于同源框基因中PRD家族中的一个亚家族,该基因家族成员包括ALX1(Cart1)、ALX3和ALX4[5]。研究发现,该家族成员的突变会引起一种特殊的颅面部发育畸形——鼻额发育不良(Frontonasal dysplasia,FND)[6]。许多研究表明ALX基因家族在颅面部发育中起着重要的作用。但是目前ALX基因家族成员在各种细胞的表达水平和功能都尚不明确。研究目的:1.获取H9hESCs来源NCCs(H9-NCCs)并鉴定其生物学特性2.明确ALX家族基因在H9-NCCs及其来源分化细胞中的表达水平3.明确ALX基因家族成员对H9-NCCs的生物学特性的影响研究方法和结果:1.H9 hESCs来源NCCs的获取、培养和鉴定方法:利用体外同时添加Wnt通路激活剂和Smad通路抑制剂的方法将H9 hESCs诱导分化形成NCCs(H9-NCCs),观察H9hESCs及H9-NCCs的细胞形态,并通过免疫荧光染色和Real-time PCR方法鉴定H9 hESCs及其来源的H9-NCCs的特定标志物的表达。通过添加成神经和成间充质干细胞诱导分化液将H9-NCCs分别诱导分化成外胚层来源的外周神经细胞和中胚层来源的间充质干细胞(MSCs)并对得到的MSCs进行成骨成脂诱导分化,检测H9-NCCs的多向分化能力。结果:H9hESCs呈克隆样生长,边界光滑,结构致密。在诱导7天左右有菱形细胞从H9 hESCs细胞克隆边缘爬出,细胞在3-4天左右融合,标记为P0代H9-NCCs;Real-time PCR检测P4代H9-NCCs标志物的表达结果显示与hESCs相比,H9-NCCs 高表达 NCCs 标志基因 SOX9、SOX10、P75、HNK-1、AP2 和ZIC1,而低表达hESCs的标志基因NANOG和OCT4。免疫荧光染色结果显示H9-NCCs高表达NCCs标志物蛋白HNK-1和P75。体外成神经诱导分化14天后,H9-NCCs细胞变长,可观察到神经纤维状突起的形成。免疫荧光染色结果显示,分化得到的细胞高表达外周神经元标志物β-tubulin III和peripherin。H9-NCCs在MSCs分化诱导培养基中培养5-7天后可观察到细胞从NCCs的菱形转变成MSCs样的长梭形,流式细胞分析结果显示,H9-NCCs来源MSCs(H9-NCC-MSCs)高表达MSCs表面标志物CD90,CD105,CD73和CD44,不表达造血干细胞标志物CD34、CD116、CD19、CD45和HLA-DR。此外,H9-NCC-MSCs成骨诱导分化14天后经茜素红染色可观察到深红色钙结节存在,但成脂分化14天后油红O染色未见脂滴形成。***家族基因在H9hESCs,H9-NCCs及其来源分化细胞中的表达水平方法:Real-time PCR 检测 H9 hESCs、H9-NCCs、外周神经细胞、H9-NCC-MSCs及其来源成骨细胞中ALX1、ALX3和ALX4的表达水平。结果:在H9hESCs和H9-NCCs中,ALX家族基因表达量并没有明显差异,但ALX1在H9-NCCs中的表达量显著高于在H9-NCC-MSCs及其分化得到的成骨细胞中。ALX3和ALX4在表达模式上具有相似性,ALX3在H9-NCC-MSCs特异性的高表达,而ALX4在外周神经细胞和H9-NCC-MSCs及其分化得到的成骨细胞中均高表达。3.过表达ALX家族基因对H9-NCCs的生物学特性的影响方法:构建过表达ALX家族基因(ALX1,ALX3,ALX4)的慢病毒载体转染293T细胞并收集病毒感染H9-NCCs,检测过表达ALX家族基因对H9-NCCs生物学特性的影响;利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖能力;利用Annexin V/

关键词： 琥珀酸   大肠杆菌   高渗透压胁迫   基因工程   耐受性能  

摘要： 琥珀酸是重要的碳四平台化合物，利用生物法替代石化法合成琥珀酸具有良好的发展前景。目前，琥珀酸的生物制备过程效率依然较低，研究如何增强生产菌株对高渗透压胁迫的耐受能力是实现琥珀酸高效制备的重要技术需求之一。　　本论文面向高渗透压胁迫耐受型细胞工厂的构建，通过采用不同的抗逆元件，对产琥珀酸大肠杆菌*** Suc260进行基因工程改造，考察了内源过表功能性基因甜菜碱合成关键基因betAB和海藻糖合成关键基因otsBA提高Suc260耐受高渗透压胁迫以及琥珀酸产量的可行性，并考察了外源引入调控基因DR1558提高菌株渗透压胁迫耐受性实现琥珀酸的高效制备的可行性，从分子角度对DR1558蛋白的作用机理进行解析，结合相关基因转录水平的变化和ATP、相容性物质的浓度的变化解析胞内ATP和渗透保护物质的积累与菌株高渗透压胁迫耐受性能之间的关系。　　本论文主要内容如下:　　首先考察了外源添加甜菜碱、海藻糖和甘油对*** Suc260的渗透保护效果，结果表明外源添加甜菜碱和甘油可明显提高*** Suc260在高渗透压胁迫下的生长及代谢性能。在此基础上，通过过量表达甜菜碱合成途径关键酶胆碱脱氢酶编码基因betA和甜菜碱醛脱氢酶编码基因betB，构建甜菜碱合成能力强化的重组菌*** Suc360(Suc260/pTrc99a-betAB)。5-L罐发酵数据表明，发酵过程中重组菌Suc360最大细胞干重和丁二酸产量分别达1.97 g/L和48.5 g/L，比对照菌Suc260提高了14.3％和10.9％。另外外源添加海藻糖不能明显提高***260在高渗透压胁迫下的生长及代谢性能。有文献报道海藻糖在进入细胞时被降解，故拟采用过量表达海藻糖合成途径关键酶6-磷酸海藻糖合酶编码基因otsA和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶编码基因otsB，构建海藻糖合成能力强化的重组菌*** Suc460(Suc260/pTrc99a-otsBA)。5-L罐发酵数据表明，重组菌Suc460生长性能没有提升反而降低，而且产酸性能没有明显提升，其最大细胞干重和琥珀酸产量分别达1 g/L和43.61 g/L，较对照菌有所降低。　　其次，将来自于耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans的调控蛋白DR1558分别利用Trc启动子和GroE启动子在*** Suc260中表达分别构建重组菌*** Suc560(Suc260/pTrc99a-DR1558)和*** Suc660(Suc260/pMD19T-GroE-DR1558)。5-L罐发酵实验显示，利用Trc启动子过表DR1558的重组菌株Suc560最大细胞干重和琥珀酸产量分别达1.77 g/L和53.45 g/L，较对照提高了12.8％和12.1％。利用GroE启动子组成型表达DR1558的重组菌株Suc660生长产酸性能明显提升，其最大细胞干重和琥珀酸产量分别达2.06 g/L和55.4 g/L，较对照提高了14.7％和12.5％。　　最后，以Suc660和Suc260为研究对象，解析DR1558蛋白的作用机理。RT-PCR结果显示，构建菌株Suc660的糖转运相关基因(galP和glk)以及能量代谢相关基因（pfkA、pykF、pck和ppc）的转录水平较出发菌株Suc260都有所提高。其中糖转运相关基因galP、glk转录水平上调2和2.4倍;琥珀酸生成途径中与ATP合成相关基因pck、ppc、pfkA和pykF转录水平分别上调3.3、1.3、4.6和4.3倍。另外甜菜碱合成基因betA和betB转录水平分别上调了6.4和3.3倍，海藻糖合成基因otsB、otsA转录水平分别上调5.1和4.2倍;甘油降解相关基因glpK、glpA、gldA转录水平分别下调2.4、3.2和1.5倍。为进一步解析DR1558提高菌株对高渗透压胁迫的耐受机制，分别对Suc660和Suc260菌体内的ATP、甜菜碱、海藻糖和甘油含量变化趋势进行了分析。结果显示发酵过程中，重组菌Suc660胞内的ATP、甜菜碱、海藻糖浓度均高于对照菌Suc260。此外，甘油的含量较出发菌株Suc260低。因此我们认为DR1558通过上调ATP、甜菜碱、海藻糖合成基因及糖转运相关基因的转录水平，使得菌株胞内相容性物质甜菜碱、海藻糖和ATP的积累量提高，并最终提高菌株对高渗透胁迫的耐受性。

关键词： 类丝弹性蛋白   蛋白薄膜   二硫键交联   甲醇处理   基因工程  

摘要： 基因工程类丝弹性蛋白(Silk Elastin-Like Proteins,SELPs)是由类丝蛋白模块(GAGAGS)和类弹性蛋白模块(GXGVP,X为除脯氨酸外的任意氨基酸)串联重复组成的嵌段共聚物,兼具丝蛋白优良的力学特性和弹性蛋白的刺激响应性,同时还具有性能高度可调性、良好的生物相容性和生物可降解性,因而在药物控制释放、基因传输和组织工程等领域获得了广泛的关注。SELPs可以被加工处理成如纤维、水凝胶和薄膜等各种不同的材料形式以满足上述各种领域的特殊性需求。据以往报道,SELPs可在甲醇诱导下或通过化学物质戊二醛进一步交联形成不溶于水的薄膜,但是这些处理方法却不利于该膜应用于包裹一些对有机溶剂敏感的药物、蛋白和细胞的研究。为了解决上述问题,在本实验室前期利用基因工程的方法构建的三种含有周期性半胱氨酸的重组蛋白SE8C、S2E8C、S4E8C工作的基础上,本研究开发了新的交联方法,即通过向SELP溶液中加入微量的H2O2促进类弹性蛋白模块形成二硫键交联制得不溶于水的透明薄膜,并就薄膜的溶解性、溶胀性、亲疏水性、表面粗糙度、对热稳定性以及细胞相容性等性质进行了探究,并与和甲醇诱导类丝蛋白模块物理交联而制备的薄膜进行了对比。结果表明,二硫键交联能够通过拉近分子间的距离赋予SELP薄膜以不同的特性,使薄膜表面光滑,水中稳定性增强,同时具有良好的生物相容性。此外对比结果还表明,二硫键交联更适用于类丝蛋白模块比例较低的SELP,而甲醇诱导交联则更适用于类丝蛋白比例较高的SELP。如果能够将蛋白聚合物的设计构建与交联策略合理地结合起来,就可以制备具有各种潜在应用价值的蛋白薄膜材料。本研究的结果对于定制化构建具有特殊特性需求的SELP材料具有重要的参考价值,同时对于含有类似半胱氨酸含量的蛋白聚合物的交联也具有一定的借鉴意义。

关键词： 乳链菌肽   乳酸乳球菌   同源重组   过表达   工程菌株   发酵条件优化  

摘要： 乳链菌肽(Nisin),是由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis laactis)在其生长代谢过程中分泌的一种生物多肽类细菌素,具有良好的抑菌效应,对一些食源性腐败菌或有害菌具有强烈的抑制或杀灭作用。长期以来,该抗菌肽主要作为一种安全高效的天然绿色生物防腐剂普遍用于食品加工企业。此外,在医药研究(抗生素替代品、生殖避孕、医学移植、肿瘤研究)及农业饲料等领域也极具广阔的应用前景。而在当前经济与技术条件下,商品化Nisin的生产主要通过微生物发酵方法进行,尚存在工业化产率低,生产成本较高等共性问题。随着生物防腐剂市场需求的日益增大,合理选育Nisin高产菌株,优化其生产菌发酵性能,提高Nisin工业生产的发酵水平,降低发酵生产成本,已然成为亟需解决的问题。尽管采用传统诱变、基因组杂交等微生物筛选技术选育Nisin高产菌株已取得一定效果,但这些方法筛选过程复杂繁琐,工作量较大,获得高产菌株的效率低,而且所获得高产菌株往往容易退化,不足以支持长期稳定的发酵应用。近些年来,随着生物技术的快速发展与应用,Nisin的生物合成基因簇及其代谢调控途径已逐渐得以清晰阐明,越来越多的研究人员尝试基于代谢途径工程技术来构建高效表达Nisin的基因工程菌株,以期望进一步提高Nisin的工业化水平。目前Nisin产生菌的代谢工程改造主要通过对影响Nisin生物合成的相关负调控基因进行敲除或改变其合成途径中特定元件表达水平,或对Nisin的生物合成途径进行异源表达来提高其发酵性能。本论文基于对Nisin生物合成途径中关键基因的功能表达及其调控机制的认识,以乳酸乳球菌ATCC11454基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得Nisin生物合成途径中的关键基因nisA(前体基因)ORF和nisRK(调控基因)片段,并通过同源重组技术将nisAORF和nisRK基因克隆至高拷贝的表达质粒pMG36e中,构建得到重组表达载体pMG36e-nisA和pMG36e-nisA-nisRK。以Nisin产生菌乳酸乳球菌LS01为受体菌,通过电转化和抗性筛选,获得过表达nisA的工程菌株LS01/pMG36e-nisA及联合过表达nisA和nisRK的工程菌株LS01/pMG36e-nis4-nisRK。摇瓶发酵结果显示,工程菌株LS01/pMG36e-nis4 的 Nisin 效价可达 1955 IU/mL,比原始菌株(1472 IU/mL)提高了 32.8%;工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK的Nisin效价峰值达到2470 IU/mL,比原始菌株提升了 67.8%。生物量测定分析表明,工程菌LS01/pMG36e-nisA和LS01/pMG36e-nisA-nisRK的生长状况相对于原始菌株也发生了较明显的变化,其最大生物量相对于原始菌株均略有降低,且后者下降更明显。半定量RT-PCR检测结果表明,目的基因nisA、nisR和nisK在工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK中的转录水平均得到了上调,证实了基因nisA、nisR和nisK的过表达对Nisin的生物合成具有显著促进作用。利用响应面实验设计对工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK进行摇瓶发酵培养基的筛选与优化,以进一步提升工程菌株的发酵性能。结果获得优化后培养基组成为:蔗糖25.06 g/L,玉米浆粉末8.8 g/L,酵母粉10 g/L,KH2PO4 5 g/L,NaCl 2 g/L,MgS04-7H20 0.3 g/L,CaC033.5g/L,Tween-80 2.7 g/L。摇瓶验证结果表明,优化后工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK的Nisin发酵水平可达到3037 IU/mL,比优化处理前提升了 23%,比原始菌株产量更是提高了 106%。利用所得的最佳发酵培养基与工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK在10 L发酵罐中进行分批补料发酵研究,结果表明优产工程菌株在该发酵体系中Nisin发酵效价可达6380 IU/mL,比原始生产菌在初始发酵培养基条件中产量提高了 46.2%,较大地发挥了工程菌株的发酵潜力。综上所述,利用基因工程手段结合发酵优化不仅可以快速准确筛选到目标高产菌株,克服原始产生菌作为乳链菌肽生产菌的劣势,而且对乳链菌肽的工业化扩大生产及其应用具有重要意义和潜在参考价值。

关键词： 转基因技术   基因工程   张桃林   转基因生物安全   可控  

摘要： 近年来,转基因食品的相关问题备受争议。3月7日,农业部副部长《中国战略新兴产业》杂志总顾问张桃林在两会记者会上从技术和监管两个方面阐释了转基因技术的安全性是可控且有保证的,国家将继续积极稳妥地发展转基因技术。从技术层面来讲,张桃林介绍,转基因技术是现代生物科技前沿技术,在农业的节本增效、资源高效利用、

关键词： 裂殖壶菌   DHA   基因工程   敲除   过表达   苹果酸  

摘要： 对提高裂殖壶菌二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)发酵产量的传统研究大多集中于菌种筛选、培养基优化和发酵策略的调控上。随着基因工程技术的发展,从基因水平上调控DHA合成途径的代谢流,已受到越来越多的关注。利用基因工程技术改造裂殖壶菌的DHA合成途径,相比于传统手段,主要优势在于能够从根本上提高裂殖壶菌的DHA产量,而无需增加额外的发酵成本。然而,目前DHA的合成机制仍处于探索阶段,因此要从基因水平上调控DHA合成途径的代谢流还面临不少的挑战。本文以裂殖壶菌LU310为研究对象,构建了裂殖壶菌基因敲除体系,并成功实现了目的基因的敲除,该体系可用于敲除DHA合成途径竞争代谢支路的限速酶,促使相关代谢流向DHA合成途径,从而提高裂殖壶菌的DHA发酵产量。基于此,本文又构建了裂殖壶菌的基因过表达体系,并成功实现了丙二酸单酰转移酶(MAT)的过表达。摇瓶发酵显示,MAT过表达菌株的生物量、总油脂产量、DHA产量、丙二酸单酰转移酶活性分别比野生型提高了 3%、5.5%、6.6%、10.2%,结果说明MAT的过表达对裂殖壶菌的DHA合成具有一定的促进作用。苹果酸酶能够催化苹果酸生成丙酮酸和NADPH,后者能为裂殖壶菌DHA合成提供大量的还原能力。基于此,本文通过在发酵培养基中添加1.5 g/L的苹果酸,考察苹果酸对裂殖壶菌DHA合成的作用机制。摇瓶发酵显示,添加苹果酸后裂殖壶菌的生物量、总油脂产量、DHA产量、苹果酸酶活性和胞内NADPH含量相比对照组分别提高了 2.8%、9.4%、16.5%、21.1%、13%,结果说明苹果酸作为苹果酸酶的前体物质,能够激活苹果酸酶活性,提高NADPH的生成量,为DHA合成途径提供充足的还原能力,进而提高裂殖壶菌的DHA发酵产量。此外,在添加1.5 g/L苹果酸的条件下,MAT过表达菌株与野生型菌株的发酵性能差异更为明显。