关键词：
人胚胎干细胞
视网膜前体细胞
生物学特性
视网膜变性疾病
细胞移植
摘要：
背景:视网膜变性疾病（retinal degeneration,RD）是一类以视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞或/和视网膜光感受器细胞功能异常而引起视网膜光感受器细胞凋亡为病理改变的致盲性眼病。RD的治疗包括细胞移植、基因治疗、药物治疗和人工视网膜假体等。眼部细胞移植具有可操控性,效果易于评价,是国内外研究的热点。视网膜前体细胞（retinal precursor cell,RPC）、诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）、胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）等多种来源的种子细胞用于移植至RD动物模型视网膜下腔,以观察细胞移植治疗视网膜变性疾病的效果。组织特异性来源的RPC在体外可悬浮或贴壁培养,有一定的增殖能力和分化能力,移植至RD动物模型的视网膜下腔后可在一定程度上延缓视网膜变性的发展和改善视网膜功能。然而,组织特异性来源RPC来源局限,限制了其作为临床转化细胞的应用。iPSC可经患者自身成熟细胞诱导而来,具有较强的增殖能力和分化能力,在一定程度上减少了免疫排斥问题,将其来源的RPC移植至视网膜变性动物模型的视网膜下腔,可在一定程度上延缓视网膜变性的发展和改善视网膜功能。但是iPSC的转化效率较低,增加了其作为移植细胞的成本和难度。目前,经美国食品与药品管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准,人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）来源的RPE细胞可用于Stargardt病和干性年龄相关性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration,AMD）的Ⅰ/Ⅱ期临床实验,研究结果显示在平均22月的随访中,移植细胞可以改善或维持部分患者的视功能,没有发现异常增殖。本研究选择用hESC作为研究对象,拟利用人胚胎干细胞来源的视网膜前体细胞作为移植细胞观察其对RD的治疗作用。本研究共分为三部分:第一部分:检测本实验室hesc的干性特征和增殖能力。第二部分:由hesc定向向视网膜前体细胞诱导分化,并对诱导分化过程中各个阶段用细胞免疫荧光（immunocytochemistry,icc）,流式细胞术（flowcytometry,fcm）和细胞周期检测等方法进行鉴定,了解hesc在体外分化的生物学特性,明确适合于眼部移植细胞的发育阶段。人胚胎干细胞作为临床转化细胞的一个重大问题是其具有致瘤性。由于胚胎干细胞的无限增殖能力,其在宿主体内可能会无限增殖而致瘤。阶段特异性胚胎表面抗原（stage-specificembryonicantigens,ssea）是胚胎干细胞的特异性标记物,在人胚胎干细胞中表达为阶段特异性胚胎表面抗原4（stage-specificembryonicantigen4,ssea4）。因此,为了降低hesc来源的细胞在宿主体内的致瘤性,本实验在进行细胞移植前,拟采用流式细胞分选术（fluorescence-activatedcellsorting,facs）,用反向选择的方法,将诱导分化过程中残留的ssea4阳性的人胚胎干细胞排除,选择ssea4阴性的hesc来源rpc作为移植细胞,检测移植细胞的致瘤风险。第三部分:在第二部分的基础上,借助流式细胞分选术,将hesc来源的视网膜前体细胞用反向选择的方法排除ssea4阳性的细胞。将筛选的ssea4阴性的视网膜前体细胞移植至视网膜变性疾病动物模型皇家外科学院（royalcollegeofsurgeon,rcs）大鼠视网膜下腔,以评估hesc来源的rpc移植治疗视网膜变性疾病的效果;同时,将hesc来源的rpc移植至严重联合免疫缺陷小鼠皮下,以评估其安全性,为hesc向临床转化治疗rd提供理论依据。第一部分人胚胎干细胞的培养鉴定及拟胚体的形成目的:检测人胚胎干细胞的干性标记和增殖能力;探索适合于本研究的拟胚体（embryonicbody,eb）形成方法。方法:体外培养人胚胎干细胞株h1,采用细胞免疫荧光染色、流式细胞检测术、细胞周期检测和细胞增殖曲线绘制等方法对人胚胎干细胞标记物ssea4及细胞株h1的增殖能力进行鉴定。比较悬浮培养法、悬滴培养法及aggrewelltm400培养板培养法形成的拟胚体的数量和大小。结果:1.体外培养的单个人胚胎干细胞特点:体积小,核大,核与细胞质的比例高。细胞集落特点为界限清晰,中心区发亮。2.流式细胞术检测结果表明,不同代数p42、p47和p52人胚胎干细胞ssea4阳性比例分别为97.88±2.21%,98.04±1.85%和98.00±2.02%,差异无统计学意义（p＞0.05）。细胞免疫荧光染色数据分析结果显示,p42、
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