关键词：
锌指蛋白296
胚胎干细胞
小鼠
摘要：
锌指蛋白（zinc finger protein）家族是人体内最大的蛋白家族,同时也广泛分布在动植物和微生物中,参与基因表达调控、细胞分化、胚胎发育等过程。近年来,人们更是陆续发现了众多与干细胞重编程相关的锌指蛋白,如锌指蛋白281（zinc finger protein 281,Zfp281）、锌指蛋白42（zinc finger protein 42,Zfp42）、锌指蛋白57（zinc finger protein 57,Zfp57）等。锌指蛋白296（zinc finger protein 296,Zfp296）是属于Krüppel C2H2型锌指蛋白家族的蛋白,由445个氨基酸残基组成,包括两个基本锌指元件,在多能性细胞和生殖细胞中均能特异性表达,参与构建了多能性转录调控网络,并被用作未分化的胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和重编程细胞的标记基因。在此基础上,本文旨在探索完善Zfp296在干细胞多能性网络中的作用。实验结果和内容如下:1、本研究首先在宏观上通过免疫荧光（Immunofluorescence,IF）对Zfp296在NIH/3T3和F9细胞中进行了亚细胞定位分析,证明其主要富集在细胞核中。在F9细胞中,通过实时定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测Zfp296表达变化对关键多能性因子、表观遗传因子以及三胚层标记基因表达水平的影响,发现过表达Zfp296能上调多能性相关基因表达水平,如Klf4、Sox2、Oct4和Nanog;影响表观遗传相关基因的表达水平,如Tet1、Tet2、Dnmt3a;上调中胚层标记因子T、Bmi1的表达水平,下调内胚层、外胚层和滋养层标记因子Gata4、Fgf5、Cdx2表达水平。而敲降Zfp296能下调多能性相关基因的表达水平,如Eras、Oct4和Klf4;上调内胚层、外胚层和滋养层标记因子Gata4、Fgf5和Cdx2的表达水平。2、我们利用双荧光素酶报告试验（Dual luciferase reporter assay,DLR）、q RT-PCR和免疫印迹（Western blotting）对调控Zfp296基因活跃水平的上游因素进行探索,发现诸多与干细胞多能性调控相关的小分子化合物对Zfp296的基因启动子活性、转录水平和蛋白水平都有一定的影响。在此基础上,进一步研究揭示了LIF/STAT3信号通路和Wnt/β-catenin信号通路对Zfp296的调节作用,即后者作为两个通路的下游靶标发挥作用。3、为了进一步探索Zfp296对关键多能性相关因子的影响,我们把研究重心放在寻找与Zfp296有特定调控关系,特别是有蛋白互作关系的多能性因子上。通过检索GEO Profiles数据库,我们发现Zfp296在合子激活期高表达。据此,我们筛选了一些高表达时期与Zfp296一致的多能性相关因子,如:Nanog、Oct4、Dppa3和Tet3;还有一些在Zfp296高表达的合子激活期有定位异常和功能缺失的因子,如:Dnmt1、Uhrf1和G9a,进一步展开研究。q RT-PCR和Western blotting检测发现,在m RNA转录水平和蛋白水平上,Zfp296都能促进Nanog基因的表达,抑制Uhrf1基因的表达,DLR证明了过表达Zfp296能显著增强Nanog启动子活性。通过蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-ip）我们证实了Zfp296与Nanog、Zfp296与Uhrf1之间均存在蛋白水平上的互作。以上结果证明,Zfp296是Nanog的关键互作蛋白之一,并对其起着正向调节的作用;而Zfp296与Uhrf1之间互作关系的生物学意义也有待进一步挖掘。总之,本研究证明了Zfp296在干细胞多能性网络中发挥着多重作用,不仅能受到LIF/STAT3信号通路和Wnt/β-catenin信号通路的调控,还与Nanog以及Uhrf1之间存在着调控与互作关系。同时,这些研究对完善干细胞多能性调控网络做出了重要的理论补充,为相关领域的研究提供了新线索、新思路。
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