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ISBN: (纸本)9787301282830

关键词： environmental ethics   cancer registry/resource   bioethics  

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关键词： 人胚胎干细胞   多巴胺能分化   帕金森病   膜片钳   细胞电生理  

摘要： 目的:观察人胚胎干细胞是否可以分化为形态学和电生理功能上成熟的多巴胺能神经元(DA能神经元),评估干细胞源DA能神经元是否符合在体DA能神经元的电生理特性。方法:本研究在无饲养基培养系统中,采用单层贴壁培养法,通过BMP/SMAD双通道抑制,定向诱导人胚胎干细胞H9分化为DA能神经元,并通过细胞免疫荧光、扫描电镜、透射电镜和膜片钳等检测方法,从形态学、三维超微结构、电生理特性方面分析H9源DA能神经元的各项特征。参照公认的在体DA能神经元电生理评估标准,评价H9源DA能神经元电生理特性。通过SPSS19.0软件进行分析。P<0.05认为有统计学差异。结果:在体外诱导分化中,H9表现出从典型干细胞形态到典型神经元形态的变化过程:胚胎干细胞时细胞呈铺路石样,大小相近,形状均一,胞质透亮,伴高核质比;换神经诱导培养基后,细胞形状变小变圆,胞间间隙日益紧密;第十六天细胞聚集成花环状,挑克隆悬神经球,镜下观察神经球大小均一、质感细腻;换促神经元成熟培养基继续培养,神经球贴壁分化,第40天镜下可见典型神经元样细胞。我们选用Nestin对DA能神经元诱导分化进程中的神经干细胞做特异性标记,镜下观察到大量的阳性细胞。我们对分化终产物也进行了标记,包括神经元标志物MAP2、DA能神经元标志物TH和A9 DA能神经元标志物GIRK2。镜下观察到MAP2/TH双阳性细胞和TH/GIRK2双阳性细胞,分别是DA能神经元和A9 DA能神经元,分化效率分别是28%和18%。本研究通过扫描电镜和透射电镜检测,对分化产物神经元的超微结构进行探究。我们观察到H9源产物神经元符合DA能神经元典型形态学和超微结构,包括:细胞器、细胞核、核糖体、神经丝和神经突触,这些结果表明本实验终产物是成熟的DA能神经元。与此同时,我们对H9源DA能神经元进行了电生理检测,证实该神经元具备发育成熟的电压门控离子通道、配体门控离子通道,并具备发射动作电位序列的能力。分析H9源DA能神经元的电生理特性,符合在体DA能神经元的电生理评价标准。结论:综上所述,本研究采用BMP/SMAD双通道抑制法定向诱导人胚胎干细胞H9分化为形态学和电生理功能均发育成熟的多巴胺能神经元。本研究获得H9源DA能神经元与公认的在体黑质致密部DA能神经元的电生理特性相符合,这对移植后续模型动物的神经功能恢复和神经网络重塑提供了更可靠的理论支持和技术保障。

关键词： 肝素酶Ⅰ   低分子肝素   可溶表达   纯化   定点突变   酶学性质  

摘要： 肝素酶Ⅰ(heparanase Ⅰ,HepⅠ)是一种能降解肝素或肝素类结构物质的多糖裂解酶,在制备低分子量肝素、消除体外循环血液中肝素以及测定肝素类物质结构等方面具有十分重要的作用。肝素酶Ⅰ最初来源于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum),但其产量低、活性低、稳定性差,而基因工程表达产品则极易形成无活性的包涵体。为了解决以上问题,本论文从提高基因工程表达肝素酶Ⅰ的可溶性及分子改造寻找具有更高活性的肝素酶Ⅰ突变体等方面着手,开展了如下研究:根据大肠杆菌对密码子的偏爱性对F heparinum,肝素酶Ⅰ基因进行优化并合成目的基因,经酶切、连接后插入到大肠杆菌表达质粒pE-SUMO上,构建得到表达载体pE-SUMO-HepⅠ,转化大肠杆菌*** Rosetta(DE3)后筛选获得HepⅠ基因工程表达菌株,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示目的蛋白得到了有效的可溶性表达,且检测发现融合肝素酶Ⅰ具有较好的酶活。接下来,为了提高肝素酶Ⅰ蛋白的表达水平,我们对诱导温度、诱导转速、诱导剂浓度和诱导时间进行了优化。结果表明,重组大肠杆菌的最佳诱导表达条件为:在37℃培养到OD600为0.6时,加入终浓度为 0.6 mM 的 IPTG,150 rpm,30℃诱导培养 9h。为了进一步提高HepⅠ活性,我们通过对HepⅠ蛋白质结构及功能域的生物信息学分析,选择性的对肝素酶Ⅰ进行定点突变,得到了 S169D、A259D和C297S等三种突变体,通过对基因工程表达获得的三种突变体蛋白质进行酶活分析,结果表明S169D、A259D和C297S突变体的比酶活分别为37.8 IU/mg、17.9 IU/mg和42.1 IU/mg,分别是野生型HepⅠ的1.65、0.78、1.83倍。其中,由于S169D为本研究首次发现的高活性突变体,我们着重对其进行了后续分析,结果显示S169D的最适诱导表达条件为:在37℃培养到OD600为0.6时,加入终浓度为0.6 mM的IPTG,200 rpm,30℃诱导培养12 h,进一步的酶学性质分析显示其最佳反应温度为30℃,最佳pH值7.0,最佳CaCl2浓度为50 mM。综上所述,本研究利用SUMO标签融合表达策略建立了 HepⅠ的高效可溶性基因工程表达体系,并首次发现了 HepⅠ的一种高活性突变体S169D,为提升HepⅠ及低分子肝素等药物的生产效率奠定了新的基础。

关键词： Crisis   bioethics   Opioids   Conversation  

摘要： "Changing the Conversation: A Critical Bioethics Response to the Opioid Crisis."The American Journal of Bioethics, 17(12), pp. 53–54

关键词： 人胚胎干细胞   胰岛素分泌细胞   维甲酸   miR-375  

摘要： 人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)是一种多潜能干细胞,具有在体外无限增殖、自我更新和向机体各种类型细胞分化的能力。hESCs在特定条件下可分化为胰岛素分泌细胞(Insulin-producing cells,IPCs),可以用于移植治疗Ⅰ型糖尿病,以解决临床治疗器官来源不足的问题。MiR-375是胰腺发育和成熟过程中必不可少的转录调控因子,在胰岛β细胞和非β细胞中均有表达,能够提高胰岛素转录水平,促进胰岛β细胞增殖。因此,研究miR-375在hESCs向IPCs分化过程中的作用,对于提高hESCs向IPCs分化的效率,获得单一表达Insulin的成熟胰岛β细胞具有重要意义。本研究在特定条件下使hESCs向IPCs分化,分化过程包括终末内胚层(Stage Ⅰ)、原肠(Stage Ⅱ)、内分泌前体(Stage Ⅲ)和胰腺内分泌细胞(Stage ⅣV)四个阶段。先以分化体系中的维甲酸(Retinoic acid,RA)为变量优化分化条件,再分别采用慢病毒介导的稳定过表达和脂质体介导的瞬时过表达提高细胞miR-375的表达水平,通过实时定量PCR检测miR-375和分化各阶段标志性基因Foxa2、Cxcr4、Ngn3、Pdx1、Insulin、Glucagon、Somatostatin的相对表达量,并通过免疫荧光染色和Elisa检测胰岛素合成和分泌情况,从而研究过表达miR-375对hESCs分化为IPCs的影响。1、为了优化hESCs分化为IPCs的培养条件,在终末内胚层向内分泌前体细胞分化的不同时间段添加2μMRA对细胞进行诱导,分别为不添加RA、在Stage Ⅱ 添加 RA、在 Stage Ⅲ 添加 RA、在 Stage Ⅱ 和 Stage Ⅲ 都添加 RA。研究发现在没有RA诱导的条件下,hESCs未能成功分化为IPCs;在Stage Ⅱ添加RA的条件下,胰向分化相关基因Foxa2、Cxcr4、Ngn2、Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatoststin的相对表达量最高,并且在此条件下细胞一直保持良好的生长状态。因此在细胞分化Stage Ⅱ添加2 μMRA可作为分化培养的最佳条件。2、通过对hESCs进行慢病毒介导的miR-375稳定过表达,发现慢病毒感染会对hESCs的生长状态造成极大影响,降低细胞增殖分化能力并增加细胞凋亡,使细胞在分化早期大量死亡,进而导致hESCs无法分化产生IPCs。3、对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 mimic转染,发现在分化早期过表达miR-375会提高Foxa2和Cxcr4的相对表达量,在分化中期过表达miR-375会提高Ngn3和Pdx1的相对表达量,在分化末期过表达miR-375会提高Insulin的相对表达量同时降低Glucagon和Somatostatin的相对表达量。并且瞬时过表达miR-375可促进胰岛素的合成和分泌。因此,在hESCs向IPCs分化过程中过表达miR-375可提高胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平,降低分化末期细胞多激素共表达程度,促进β细胞成熟和胰岛素分泌。

关键词： PCV2   免疫增强剂   基因工程苗   角鲨烷   PoIFN-γ  

摘要： 猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus2,PCV2)是一种猪群易感染的常见病原体,与多种猪群传染性疾病的爆发流行有关。最为常见的疾病是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS),为有效控制及消灭PCV2的爆发流行,各国学者均致力于PCV2有效疫苗的研发。PCV2 Cap蛋白是目前研发PCV2基因工程疫苗的首选靶抗原。另有研究表明,免疫增强剂是一类免疫促进剂及免疫刺激剂,主要功能是增强机体的抗肿瘤、抗感染、纠正免疫缺陷能;免疫增强剂具有激活体内多种免疫活性细胞,增强机体特异性及非特异性免疫功能,还能发挥佐剂作用,强化与之配合使用的抗原免疫原性,从而加速诱导免疫应答反应。目前免疫增强剂种类很多。本研究对七种免疫增强剂进行筛选,包括黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C),Po-IFN-y蛋白和Po-GM-CSF蛋白,目的是筛选对本实验室制备的PCV2-Cap蛋白疫苗有最佳增强效果的免疫增强剂。1.黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)对PCV2基因工程疫苗的免疫增强研究为探究免疫增强剂对PCV2基因工程疫苗的免疫增强作用,本研究制备了黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)等5种免疫增强剂+PCV2Cap疫苗。制备方法均按PCV2-Cap蛋白:Gel 01佐剂:免疫增强剂体积比为75:20:5来配置疫苗。采用腹腔注射方式免疫小鼠。21 d后进行攻毒试验,以鉴定5种免疫增强剂的免疫保护效力。采用间接ELISA方法测定免疫21 d血清PCV2特异性IgG抗体水平,结果表明,Poly(I:C)与角鲨烷两种增强剂能诱导疫苗产生更高水平的PCV2特异性IgG抗体,显著提高PCV2疫苗的免疫原性。CUSABIO试剂盒检测鼠免疫后21 d小鼠淋巴细胞经Con A刺激后上清当中IL-4、IL-6、IFN-γ细胞因子浓度,结果表明:角鲨烷能显著促进PCV2Cap疫苗诱导小鼠分泌IL-6和IFN-γ。Poly(I:C)仅有轻微促进作用。PCV2攻毒后21 d,采用荧光定量PCR检测PCV2病毒血症及脾脏的PCV2载量,结果表明:角鲨烷能辅助PCV2-Cap疫苗减轻攻毒后PCV2的病毒血症及降低脾脏病毒携带水平。因此,角鲨烷与PCV2-Cap蛋白混合免疫能显著增强PCV2-Cap疫苗的免疫保护作用;Ploy(I:C)虽然也能提高该疫苗的细胞免疫水平,但对病毒血症及脾脏病毒携带量的控制不如角鲨烷作用明显。2.黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)组成的复方对PCV2基因工程疫苗的免疫增强研究为探究复方免疫增强剂对PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增强作用,本研究根据免疫增强机制和搭配禁忌,从黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)5种免疫增强剂中挑选2到4种组合成6组复方,构成复方免疫增强剂+PCV2 Cap疫苗。制备方法均按PCV2-Cap疫苗:Gel 01佐剂:免疫增强剂体积比为75:20:5来配置疫苗。采用腹腔注射方式免疫小鼠。21 d后进行攻毒试验,以鉴定6种复方免疫增强剂的免疫保护效果。采用间接ELISA方法测定免疫21 d血清PCV2特异性IgG抗体水平。CUSABIO试剂盒检测鼠免疫后21 d小鼠血清当中IL-4、IL-6、IFN-γ细胞因子浓度。PCV2攻毒后21天,采用荧光定量PCR检测PCV2病毒血症。综合结果表明:黄芪多糖+盐酸左旋咪唑+Poly(I:C);黄芪多糖+盐酸左旋咪唑+角鲨烷+Poly(I:C);黄芪多糖+Poly(I:C)三组复方增强剂能辅助PCV2-Cap疫苗减轻攻毒后PCV2病毒血症。因此,这三组复方免疫增强剂和PCV2-Cap蛋白混合免疫能显著增强PCV2-Cap疫苗的免疫保护作用,三组中,黄芪多糖+Poly(I:C)组免疫增强效果最佳;其余三组复方疫苗虽然也能提高体液或者细胞免疫水平,但对病毒血症的缓解不如这三组作用明显。3.猪IFN-y与猪GM-CSF的表达和纯化通过PCR进行目的基因扩增、双酶切、与载体连接、转化、鉴定,制备PoIFN-γ-pCold I-Fh8和PoGM-CSF-pCold I-Fh8重组菌液;最终进一步对重组菌进行诱导蛋白表达,并且优化IPTG诱导浓度、时间,提高蛋白表达效率;最终,猪IFN-γ以包涵体形式表达,而猪GM-CSF大部分以可溶性形式表达。最后,采用GE蛋白纯化柱对蛋白进行纯化,获得浓度分别为1.6 mg/ml和2.6 mg/ml的猪IFN-y、猪GM-CSF两种细胞因子类重组蛋白。为进一步研究猪IFN-γ、GM-CSF两种细胞因子类蛋白对PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增强作用提供基础。4.猪IFN-]与猪GM-CSF对PCV2-Cap基因工

关键词： BIOMETRY   BIOCHEMICAL markers   COLLEGE athletes   DOPING in sports   DRUG use testing   GENETIC privacy   MORAL & ethical aspects  

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关键词： 阿尔茨海默病   疫苗   β淀粉样肽   Tau  

摘要： 阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)作为神经退行性疾病的一种,它主要导致患者的认知能力和学习记忆能力的迅速下降,从而给患者带来了身体和心理的双重压力,同时给家庭和社会也带来了经济负担。目前阿尔茨海默病的发病率越来越高,患病人数越来越多,全球各个国家已经引起高度重视,科研工作者正在尝试研发各种药物来预防和治疗此疾病。关于阿尔茨海默病的发病原因目前有很多观点,认可度最高的是淀粉样蛋白级联假说,该理论认为APP蛋白的异常降解导致患者大脑中产生大量可溶性Aβ42或Aβ40肽,其进一步的聚集导致了大脑内堆积大量的淀粉样斑块,并引起Tau蛋白的积累形成神经纤维的过度缠结,导致离子失去平衡进而引起神经元细胞的坏死。近来大量研究证明,AD发病的一个重要的可能原因是体内积累的β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)寡聚体产生的神经毒性,导致神经元损伤和功能的衰退,出现记忆和认知功能的障碍,所以以Aβ作为靶标包括主动免疫和被动免疫的治疗方案便应运而生。靶向Aβ的AN-1792疫苗临床试验失败的原因是Aβ42肽的T细胞表位引发了自身毒性的T细胞免疫反应,所以本研究采用人源Aβ42的B细胞表位Aβ15多肽12拷贝重复串联以模拟Aβ寡聚体结构特性,并融合辅助T细胞表位构建了重组融合抗原12Aβ15-TF;该重组融合抗原可能能够避免引起自身免疫反应,保证疫苗的安全性,也能特异地清除具毒性的Aβ寡聚体以达到防治AD的目的。将以上编码12Aβ15-TF抗原的基因克隆入原核表达载体pTIG-Trx中,随后对原核表达的重组蛋白进行纯化以得到高纯度的重组蛋白抗原。以本实验室先前制备的候选6Aβ15-TF作为平行对照,将其作为亚单位疫苗并联合Al佐剂免疫普通C57BL/6小鼠,测定免疫后小鼠的体液免疫水平以及细胞免疫水平,确定该疫苗的免疫原性。实验结果显示,重组亚单位疫苗联合Al佐剂对小鼠进行四次免疫后,免疫组的小鼠体内产生了高的抗Aβ42的特异性抗体,最高抗体滴度可以达到1:40000左右。抗体亚型的测定结果表明这两种疫苗产生的抗体亚型主要是IgG1,并伴随着一定数量的IgG2b,所以产生的免疫反应均主要是Th2型体液免疫应答反应。淋巴细胞增殖结果表明,免疫后的C57BL/6小鼠主要产生针对辅助性T细胞表位特异性的细胞免疫反应,没有产生针对Aβ42的T淋巴细胞免疫反应。这些结果提示此亚单位疫苗产生的抗体反应可能能够特异性的中和或者清除体内的Aβ42分子,达到缓解或治疗阿尔茨海默病的作用。利用Al佐剂联合6Aβ15-TF和12Aβ15-TF两种重组表位嵌合抗原在3×Tg-AD模型小鼠身上进行疫苗免疫治疗效果的研究,5次免疫后测定血清抗体水平,结果表明免疫后3×Tg-AD模型小鼠体内也产生了较高水平的针对Aβ42肽的抗体,抗体水平可以在体内维持较长的时间;对抗体亚型测定的结果进行分析表明疫苗免疫3×Tg-AD模型小鼠后产生了较高的IgG1型抗体,并且伴随着一定量的IgG2b抗体,与免疫C57BL/6小鼠时结果相似,均产生Th2型体液免疫应答反应,因此可能不会引起Th1型免疫炎症反应。以上实验表明该重组疫苗与6Aβ15-TF一样免疫小鼠后诱导机体产生较强的Th2型体液免疫反应,这提示该疫苗在临床试验时可能不会产生Aβ42特异性Th1型免疫炎症反应,具有较好的安全性。重组表位嵌合抗原免疫后的3×Tg-AD模型小鼠在20月龄的时候进行行为学评价,结果表明3×Tg-AD模型小鼠经过疫苗治疗后,小鼠的学习记忆和认知水平有了一定的提高,提取脑组织蛋白进行AD病理相关蛋白的检测,检测结果证明治疗后的小鼠一些突触性蛋白的含量相比未治疗组小鼠发生了明显的良性变化。脑组织蛋白检测的结果表明,Dynamin1的表达量在患有AD的小鼠中有所下降,免疫组Dynamin1蛋白表达量明显高于对照组;与突触相关的PSD-95蛋白水平的表达与AD模型小鼠的病理过程呈现负相关,免疫组与对照组相比,PSD-95蛋白水平上调,表明重组表位嵌合疫苗能够很好地保护小鼠的突触功能;与对照组相比,免疫组的GluR1蛋白的含量也有了一定的上调,表明免疫组的突触功能也得到很好的保护。此外对3×Tg-AD模型小鼠脑组织内可溶性及不可溶性Aβ40、Aβ42和Tau蛋白的含量进行测定,发现经这两种疫苗免疫后模型动物脑内可溶性Aβ40、Aβ42和Tau蛋白含量明显减少,而不可溶性Tau蛋白的含量没有明显变化,并且12Aβ15-TF组比6Aβ15-TF组小鼠可溶性Aβ40、Aβ42和Tau的含量减少得更明显。总之,本研究设计与制备的12Aβ15-TF重组蛋白疫苗对AD的病情具有良好的免疫治疗效果,能够减少AD病理变化,保护突触蛋白的降解,改善行为学能力,表明它可作为一个候选疫苗用于预防或免疫治疗阿尔茨海默