关键词：
大肠杆菌
甘油
基因工程
适应性进化
L-丝氨酸
摘要：
随着生物柴油制造业的持续发展,其副产物甘油的量也大幅度的增加,如何利用甘油生产高附加值的产品成为研究的热点。L-丝氨酸属于非必需氨基酸,在医药、化妆品等领域有着广泛的应用。如果将过剩的甘油转化成市场需求量大的L-丝氨酸,将会实现资源充分利用,且在一定程度上降低L-丝氨酸的生产成本。本论文以野生型大肠杆菌W3110为研究对象,对其L-丝氨酸合成途径、降解途径、转运途径以及甘油利用途径进行改造,构建了一株以甘油为底物,发酵产L-丝氨酸的重组大肠杆菌,并对菌株进行发酵培养基优化,提高了重组大肠杆菌的发酵性能。论文的主要研究结果如下:(1)L-丝氨酸是细胞的初级代谢产物,经L-丝氨酸脱氨酶(L-ser DH)催化生成丙酮酸。通过依次敲除tdcG、sdaA、sdaB,得到重组菌GAA,L-丝氨酸积累量为0.06 g/L,但菌株的生长有所下降,OD600最大值为8.1,较野生型大肠杆菌W3110下降了12.9%,重组菌在甘油利用方面没有显著变化,发酵18 h,甘油消耗完全。(2)3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)是L-丝氨酸生物合成途径的关键酶也是限速酶,受到L-丝氨酸的反馈抑制作用。定点突变PGDH 344、346、364位为丙氨酸,得到重组菌4W。发酵54 h,重组菌4W的L-丝氨酸产量为1.1 g/L,同时发现甘油利用明显变慢,发酵42 h,甘油消耗完全,且菌株的生长明显下降,OD600最大值为4.8,高浓度的L-丝氨酸可能对菌株生长有一定的抑制作用。(3)针对4W甘油消耗变慢的问题,通过适应性进化,得到重组菌4WA,发酵30h,甘油消耗完全,L-丝氨酸产量达到1.35 g/L。针对4W生长受到L-丝氨酸抑制的问题,在菌株4W中过表达具有L-丝氨酸转运功能的蛋白编码基因eamA(编码半胱氨酸转运蛋白),得到重组菌株4WE,其OD600最大值为5.87,L-丝氨酸的产量达到1.96 g/L。甘油在24 h消耗完全。(4)进一步在进化的菌株4WA中增强表达基因eamA,得到重组菌4WAE,发酵结果显示,L-丝氨酸的积累量达到2.36 g/L,最大OD600为6.1,甘油24 h消耗完全。对重组菌4WAE进行培养基优化,L-丝氨酸产量可达到3.0 g/L。在5 L发酵罐上的分批结果显示,发酵18 h,甘油消耗完全,发酵24 h,OD600达到最大值9.4,发酵30 h,L-丝氨酸积累量达到最高3.23 g/L。随后对重组菌株进行补料分批发酵,结果显示,发酵42 h,OD600最大值为15.48,L-丝氨酸产量达到7.53 g/L。
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