教学课程资源库 更多>>

关键词： 人胚胎干细胞系   癌症   多能性   Nature  

摘要： 根据一项新的研究,在用于基础研究或临床开发的140种人胚胎干细胞系当中,5种人胚胎干细胞系在肿瘤抑制基因TP53上获得突变。其中的两种人胚胎干细胞系H1和H9已用于人体中,不过还没有证据证实它们在受者体内导致癌症产生。相关研究结果在线发表在Nature期刊上,论文标题为"Human pluripotent stem cells recurrently acquire and expand dominant negative

关键词： 邻苯二甲酸单乙基己基酯   小鼠胚胎干细胞   细胞毒性   机制研究   SOX2   OCT4  

摘要： 目的邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)是工业上常用的塑化剂,广泛地存在于我们日常生活的各种商品中。PAEs会对机体的内分泌系统、心、肝、肺、肾及生殖系统等多种组织系统产生慢性毒性作用,存在一定的危险性。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是 PAEs 中使用最为广泛的一种化合物,而邻苯二甲酸单乙基己基酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)是DEHP在机体内的代谢活化产物,其毒性较DEHP更强。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC)是一种能够无限增殖、自我更新、可分化为机体各种细胞的多能性细胞,因其对受试物有较好的灵敏性,是近年来常用的体外替代实验对象。为了探究MEHP的毒性作用,本研究就MEHP对小鼠胚胎干细胞的多能性维持的影响及其可能的机制进行研究,进而为胚胎早期发育的影响因素及相关机制的研究提供理论依据。方法1.细胞培养:用小鼠胚胎成纤维细胞(辐照后)(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)支持培养小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cell,mESC),于 37℃、5%CO2的培养箱中培养,隔天换液,5～7天可传代一次。用碱性磷酸酶染色法检测mESCs是否分化,被染成蓝紫色的mESCs表示细胞未出现分化,说明该批次细胞可用于后续实验。2.受试物的配制:称取MEHP溶于DMSO中,滤菌后,用mESCs培养液配制含0.1%DMSO的对照溶剂组及0.1、1、10、100、1000μmol/LMEHP的不同染毒剂量组。***细胞形态观察:用含有不同浓度受试物的培养液培养细胞,在镜下观察MEHP对mESCs细胞形态的影响。4.细胞毒性检测:用含有不同浓度受试物的培养液培养细胞,将MEHP处理后的细胞进行细胞活力检测(CCK8法)和细胞凋亡检测(流式细胞术),分析MEHP对mESCs的细胞毒性。5.碱性酸酶活性检测:将MEHP处理后的细胞用碱性磷酸酶染色液进行染色,分析MEHP对mESCs多能性维持的影响。6.基因表达水平检测:将MEHP处理后的细胞,提取总RNA后,反转录生成cDNA,以Real-time PCR法检测多能性维持标记物SOX 2、OCT 4基因表达水平的变化。7.蛋白表达水平检测:将MEHP处理后的细胞分别用免疫荧光法和Western-blot法检测SOX 2、OCT 4蛋白表达水平的变化。结果1.细胞形态观察发现,随着染毒剂量的增加,mESCs的克隆细胞团的数量出现降低,细胞团的大小也有减少,在高剂量组(1OOOμmol/L)中效果尤为明显。2.细胞活力检测发现,高剂量组(1000μmol/L)的mESCs细胞活力显著降低(P<0.05),其它剂量的细胞活力也出现降低趋势,但效果不显著。3.细胞凋亡检测发现,高剂量(1OO0μmol/L)MEHP可增加mESCs总细胞凋亡率(P<0.05),其他剂量组随着染毒剂量的增加,凋亡率呈增加趋势,但与对照组比较效果并不显著(P>0.05);而对于其他的细胞凋亡指标,如活细胞比率、早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡率、细胞碎片比率,各剂量组间均未出现显著性差异(P>0.05)。4.碱性磷酸酶染色发现,对照组和低剂量组的mESCs均被染成深蓝色或蓝紫色,而高剂量(1000μmol/L)的mESCs着色较浅,甚至未着色。5.对mESCs全能性标记物SOX 2、OCT 4进行基因蛋白检测发现,在100μmol/L、100μmol/L剂量组中,SOX 2、OCT 4基因表达均出现显著降低(P<0.05)。6.蛋白检测结果发现,SOX2、OCT4蛋白结果与基因结果相似,发现SOX 2和OCT 4蛋白表达在100μmol/L时其表达量出现降低,但不显著,而在1000μmol/L剂量时其表达量出现了显著降低(P<0.05)。结论***能够影响mESCs的形态,降低mESCs的细胞活力,并增加总的细胞凋亡率,因此,一定剂量的MEHP对mESCs存在细胞毒作用,能够抑制mESCs的正常生长。***能够减少了碱性磷酸酶的合成降低mESCs多能性标记物SOX 2和OCT4的基因和蛋白表达水平,影响mESCs的多能性维持,致使其向着非正常的方向分化,进而影响到胚胎早期发育。

关键词： 合成测序(SBS)   可裂解连接单元   可逆终止剂   延伸实验  

摘要： 人类基因组计划的成功完成使人们对发展高通量DNA测序技术的需求日益增加。DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。发展精确、高通量、低成本的DNA测序技术对于生物、医学具有非常重要的意义。根据在测序方面取得的最新研究进展,我们发现DNA合成测序作为一种基于化学合成的测序手段具有很大的发展前景。本文根据DNA合成测序的原理,设计合成了一种酸敏感连接单元A1、一种氧化敏感型的硫代缩酮连接单元B1以及一类基于二硫键可裂解连接单元的可逆终止剂(1a-1c)。所有得到的产物结构通过1HNMR、31PNMR、HRMS进行表征。我们对合成出来的其中一种二硫键可逆终止剂进行DNA测序实验,在延伸实验过程中取得了较好的延伸断裂效果,具有较好的应用前景。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   肝样组织   马兜铃酸-1   积雪草酸   五味子乙素   肝细胞癌   炎症   癌前病变   白细胞介素-6旁分泌   白蛋白   肝细胞核因子4α   α1-抗胰蛋白酶   细胞色素P450酶系   血小板内皮细胞粘附分子-1   原癌蛋c-Myc   甲胎蛋白   谷氨酸-丙酮酸转氨酶   RNA结合蛋白Lin28B   信号转导与转录激活因子-3   八聚体核转录因子-4   细胞外信号调节激酶1/2   Janus酪氨酸激酶2   激活蛋白-1   异位移植瘤   细胞角蛋白7   细胞角蛋白19  

摘要： 第一部分:马兜铃酸-Ⅰ致胚胎干细胞衍生拟胚体分化肝样组织过程癌前病变评价模型建立目的:利用人类致癌剂马兜铃酸-Ⅰ(aristolochic acid I,AAI)与小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞衍生拟胚体(embryoid body,EB)分化肝样组织过程共孵育体系,构建肝脏癌前病变体外替代研究模型,评价化合物是否具有潜在致肝癌前病变作用。方法:ES细胞经悬滴培养5天得EBs,EBs贴壁培养18天得成熟肝样组织;肝样组织分化成熟时(D5+18),免疫荧光考察肝样细胞及组织特异性蛋白表达;H&E染色考察肝样组织结构表型;qRT-PCR考察肝样细胞功能相关基因表达水平;ELISA法考察细胞培养上清液中白蛋白(albumin,ALB)分泌水平;糖原合成染色、吲哚氰绿(IndocyanineGreen,ICG)摄取、尿素合成实验考察肝样细胞功能。MTT法得AAI与EBs共孵育浓度;EBs贴壁培养当天(D 5+0)开始加入AAI;D 5+18时流式细胞术检测肝样细胞的分化率;ELISA法检测上清液中ALB、谷氨酸-丙酮酸转氨酶(alaninetransaminase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的含量;免疫荧光检测ALB与IL-6、信号转导与转录激活子-3(signaling transducer and activator of transcription-3,STAT3)、磷酸化 STAT3(p-STAT3)、原癌蛋白 Myc(oncogenic transcription factor Myc,c-Myc)和癌胚RNA 结合蛋白 Lin28 同源物 B(oncofetal RNA-binding protein Lin28 homolog B,Lin28B)、AFP等共表达情况;Western Blot检测肝样组织中c-Myc、Lin28B、AFP及IL-6/STAT3、核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)、丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)等信号通路蛋白表达情况;将成熟肝样组织注射到裸鼠背部皮下,考察肝样组织成瘤性;将肿瘤取出制备石蜡切片,H&E染色考察肿瘤的组成结构;免疫荧光考察ALB与AFP、胆管标志物细胞角蛋白7(cytokeratin7,K7)、细胞角蛋白 19(cytokeratin 19,K19)的共定位情况;Western Blot、qRT-PCR 法考察肿瘤组织恶性相关蛋白、基因的表达情况。结果:***细胞衍生肝样组织鉴定:(1)形态学表征:D5+18时,光镜下肝样细胞呈成熟的双核表型;免疫荧光染色肝细胞特异性蛋白ALB、肝细胞核因子4α、α1-抗胰蛋白酶等呈阳性,ALB与肝血窦内皮细胞标志蛋白血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1镶嵌成肝样组织表型;H&E染色可见典型的肝样组织血窦样结构与肝样细胞镶嵌排列;(2)功能表征:qRT-PCR结果显示肝样细胞细胞色素P450代谢酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶等基因表达水平接近肝脏细胞实际水平;肝样细胞显示出稳定的ALB分泌水平、尿素合成水平、糖原合成水平及ICG摄取功能。***致ES细胞衍生EBs分化肝样组织过程癌前病变体外替代研究评价模型构建:(1)分化体系质控指标:终点流式细胞术、免疫荧光及ELISA结果显示,与DMSO相比,1.25μM及2.50μMAAI不影响肝样细胞的分化率、ALB分泌水平及肝血窦样结构;(2)ELISA结果显示,与DMSO相比,AAI显著上调肝样组织培养上清液中ALT、AST、IL-6及AFP的分泌量,提示肝样细胞膜受到损伤,肝样组织中Kupffer样细胞被激活,分泌大量IL-6,使肝样组织弥漫浸润在炎症微环境中;AAI显著上调肝样组织c-Myc及Lin28B的表达;加入AAI后,在终末分化的肝样组织中尚有表达幼稚的肝细胞合成分泌的AFP,极少量肝样细胞胞浆表达干性标志物八聚体结合转录因子-4(Oct4),提示AAI可能使肝样组织中部分肝样细胞发生了脱分化;(3)Western Blot结果显示,AAI可激活IL-6/STAT3通路、显著上调MAPK家族成员细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化水平及激活蛋白-1(activatorprotein 1,AP-1)成员c-Jun和c-Fos的入核水平

关键词： 玉米   拟南芥   抗冻基因   基因工程  

摘要： 适宜温度是作物生长、产量和品质形成的重要环境因子。我国幅员辽阔,地形复杂,冷害和冻害常年发生,作物生产常因冻害而遭受巨大损失。玉米是全国乃至世界第一大粮食作物,提高其抗冻能力对于增加玉米产量和改善玉米品质意义重大。利用基因工程技术,将已有的抗冻基因直接转入植物体内使其过量表达,能够直接有效的提高其抗冻能力,较传统育种技术,周期短,见效快。本试验在前人研究基础上,选择7个抗逆候选基因的过表达拟南芥材料(总计22个株系)进行抗冻性鉴定,以哥伦比亚野生型和空载体型拟南芥作为对照,筛选出抗冻性较强的转AT1G07890基因拟南芥株系,研究其基因对拟南芥的生长发育和生理代谢等的影响。拟南芥AT1G07890基因在玉米中的同源基因为GRMZM2G137839,通过对玉米自交系进行q RT-PCR,来观察GRMZM2G137839基因在玉米抗低温自交系(KR701、B125)以及玉米低温敏感自交系(黑8834、昌7-2)冻害胁迫处理前后的基因表达情况,为开展玉米抗冻基因工程来提供有力理论的依据。试验结果表明:(1)在7个抗逆候选基因的过表达拟南芥的材料中,转AT1G07890基因型比其它转基因型、野生型和空载体型拟南芥株系在冻害胁迫处理后存活率高,电导率和含水量低,说明其抗冻能力强。(2)在正常生长条件下,转AT1G07890基因型与野生型和空载体型拟南芥的叶片及根系生长发育无显著差异,说明转AT1G07890基因对拟南芥的正常生长没有影响。(3)转AT1G07890基因型在4℃和0℃的低温萌发试验中均比野生型和空载体型拟南芥萌发更早,萌发率更高。(4)转AT1G07890基因型叶绿素的含量在正常生长条件下与野生型和空载体型拟南芥幼苗无明显的差异,冻害胁迫后转基因型的叶绿素含量与之相比更高。(5)转AT1G07890基因型MDA的含量在正常生长条件下与野生型和空载体型拟南芥幼苗无明显的差异,冻害胁迫后转基因型MDA的含量低于野生型和空载体型拟南芥幼苗的,说明其细胞膜受到的损害较轻。(6)转AT1G07890基因型SOD和POD的活性在冻害胁迫处理前与野生型和空载体型拟南芥幼苗无显著差异,胁迫后转基因型SOD和POD的活性明显高于野生型与空载体型拟南芥幼苗的,因为抗氧化酶系统可以提高植株抗冻的能力,说明转AT1G07890基因提高了拟南芥幼苗抗冻的能力。(7)转AT1G07890基因型可溶性糖和Pro的含量在冻害胁迫处理前与野生型和空载体型拟南芥幼苗是无显著差异的,胁迫后转基因型可溶性糖和Pro的含量明显高于野生型与空载体型拟南芥幼苗的,因为渗透调节物质可以提高植株抗冻的能力,说明转AT1G07890基因提高了拟南芥幼苗抗冻的能力。(8)玉米自交系在冻害胁迫处理前,GRMZM2G137839基因在KR701、B125、黑8834和昌7-2玉米自交系幼苗中的表达量无明显差异,KR701较高。冻害胁迫后,GRMZM2G137839在4份玉米自交系幼苗的表达量都升高了,抗冻玉米自交系品种KR701和B125上升幅度大,敏感玉米自交系品种黑8834和昌7-2上升幅度低,可见GRMZM2G13783基因在玉米自交系幼苗受到冻害胁迫时上调表达。

关键词： PUBLIC health ethics   ENVIRONMENTAL health   BIOETHICS   BIOLOGY   PRACTICAL politics   EPIGENOMICS   MORAL & ethical aspects  

摘要： Click to increase image sizeClick to decrease image size

关键词： 基因表达谱   胚胎干细胞   间充质干细胞   基因调控网络   关键调控基因  

摘要： 癌症干细胞假说认为癌症干细胞是癌症异常增殖、侵袭、转移、耐药以及复发等的根源。本文基于这个假说,分析四种癌症的基因和miRNAs混合表达数据,挖掘与癌症干细胞相关的关键调控基因。首先本研究利用分类算法将746个乳腺癌样本中的18409个基因和1035个miRNAs划分到不同的共表达模块中;并与胚胎干细胞和间充质干细胞的相关数据库做富集度分析,得到两个大小分别为2019和859且与上述两类干细胞相关的基因集。另外对胶质母细胞瘤、低等级的脑胶质瘤和肺癌的混合表达数据重复上述过程,最终得到178个与胚胎干细胞相关的基因和7个与间充质干细胞相关的基因。其次通过比对这两个基因集在GSE29625和GSE28974数据中的表达方式,进一步验证了两个基因集与两类干细胞的相关性。另外发现由178个基因组成的与胚胎干细胞相关的基因集参与由转录因子E2F介导的转录过程。最后通过构建这两个基因集的调控网络,在乳腺癌中筛选出两个胚胎干细胞的特异性关键基因TPX2和MCM10,以及间充质干细胞的特异基因COL5A2。并通过查看178个与胚胎干细胞相关的重复基因在四种癌症调控网络中的顶点出度,筛选出两个关键调控基因BUB1B和NCAPH。这些基因可以作为治疗乳腺癌的潜在的标靶基因。

关键词： 乳腺癌   临床诊断   循环肿瘤DNA   测序技术   模拟cfDNA   细胞游离DNA  

摘要： 乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，也是女性癌症相关致死的主要原因之一。乳腺癌的传统治疗包括手术、放疗、化疗等。随着精准医学时代的到来，分子诊断和靶向药物治疗在乳腺癌诊疗中的作用日益凸显，即依据患者遗传信息，制定个体化诊疗方案，以期得到最佳治疗效果。其中PIK3CA、ESR1、及ATK1等基因的单个核苷酸变异(Single Nucleotide Variation，SNV)，CCND1、ERBB2等基因的拷贝数变异（Copy Number Variations，CNV）为乳腺癌相关靶基因变异的最常见类型和药物靶点。　　循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)与组织活检样本相比，取材更方便、均质性好，可重复取样，能动态反映肿瘤DNA改变，被称为“新一代癌症标志物”。因肿瘤基因位点日益增多，传统方法已不能满足需要。新一代测序(Next-generation sequencing，NGS)技术的发展，使得以多基因盘形式进行检测成为可能。　　尽管国家食品药品监督管理总局(CFDA)已批准部分检测试剂，但因靶向基因众多，许多项目仍需实验室自建方法和自配试剂(Laboratory Developed Tests，LDTs)，当前也无CFDA批准用于NGS检测乳腺癌ctDNA的商品试剂盒。为保证检验质量，临床实验室在正式开展日常检测之前，应对LDTs进行性能确认，证明其能满足相应临床预期用途，因此需要参考物质（reference material，RM）。但当前国内外尚无专门用于NGS检测乳腺癌ctDNA方法性能确认的RM，无法对自建方法进行全面性能评估，也不能满足实验室检测质量保证包括室内质量控制（Internal Quality Control，IQC）和室间质量评价(External Quality Assessment，EQA)的需求。　　本研究以细胞系基因组DNA(genomics DNA，gDNA)为模板，通过PCR和定点诱变PCR技术制备模拟突变片段，与gDNA按不同比例混合后超声打断，制备参考物质即模拟cfDNA，并联合应用乳腺癌细胞游离DNA(cell free DNA，cfDNA)对乳腺癌ctDNA高通量测序检测方法进行分析性能确认，包括建立测序质量性能指标和可报告范围，评价其检测下限、精密度、准确度、多重测序交叉频率及与数字PCR检测方法的符合性等。本研究主要对SNV和CNV两种最常见类型的检测性能进行确认。　　结果表明，模拟cfDNA片段长度分布、reads质量和靶向捕获效率等指标与血浆cfDNA相近;对于SNV，当突变等位频率（Mutant allele frequency，MAF）≥0.5％时，灵敏度为96.30％，并具有高特异度(99.9997％)和准确度(99.9996％);当CNV达1.25×，特异度为99.77％，准确度为99.76％时，灵敏度为95.83％。当SNV达到0.5％，CNV达1.25×时，批内和批间精密度均能达95％以上。同时NGS与数字PCR结果高度一致，多重测序交叉污染率低（0％～0.24％，但阳性reads在数据分析中均能被过滤去除）。　　综上所述，本研究制备了乳腺癌ctDNA高通量测序检测参考物质，并联合应用血浆cfDNA对乳腺癌ctDNA高通量测序检测方法进行性能确认，明确其可报告范围、检测下限、精密度、准确度以及多重测序交叉频率等性能指标。结果表明，制备的参考物质可用于NGS检测乳腺癌ctDNA性能确认，所评价的方法具有良好的检测性能。　　本研究的创新性主要有:(1)通过PCR和定点诱变PCR的方式制备乳腺癌相关基因的模拟cfDNA作为乳腺癌ctDNA高通量测序检测的参考物质，制备方式简单、快速且可稳定获取，可用于乳腺癌相关基因NGS检测的分析性能确认，也可用于乳腺癌相关基因NGS检测的室内质量控制和室间质量评价;此外，该制备方式也可用于制备其他肿瘤相关基因的ctDNA参考物质;(2)对通过Illumina Hiseq3000平台检测乳腺癌ctDNA的方法进行了系统的分析性能确认，为应用该平台及所评价的检测方法检测乳腺癌ctDNA提供了理论和实践依据。性能确认思路可为临床实验室建立其他肿瘤的ctDNA检测NGS方法性能确认提供借鉴。

关键词： 先天缺牙   CRISPR-Cas9系统   MSX1基因敲除   人胚胎干细胞   拟胚体  

摘要： 目的:1.采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建与牙齿发育相关的MSX1基因敲除人胚胎干细胞(hESc)稳定细胞系。2.研究MSX1基因敲除hESc系的多能性。3.探讨MSX1基因敲除hESc的拟胚体(EB)向外、中、内三胚层细胞分化的能力。方法:1.采用分子克隆的技术构建pX330-MSX1KO-sgRNA载体、MSX1基因同源重组敲除载体(donor)。2.将pX330-MSX1KO-sgRNA载体以及donor共同电转入hESc,PCR检测和测序鉴定鉴定存活的克隆。3.对细胞进行形态学观察、染色体核型分析、流式细胞术,检测MSX1基因双敲除hESc(H1-MSX1-DKO)的多能性。4.体外形成H1-MSX1-DKO的拟胚体(EB),并诱导EB向外、中、内三胚层细胞分化,收集EB分化前后(D0和D8)细胞的总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞三胚层细胞标记物的表达情况。结果:1.质粒测序结果显示pX330-MSX1KO-sgRNA载体以及donor成功构建,并成功获得78株MSX1基因单敲除和2株MSX1基因双敲除hESc系(H1-MSX1-SKO,H1-MSX1-DKO)。***1基因敲除hESc表现出典型的人胚胎干细胞的形态;另外,细胞除了保持原有正常核型外,还高表达多能性标记物OCT4和SSEA4。3.实时荧光定量PCR结果显示分化D8的细胞外、中、内三胚层细胞标记物的表达水平都不同程度的高于未分化的细胞。结论:运用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够实现对人胚胎干细胞的特定的编辑;MSX1基因敲除hESc还能保持干细胞的多能性并向三胚层细胞分化。我们获得的MSX1基因敲除hESc可以用于进一步探讨牙齿发育的分子机制,进而为人类研究MSX1基因异常导致的先天缺牙等相关疾病的治疗提供一定参考。

关键词： 科学计划   人类基因组计划   EBP   宏伟   自然科学史   登月计划   科学领域   历史意义  

摘要： “人类基因组计划”与“曼哈顿原子弹计划”“阿波罗登月计划”并称为自然科学史上的“三大计划”.继人类基因组计划之后,生命科学领域又迎来一件大事——地球生物基因组计划(Earth BioGenome Project,EBP)即将启动,目标是破译地球上所有生命的基因组.这一具有历史意义的项目吸引了全球科学家的关注.