关键词：
单倍体胚胎干细胞
印记基因
基因组互作
早期胚胎发育
细胞融合
摘要：
早期胚胎发育是一个精细而又严格的调控过程,在早期胚胎发育过程中涉及组蛋白修饰的变化、雌雄基因组互作,甲基化的调控与变化等。研究早期胚胎发育机制对发育生物学以及生殖生物学乃至再生医学都具有深远的意义,因此早期胚胎发育一直都是人们研究的热点。因为早期胚胎材料的特殊性,因此人们对于早期胚胎发育的研究是长久以来的难点,缺乏一种良好的研究工具。单倍体胚胎干细胞(haploid embryonic stem cells,ha ESCs)是近年来兴起的一种新型的胚胎干细胞。其特点是只含有一套染色体组,并且拥有正常胚胎干细胞的特性,具有体外无限增殖以及分化的能力。单倍体胚胎干细胞分为孤雌单倍体胚胎干细胞和孤雄单倍体胚胎干细胞,由于其单倍体来源的多样性,因此其成为可以模拟单套雌雄基因组的良好细胞系。同时其多能性以及体外无限增殖的特点,为其在体外进行基因操作提供了很多有利的条件,为基因功能研究提供了一种良好的工具。同时,单倍体胚胎干细胞系的建立为研究动物遗传修饰以及改造提供了新的渠道。从精子与卵母细胞结合形成受精卵,在整个早期胚胎发育过程中雌雄基因组互作以及表观修饰变化一直处于动态变化之中。但对其基因组互作以及表观修饰的研究由于早期胚胎操作的难度很高,缺乏有效的研究手段。单倍体胚胎干细胞为这种雌雄基因组互作提供了一种新的研究手段。基因组印记的变化是整个生命过程中最重要的生物学现象之一。印记基因是个体发育的重要保证,对于印记基因的研究由于其材料的特殊性难于收集,也造成了印记基因的研究方式单一,且研究困难。单倍体胚胎干细胞便于基因操作,因此成为研究印记基因的良好素材。本研究通过孤雌激活的方法获得孤雌单倍体胚胎干细胞,同时利用精子克隆的办法获得孤雄单倍体胚胎干细胞,随后对孤雌和孤雄胚胎干细胞进行检测,发现其具有正常的单倍体核型,同时也具有正常的胚胎干细胞的多能性特征。随后我们利用孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞作为工具进行早期胚胎发育的研究。首先,我们利用孤雌孤雄单倍体胚胎干细胞进行细胞融合,进行四倍体补偿实验,来研究早期胚胎囊胚期前雌雄基因组互作对动物到期发育是否必要。我们成功地获得了孤雌与孤雄融合的胚胎干细胞细胞系。该细胞系具备正常二倍体核型,同时其具有体外分化成三胚层以及二倍体种系嵌合的能力,证明其具备正常的ES细胞的多能性。最后利用四倍体补偿实验,获得四倍体到期小鼠,该实验是细胞多能性最高级别验证的黄金标准,同时该实验也证明了在囊胚期前,雌雄基因组互作对动物到期发育不是必需的。其次,我们发现孤雌单倍体胚胎干细胞具有随着细胞代次增高DNA甲基化修饰不断降低的特性,尤其是其印记调控区也存在这样的现象,同时孤雌单倍体胚胎干细胞胞质注射小鼠由于印记异常等原因只能发育到E13.5天。孤雌单倍体胚胎干细胞的这些特性为印记基因的功能性研究提供了一种良好的工具,我们通过对孤雌单倍体胚胎干细胞不同印记区域进行修饰,来进行印记对早期胚胎发育的影响。通过对IGDMR的印记DMR区域的同源打靶获得了IGDMR区域基因沉默的孤雌单倍体胚胎干细胞,该细胞支持动物到期发育,但影响其成活。随后,在IGDMR区域修饰的基础上,对H19区域进行同源重组,通过对H19转录起始位点上游-4kb到+1kb以及-10kb到+4kb区域敲除我们发现,在IGDMR/△5kb H19敲除的单倍体胚胎干细胞胞质注射后不能获得到期成活的小鼠,但IGDMR/△15kb H19敲除的单倍体胚胎干细胞胞质注射不仅动物到期率有所提高而且动物可以成活到成年,但是其体重及行为学与野生型相比依旧有所异常。最后,我们通过在IGDMR/△15kb H19敲除的单倍体胚胎干细胞的基础上进行IGF2过表达形成IGDMR/△15kb H19/IGF2细胞系进行胞质注射,该策略使得到期小鼠的行为学旷场试验的运动能力有所改善,但仍未改善完全。本研究通过构建单倍体胚胎干细胞这种独特的新型细胞类型用来研究早期胚胎发育过程中基因组互作以及印记调控等现象。不仅仅回答了早期胚胎发育中一些难以研究的问题,同时为早期胚胎发育的研究提供了一种新的思路。单倍体胚胎干细胞在线粒体模型制备、异种基因组互作以及生殖生物学领域将发挥其他重要的作用。
欢迎来到三峡大学图书馆！
