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关键词： 基因治疗   基因工程   基因治疗技术  

摘要： 基因治疗是目前医学生物学研究的热点之一。作为基因工程技术的一大突破,基因治疗有着十分广阔的应用前景,并有望成为治疗遗传病、肿瘤、心血管病、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段。本文将主要从基因治疗的策略、基因治疗的现状、基因治疗技术、基因治疗在临床上的应用、基因治疗的一些关键问题和展望等方面分别进行阐述。

关键词： EMPIRICAL research   BIOETHICS   ETHICS   GENETIC research   NEUROSCIENCES   PSYCHIATRY   RESEARCH ethics   SCHIZOPHRENIA   GENOMICS   RESEARCH personnel   MORAL & ethical aspects  

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关键词： 基因工程   遗传修饰   酿酒酵母   燃料酒精  

摘要： 基因工程已广泛地应用于微生物菌种的改造与构建,而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是发酵工业的重要的微生物,乙醇生产重要菌株,也是第1个完成基因组测序的真核生物。目前的能源危机使可再生资源燃料酒精得到广泛应用,利用基因工程对酿酒酵母进行遗传修饰,构建高产乙醇的基因工程菌株已成为目前构建酿酒酵母的发酵菌种的热点。本文综述了基因工程在酿酒酵母酒精发酵改良上的应用和展望。

关键词： 人胚胎干细胞   肿瘤细胞   非接触式共培养   肿瘤抑制  

摘要： 目的建立hESCs-HepG2、hESCs-A549非接触式共培养体系,探究人胚胎干细胞hESCs体外对人肝癌细胞系HepG2和人肺癌细胞系A549在侵袭迁移、增殖、凋亡等生物学行为方面的影响,为肿瘤的干细胞治疗奠定理论基础。方法利用Transwell小室将hESCs与HepG2、A549进行共培养,建立hESCs-HepG2、hESCs-A549非接触式共培养体系,为肿瘤细胞提供hESCs微环境。将与hESCs共培养的HepG2、A549作为Co-HepG2、Co-A549实验组;单独培养在小室内的肿瘤细胞作为HepG2、A549对照组。与hESCs共培养后,Transwel法检测HepG2、A549的侵袭、迁移能力;MTT法检测各组细胞的增殖情况,Flow Cytometry检测hESCs对HepG2、A549细胞周期的影响,Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。qRT-PCR、Western Blot检测各组细胞Cyclind1、CDK4、P21、Bax、Bcl2的mRNA转录水平及蛋白表达情况。结果实验结果显示,与hESCs共培养后,HepG2的侵袭能力显著降低;A549的侵袭能力与对照组比明显降低(P<0.05);在迁移实验中,Co-HepG2组中穿过Transwell底膜的细胞数量与HepG2对照组比显著减少(P<0.05);Co-A549组通过小室底膜的细胞数量与A549对照组比显著减少(P<0.05)。与hESCs共培养后,Co-HepG2、Co-A549实验组细胞的增殖能力受到显著抑制,且随着时间增加,该抑制作用越明显(P<0.05);Flow Cytometry检测发现Co-HepG2组处于G1期的细胞与HepG2对照组比明显增多(P<0.05),Co-A549实验组中G1期细胞与A549对照组比组显著增加;通过qRT-PCR检测细胞周期相关基因的表达量发现:与对照组比,Co-HepG2细胞内CDK4、Cyclin D1 mRNA相对表达量显著降低,P21表达著增加(P<0.05);Co-A549中CDK4、CyclinD1 mRNA相对表达量与A549对照组比显著降低,P21表达显著增加(P<0.05);Western Blot实验结果进一步显示CDK4、CyclinD1、P21蛋白表达趋势与qRT-PCR结果相符,差异具有统计学意义(P<0.05)。Hoechst凋亡染色实验结果显示Co-HepG2、Co-A549实验组中固缩、变形、出现浓染的细胞核数量较HepG2、A549对照组多;进一步检测发现Co-HepG2细胞凋亡率为16.77%,与HepG2对照组2.93%比显著增加(P<0.05),Co-A549组中细胞凋亡率12.73%与A549对照组1.9%比显著增加(P<0.05);通过qRT-PCR实验发现:在Co-HepG2中凋亡相关基因Bcl2相对表达与HepG2对照组比显著降低,Bax表达显著增加(P<0.05);与A549对照组比,Co-A549中Bcl2 mRNA相对表达量显著降低、Bax表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步通过Western Blot实验发现Bcl2、Bax蛋白表达趋势与qRT-PCR实验结果相符。结论人胚胎干细胞hESCs能够抑制HepG2、A549细胞侵袭与迁移与增殖能力,并且可以促进细胞凋亡。

关键词： 胚胎干细胞   自我更新   发育多能性   表观遗传  

摘要： 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有无限自我更新和发育多能性两大特性,可为基础研究、药物筛选及再生医学等提供无限的细胞来源。ESC的命运决定受多个层次的调控,主要包括信号通路、转录因子和表观遗传。越来越多的研究表明,表观遗传调控在ESC命运决定中发挥着重要作用,然而,其中的分子机制仍不是十分清楚,需要进一步揭示。以基金委重大研究计划"细胞编程和重编程的表观遗传机制"为依托,金颖实验室从表观遗传角度揭示ESC自我更新和发育多能性的分子调控机制,取得了多项重要进展。现主要对此研究计划中金颖实验室的原创性工作进行综述。

关键词： Brachyury   胚胎干细胞   心肌细胞   分化  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源于胚胎着床前的多能干细胞,能够在体外持续培养并保持自我更新的能力,同时又具有多向分化的潜能,可以分化成机体的各种细胞类型。目前己经在发育分化模型的构建中起到不可或缺的作用,同时广泛的用于再生医学的研究及细胞学移植的研究。经典的Wnt/β-catenin信号通路在胚胎的发育以及多种干细胞的分化中起着关键的作用。研究表明,Wnt/β-catenin信号通路在胚胎时期心脏的发育以及血管形成等过程中起到了不可或缺的作用,在胚胎干细胞分化过程的特定的时间段激活该信号通路可诱导胚胎干细胞定向分化成心肌细胞。Brachyury(T)基因是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因,也是中胚层的标志基因,在胚胎发育中胚层形成的过程中高度表达。为了研究T基因在mESCs分化过程中的作用,我们通过PB(PiggyBac)质粒过表达该基因,将构建好过表达质粒后转染到mESCs中,采用LIF/serum培养基培养,并用细胞计数的方法检测过表达T基因后细胞的增殖情况,并用碱性磷酸酶染色(AP染色)方法检测mESCs的分化情况。分化实验是采用单个细胞悬浮培养的方法首先形成拟胚体(EBs),形成的EBs可形成三个胚层,其中中胚层可进一步分化形成心肌细胞。研究报道,单独使用GSK3β抑制剂BIO可以诱导胚胎干细胞分化成心肌细胞。我们研究表明在mESCs分化早期阶段加入GSK3β抑制剂CHIR99021(CHIR)可以促进胚胎干细胞向心肌细胞分化,实验时我们加入CHIR作为阳性对照组。研究结果表明,过表达T基因后细胞的增殖慢于对照组,且细胞的分化倾向增加且更易于分化。分化实验的qRT-PCR结果表明,三组随着分化时间的增加心肌标志基因cTnT、Cx43、Nkx2.5、和α-MHC的表达量增加,其中过表达T基因的T组表达量高于阴性对照PB组,而低于阳性对照CH组。Western blot结果显示第10天T组的Cx43和α-MHC蛋白的表达量高于PB组而低于CH组,第15天的蛋白表达量趋势与第10天一样,但各组相应的蛋白表达量高于第10天的表达量。免疫荧光染色结果与Western blot结果趋势一样即三组中α-MHC和Cx43蛋白免疫荧光均阳性,T组荧光强于PB组,CH组荧光强于T组。因此,过表达T基因可促进mESCs向心肌细胞分化,分化效率弱于GSK3β抑制剂CHIR的诱导效率。为了进一步研究T基因的促进mESCs心肌细胞的分化作用,我们采用慢病毒pLKO.1质粒系统敲低该基因,将重组质粒用相同的方法转染到mESCs中,采用LIF/serum培养基培养,用悬浮培养方法形成EBs。用qRT-PCR检测心肌标志基因的表达情况,用Western blot检测心肌标志蛋白。实验结果表明三组随着分化时间的增加心肌标志基因cTnT、Cx43、Nkx2.5和α-MHC的表达量增加,其中敲低组的表达量低于对照组。Western blot结果显示第10天敲低组的Cx43和α-MHC蛋白的表达量低于对照组,第15天的蛋白表达量趋势与第10天一样,但各组相应的蛋白表达量高于第10天的表达量。因此,敲低T基因后心肌细胞分化效率降低。我们研究表明,T基因可以促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化,但促分化的效率低于GSK3抑制剂CHIR的诱导效率。

关键词： 胚胎干细胞   遗传物质   稳定性   FILIA蛋白   泛素化修饰  

摘要： 多能干细胞(pluripotent stem cell，PSC)的遗传物质稳定性对于遗传信息的准确传递和机体的正常生命活动至关重要。多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)与诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)。胚胎干细胞在无限增殖过程中能保持遗传物质高度稳定性。迄今为止，对维持遗传物质稳定性的相关机制研究主要集中在体细胞上，而我们对胚胎干细胞维持遗传物质稳定性的相关机制研究并不全面，因此深入开展胚胎干细胞在遗传物质稳定性维持方面的相关研究有助于我们认识并了解胚胎干细胞的特性，为胚胎发育、胚胎干细胞的医学应用提供基础理论依据。Filia，又名Khdc3（KH domain containing 3），特异性表达于小鼠生长中的卵母细胞、囊胚以及胚胎干细胞中，是ESC维持遗传物质稳定性的关键多功能蛋白分子。Filia可通过两个方面的作用来维持小鼠胚胎干细胞遗传物质的稳定性。一、Filia能与多能干细胞特异性蛋白Floped相互结合，促进停滞复制叉的重启，减少由复制压力所引起的细胞内源性损伤。二、Filia参与调控小鼠胚胎干细胞的DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)，从而维持遗传物质的稳定性。实验室前期工作基础发现，Filia S151位点以及Filia S349位点对Filia的功能发挥至关重要。Filia第349位丝氨酸残基与蛋白的入核相关，在损伤诱导情况下，Filia S349能被相关激酶磷酸化修饰，磷酸化的Filia能顺利转运至细胞核中，参与DNA损伤修复过程。Filia第151位丝氨酸残基的磷酸化修饰参与复制叉重启的过程，当复制叉受阻时，Filia-Floped聚集到受阻的复制叉上，在蛋白激酶ATR的调控下，Filia的第151位丝氨酸发生磷酸化，重启复制叉。FILIA蛋白除了能被磷酸化修饰外，还能被泛素化修饰。前期FILIA的P-MS（免疫共沉淀-质谱）结果发现Filia有四个泛素化位点，但我们还不清楚这四个泛素化位点是否参与调控细胞的损伤修复功能，调控方式是否独立。在本论文中，我们探究了Filia泛素化修饰在Filia蛋白调控胚胎干细胞遗传物质稳定性及DNA损伤反应的相关功能。　　为探究泛素化修饰是否和怎样调控Filia在胚胎干细胞中的功能，本论文用分子克隆构建出9个Filia泛素化位点突变的慢病毒表达载体，利用慢病毒包装与感染等手段，得到9个Filia泛素化位点突变的小鼠胚胎干细胞系。功能研究发现，Filia第141位赖氨酸的泛素化是Filia蛋白调控DNA损伤反应的关键，该泛素化位点突变后，小鼠胚胎干细胞系维持较高的内源性DNA损伤。并且FiliaK141突变后影响Filia DNA损伤修复的能力。深入探究Filia第141位赖氨酸的泛素化对损伤修复的影响机制，我们发现Filia K141的突变后并不影响Filia与PARP1（细胞质中与DDR调控相关的重要蛋白修饰酶）的结合，但Filia K141突变后，Filia S349不能被磷酸化，且Filia不能转运到细胞核中。综上，Filia泛素化修饰对Filia调控胚胎干细胞遗传物质稳定性十分重要。当胚胎干细胞发生DNA双链断裂时，Filia能定位到断裂处，调控同源重组修复双链断裂。FiliaK141泛素化位点突变后，使Filia S349位点不能被磷酸化修饰，进而FILIA蛋白的入核受影响，FILIA不能定位到受损的DNA位点，修复损伤位点。　　尽管我们已经发现Filia K141位点十分重要，但是现有的证据并不能揭示Filia泛素化修饰的调控机制。因此，我们需要开展进一步的工作，寻找Filia K141泛素化的上游E3连接酶，Filia泛素化修饰在不同细胞周期中是否处于动态变化过程，Filia泛素化修饰如何影响催化Filia S349磷酸化的激酶等。这个分子网络机制有待进一步完善，为多能干细胞在再生医学领域的应用提供基础理论依据。

关键词： 单链双特异抗体   原核表达   胞毒作用   前列腺癌  

摘要： 背景:目前双特异性抗体是肿瘤免疫治疗的热点研究内容。在肿瘤靶向治疗中,常见的双特异性抗体含有两个抗原的结合位点,其中一个靶向效应细胞表面抗原,另一个靶向肿瘤细胞相关抗原。CD3是常见的T细胞靶向抗原,其在T细胞表面均有表达,而且CD3复合体具有触发T细胞的潜能,因此靶向CD3的双特异性抗体被广泛研究。并有研究表明CD87的表达水平与肿瘤的恶性程度有关。在人恶性肿瘤组织中CD87的表达水平远高于其在正常组织中的表达水平,因此我们选择CD87作为单链双特异性抗体(scBsAb)的另一个作用靶点。方法:首先,通过SnapGene Viewer软件将抗人CD3单克隆抗体的重链、轻链与抗人CD87单克隆抗体的重链、轻链交叉连接,以基因合成的方式获得scBsAb的基因片段。然后利用分子生物学手段构建pET24a/scBsAb,先将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达。获得的工程菌经超声破碎,先在变性条件下亲和纯化目的蛋白,再采用稀释复性方法对scBsAb进行复性。利用SDS-PAGE及Western Blotting检测、鉴定目的蛋白。其次,利用流式细胞术检测纯化的scBsAb与两种相应抗原的结合情况,并测定scBsAb介导的细胞毒作用。采用商品化ELISA试剂盒测定scBsAb介导人外周血单个核细胞(PBMCs)发挥靶向CD87阳性肿瘤细胞杀伤的过程中IFN-y水平。结果:利用基因工程手段,我们获得了较高纯度的scBsAb。与对照相比,scBsAb能与PC-3细胞表面CD87特异性结合,并能与CD3特异性结合;scBsAb的浓度及效靶比影响scBsAb介导的杀伤作用。在效靶比为10:1,scBsAb浓度为100 μg/mL时最大杀伤率达到40.86%;在scBsAb浓度为100 μg/mL,效靶比为40:1时最大杀伤率达到60.9%。此外,ELISA检测实验表明,在scBsAb介导PBMCs发挥靶向CD87阳性肿瘤细胞杀伤的过程中IFN-γ的分泌显著提高。可见scBsAb在体外能够有效介导PBMCs杀伤CD87阳性肿瘤细胞。结论:在本研究中,我们利用大肠杆菌表达系统纯化获得了抗人CD3×CD87单链双特异性抗体,并对其生物学活性进行研究。我们发现scBsAb能够与PC-3细胞表面CD87特异性结合,并且能与CD3特异性结合。通过体外研究我们还发现scBsAb能够介导PBMCs发挥靶向CD87阳性肿瘤的胞毒作用。这些都为进一步的体内实验和抗CD3×CD87单链双特异性抗体的临床应用奠定了基础。

关键词： 转基因食品   转基因作物   科技伦理   利益  

摘要： 转基因食品的应用和发展给人类带来了丰厚的经济效益,与此同时转基因食品的安全、转基因农作物对生态的影响等问题也越来越引起人们的关注和讨论,进而演变出支持和反对转基因食品发展的两个对立的派别——挺转和反转派。两派之间的分歧主要集中在两方面:一是转基因食品是否真正安全可靠;二是转基因生物是否对生态产生危害。转基因食品的危害性到现在并没有证实,科学界和学术界等对此都还存在争论。对于这个争议本文不做定论,但是由此引发的伦理争论却是一个事实。为此,科技伦理的规范作用就需要发挥,在科技伦理力量的规约之下,从利益权衡层面入手,引导转基因食品发展符合人类自由全面发展的价值导向。挺转派认为转基因食品的发展给人类带来多重的利益,为未来人类的自由发展创造了无限的可能性。对此本文第三章将挺转派的主要观点区分为,转基因食品解决某些国家的粮食问题、带来经济利益和减缓气候变化三个方面展开分析,并且能清晰展现对转基因食品伦理争议的其中一面。反转派认为,转基因食品本身具有毒性和过敏性等问题,且转基因技术不够成熟、实验时间短,有可能对生态产生负面效应。对此本文第四章将反转派的主要观点区分为,转基因食品在某些国家存在威胁人类健康的问题、产生经济负面效益、存在生态风险三个方面加以讨论,力求清楚展示对转基因食品伦理争议的另一面。本文第五章对挺转和反转派的观点进行了总结分析,反思利益权衡下挺转和反转坚持的实质。最后,从科技伦理视域下对转基因食品的发展进行一般性地分析总结。

关键词： 高通量测序技术   循环血肿瘤DNA   肝细胞癌  

摘要： 肝细胞癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,中国已是世界"肝癌第一大国",它严重危害着世界各国人民的身体健康。由于当前常规的影像学及血清学检查早期诊断率低,加之肝细胞癌恶性程度高,预后差等特点,临床确诊患者大多数为中晚期,失去了手术机会,防治形势非常严峻。目前研究显示,肝细胞癌与DNA缺陷关系密切,肝癌患者早期外周血即可检测到循环血肿瘤DNA。随着测序技术的飞速发展,如今的高通量测序技术为测定循环血肿瘤DNA提供了技术支持,本文总结了近年来基于高通量测序技术检测循环血肿瘤DNA在肝细胞癌的基础和临床应用方面的经验,以期能对肝细胞癌的诊治带来有益帮助。