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关键词： 猪   高原妊娠   初生仔猪   转录组测序   长链非编码RNA  

摘要： 高原地区恶劣的自然环境,对动物的健康、生存、繁殖都是极大的威胁,也严重地制约着高原养殖业的规模化发展。同时,高原独特的地缘环境、自然风光和历史文化等,也吸引着广大的民众涌入高原地区,例如从事高原资源的开发、国防建设、登山探险和高山旅游等。于是高海拔适应的研究显得尤为重要,厘清动物高海拔适应的机制,将有助平原多样化的物种在高原环境的引进、适应、生存和繁殖。但是,目前高海拔适应研究的成果,主要是基于长期适应的成年个体,鲜有研究短期的高原妊娠刺激对初生胎儿的影响,特别是初生胎儿在分子水平的差异。于是,本研究利用猪的高原妊娠,从分子水平探究短期的高原妊娠对初生胎儿的影响,即以平原转入高原环境妊娠并出生的荣昌仔猪(n = 3,海拔:3,658m)和正常妊娠环境下出生的荣昌仔猪(n = 3,海拔:711m),分别作为实验组和对照组,比较分析两组在线粒体拷贝数和转录组水平的差异,主要研究结果如下:(1)与低海拔正常妊娠环境初生仔猪相比,除了心脏组织无差异(p>0.05),高海拔妊娠环境下初生仔猪在6个组织(脑、肝、肺、肾、背最长肌和腰大肌)的线粒体拷贝数都显著降低(p<0.05)。(2)在检测的7个组织中(脑、心、肝、肺、肾、背最长肌和腰大肌),线粒体拷贝数在背最长肌、脑和心组织中的相对较高,而在肺和肾组织中较低,呈现出明显的组织差异特性。(3)本次研究共构建18个链特异性的lncRNA测序文库,包含了 2种海拔处理(高海拔和低海拔妊娠)各3种组织(脑、心和肺),且每种海拔处理的每个组织有3个生物学重复,平均每个文库获得了约40 M(million)的高质量读段(clean reads)。共检测到17,264个mRNA和13,744个lncRNA表达。在脑、心和肺组织中,分别能检测到14,604、13,208和14,928个mRNA表达,同时从这3种组织中分别鉴定出12,818、11,242 和 10,943 个 lncRNA。(4)基于表达量的层级聚类,mRNA和lncRNA都能将样本按照组织、海拔因素的顺序先后聚开;基于表达量的相关性分析显示,生物学重复之间的相关性最高,然后是高低海拔之间,最低的是组织之间。综合表明,转录组表达水平,具有很强的组织差异。(5)在鉴定的13.744个lncRNA中,有9.248个lncRNA在脑、心和肺组织中共表达,另外有109、44和40个lncRNA特异性地表达于脑、心和肺组织(在特定的组织的6个样本中都表达,而在其余12非特定组织中不表达)。(6)与mRNA相比,lncRNA的表达水平更低、长度更短、所含外显子数更少、GC含量更低。在表达量的丰度特征上,mRNA和lncRNA呈现出极其相似的规律,都表现为少数种类的mRNA或lncRNA高表达(不到总数10%的mRNA或lncRNA,但其总表达量能占据该库80%以上),绝大多数的mRNA或lncRNA呈低丰度表达(超过总数90%的mRNA或lncRNA,其表达总量仅占该库不到20%)。(7)mRNA在高低海拔妊娠环境初生仔猪间的差异分析表明:脑组织中有511个mRNA差异表达,其中在高原妊娠组有315个上调表达,有196个下调表达;心组织中有574个mRNA差异表达,其中在高原妊娠组有253个上调,有321个下调;在肺组织中有529个mRNA差异表达,其中在高原妊娠组有283个mRNA上调,有246个下调。(8)差异mRNA的功能富集结果表明:脑组织中差异表达的mRNA主要富集于脑和神经活动(突轴、树突等)、能量代谢(呼吸链及复合物等)和表观修饰等相关通路;心组织中差异表达的mRNA主要富集于免疫应答等通路;肺组织中差异表达的mRNA主要富集于细胞有丝分裂、炎症响应和免疫等相关通路。(9)通过表达量和组内变异系数的进一步严格筛选,在脑、心和肺组织中分别筛选出273个脑组织中高可靠性的差异mRNA、225个心组织中高可靠性的差异mRNA和228个肺组织中高可靠性的差异mRNA。这些mRNA将是后续各组织中功能验证实验的主要候选基因。(10)将鉴定的13,744个lncRNA,按照基因组相对位置和链特异性,可以划分为14种类型,按各类所占的比例从高到低依次为:基因间、有义链上游、有义链下游、反义链上游、反义链下游、有义链内含子内部,有义链内含子外部,有义连与内含子重叠、反义链内含子内部、反义链内含子外部、反义链与内含子重叠、反义链外显子外部、反义链外显子内部和反义链与外显子重叠的lncRNA。(11)lncRNA在各染色体间呈不均匀分布(χ2=1989.65,p<10-6),在基因密度大和基因数量多的染色体上分布更多。具体表现为,染色体上的lncRNA数量与该染色体的长度(r = 0.819,p = 1.77× 10-5)、基因数量(r = 0.864,

关键词： 半夏   根癌农杆菌   转基因   高品质   抗逆  

摘要： 半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)为天南星科半夏属植物,是传统名贵中药材。半夏块茎是中医化痰燥湿、止痛消肿、止吐降逆的良药。半夏在全国各地均有分布,虽分布广泛,但由于过度开采和缺乏科学规范的种植技术,半夏优良种质资源面临稀缺。同时,针对半夏的分子遗传转化方面的研究还比较少,分子育种较为欠缺。为了获得兼具药用成分高、抗逆性和抗病性强的半夏新品种,本研究以荆半夏为材料,利用半夏一体成苗技术获得大量无菌苗;然后通过优化的农杆菌介导转化体系,将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的抗热蛋白ERECTA(ER)、来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有助于提高生物碱表达量的高活性3-羟基-3-甲基戊二酰还原辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co Areduct-as e,HMGR)、来源于甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)有助于提高植物抗逆能力的凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)、抗除草剂双丙氨酰磷抗性蛋白(Bioiaphos resistance,BAR)等编码基因转化到半夏植株中,获得基因组整合的半夏植株。同时构建HMGR和ER基因双价高表达载体,让这两个基因在同一株半夏中有较高的表达。通过农杆菌转化后上述转基因体系共得到301株抗性苗,提取基因组DNA,PCR验证后得到72株阳性苗随后利用实时荧光定量PCR(Real Time–PCR)技术检测基因在半夏中的表达量,发现转基因半夏中几种基因的表达量均有了较大的提高,证明上述基因均在半夏中呈高水平表达。

关键词： 噻嗪酮   降解   16S rRNA   Rhodococcus sp.   降解途径   融合  

摘要： 噻嗪酮是一种新型的杀虫剂,能够通过抑制几丁质的合成干扰昆虫的新陈代谢,主要用于对飞虱、粉虱、叶婵及介壳虫等同翅目害虫有很好的防治作用。由于噻嗪酮在使用过程中的不规范储藏,和在农作物上的重复喷洒,对环境造成了危害。因此,如何治理环境中的噻嗪酮残留就成为了我们急需解决的难题。可通过物理方法、化学方法、生物方法治理环境中的噻嗪酮污染,生物降解是治理的重要方法之一,高效降解菌能够将噻嗪酮作为碳氮源将其代谢成小分子物质,在生物修复中起着重要的作用。遗憾的是,有关噻嗪酮降解菌的报道只有五株,有关其降解途径的报道也少之又少。本研究从常年生产噻嗪酮农药的工厂排污口处采取水样与土样,于100 m L无机盐培养基中,并添加噻嗪酮作为碳源,在30°C、160 rpm min-1摇床条件下经富集驯化和分离纯化,成功筛选到多个高效降解菌。对具有噻嗪酮降解能力的菌株做了降解能力的验证,选择一株降解能力较好的菌株展开研究,将其命名为RX-3。通过形态学、生理生化实验及16S rRNA序列比对鉴定菌株RX-3为红球菌属(Rhodococcus sp.),其最适生长温度为30°C,最适生长酸碱度值为7.0,且对金属离子Ba2+、Zn2+和Cu2+有一定的耐受性。当无机盐中噻嗪酮浓度为60 mg L-1时,菌株RX-3在80 h内能够降解98.01%的噻嗪酮。使用二氯甲烷等体积萃取法提取到噻嗪酮的降解产物,并借助于气相色谱质谱联用仪分析了9种中间代谢产物,初步剖析了噻嗪酮的降解途径。在代谢途径A中,噻嗪酮中的杂环发生水解生成中间代谢产物B;在代谢途径B中,噻嗪酮的代谢起始于侧链中叔丁基和异丙基键的断裂,伴随产物C,E和F的生成,随后发生了水解反应和氧化还原反应。在代谢途径C中,噻嗪酮的代谢起始于苯环与N之间化学键的断裂,生成中间代谢产物D。本研究使用聚乙二醇4000对噻嗪酮降解菌和毒死蜱降解菌的原生质体进行融合,成功获得其融合子。

关键词： 肺炎克雷伯氏菌   膜蛋白   跨膜区域   基因工程   代谢工程  

摘要： 膜蛋白对于细胞的整个生命活动起到非常重要的作用,生物膜中约三分之一的基因编码合成膜蛋白。膜蛋白的生物功能包括物质和能量的运输、参与信号合成与转导、侵染和免疫、防御外界对菌体侵蚀、催化以及维持细胞膜结构等,自身也作为毒力因子。病原菌膜蛋白作为药物靶位、细胞受体和纳米通道越来越受到研究者的关注。膜蛋白约为70%药物靶标,与医药制药和生物技术方向密切相关。为此,本课题以肺炎克雷伯氏菌中膜蛋白的结构和功能为对象进行了研究。本文章中第一部分利用生物信息学手段,对克雷伯氏菌属等肠科杆菌膜蛋白研究进展进行概括总结。根据膜蛋白在生物膜中的位置可分为内膜蛋白和外膜蛋白,通常来说内膜蛋白维持细胞与环境物质,能量和信息交换的功能;外膜蛋白承担载体运输,可作为特异受体、酶、表面抗原等作用。本课题就克雷伯氏菌属膜蛋白研究进展,利用数据库（NCBI、KEGG）和文件检索对***膜蛋白基因功能的研究进展进行概括。同时用TMHMMserverv.2.0软件预测对***膜蛋白的跨膜区域进行预测,挖掘出高度保守序列。膜蛋白作为细胞生命大分子也作为膜骨架具有重要意义,本课题中针对***中特定膜蛋白基因,构建了三株突变菌株分别是 *** ΔpspA、*** ΔpspD、***ΔpspAΔpspD。pspA（KPN01297）和pspD（KPN01300）是 psp 基因簇中的两个基因,它们在某些功能上存在互补。pspA和pspD均作为内膜蛋白对***的生命活动起重要作用,它们能将呼吸醌传递的电化学梯度,即质子动力势进行储存和反馈。本实验分别对它们进行单基因敲除研究和双敲菌株研究。利用三株重组菌株,探究了psp 基因和pspD基因对***蛋白表达水平的影响。SDS-PAGE结果显示在100KDa-130KDa、100KDa、35KDa-40KDa条带表达量与对照组相比差异非常明显。进一步进行MALDI-TOF/TOF-MS和荧光定量PCR检测,结果显示包括与糖代谢相关的酶、外膜蛋白、孔蛋白等于细菌生长密切相关的重要基因表达水平受到影响。根据这一结果,选取了ompF基因进行Western blot的检测,研究表明相比野生菌,ompF基因在***ΔpspDΔpspA中翻译量下调。将重组菌株进行扫描电镜和原子力显微镜观察其表面形态变化,观察发现突变菌株表面皱褶较野生菌株少,但现象不明显。分别以甘油和葡萄糖为底物24h连续发酵培养,检测突变菌株的生物量和底物消耗量。结果发现在以甘油为底物的情况下发酵,相比野生菌株,***ΔpspA的生物量OD600明显高与野生菌株,且***ΔpspA的甘油消耗量大于野生菌株。结果表明pspA和pspD基因影响了菌体甘油代谢的过程,即影响了糖代谢。

关键词： 母血浆   胎儿游离DNA   无创性   产前检测   符合率  

摘要： 目的:探讨母血浆中胎儿游离DNA测序在无创性产前检测中的应用效果.方法:选取我院2015年3月～2017年3月52例孕妇为研究对象,分离孕妇血浆中DNA,并通过PCR技术对母血浆中游离胎儿DNA检测性别决定基因(SRY),并鉴别胎儿性别.结果:在52例孕妇中,其中产出男婴33名(占63.46％),通过PCR技术扩增出SRY基因31名,产出女婴19名(占36.54％),通过PCR技术扩增出ATL1基因18名,特异度及灵敏度分别为94.74％(18/19)、93.94％(31/30),总符合率为94.23％(49/52).结论:在无创性产前检测中应用母血浆中胎儿游离DNA测序灵敏度及特异度高,且具有无创性,不良事件少,具有重要的临床应用价值.

关键词： COPD   Cystic fibrosis   Lung metagenome   Sputum   WGS metagenomic sequencing  

摘要： Background: Cystic fibrosis (CF) is a life-threatening genetic disorder, characterized by chronic microbial lung infections due to abnormally viscous mucus secretions within airways. The clinical management of CF typically involves regular respiratory-tract cultures in order to identify pathogens and to guide treatment. However, culture-based methods can miss atypical or slow-growing microbes. Furthermore, the isolated microbes are often not classified at the strain level due to limited taxonomic resolution. Results: Here, we show that untargeted metagenomic sequencing of sputum DNA can provide valuable information beyond the possibilities of culture-based diagnosis. We sequenced the sputum of six CF patients and eleven control samples (including healthy subjects and chronic obstructive pulmonary disease patients) without prior depletion of human DNA or cell size selection, thus obtaining the most unbiased and comprehensive characterization of CF respiratory tract microbes to date. We present detailed descriptions of the CF and healthy lung microbiome, reconstruct near complete pathogen genomes, and confirm that the CF lungs consistently exhibit reduced microbial diversity. Crucially, the obtained genomic sequences enabled a detailed identification of the exact pathogen strain types, when analyzed in conjunction with existing multi-locus sequence typing databases. We also detected putative pathogenicity islands and indicators of antibiotic resistance, in good agreement with independent clinical tests. Conclusions: Unbiased sputum metagenomics provides an in-depth profile of the lung pathogen microbiome, which is complementary to and more detailed than standard culture-based reporting. Furthermore, functional and taxonomic features of the dominant pathogens, including antibiotics resistances, can be deduced-supporting accurate and noninvasive clinical diagnosis. © The Author(s) 2017.

摘要： The article focuses on teaching law school students in the U.S. about link between health care coverage and bioethics. It informs on coverage of certain treatments, drugs, or procedures by the interest of policy and bioethics; and the role of Patient Protection and Affordable Care Act of 2010 in addressing medical care in the ocuntry. It also informs on the U.S. Supreme court case National Federation of Independent Business v. Sebelius on same.

关键词： 木质素   合成调控   木质素检测方法   基因工程  

摘要： 木质素作为植物次生细胞壁的重要组分,分布于输导组织和木质化组织细胞壁中,不仅具有提高细胞壁的隔水性和机械强度,而且在提高植物的抗病抗逆方面也发挥重要作用。本文从植物木质素的种类、合成调控、检测方法和利用基因工程从源头调控植物木质素含量等方面的研究现状进行了概述。并且随着转基因技术的发展,有望通过更多更有效的途径来改变植物木质素的组成。

关键词： 阿维链霉菌   多拉菌素   基因缺失   发酵  

摘要： 多拉菌素(Doramectin)是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物,可安全高效驱杀猪、牛、羊等家畜的体内和体表寄生虫,已被广泛应用于畜牧业生产。多拉菌素是美国辉瑞公司研发的阿维菌素第三代衍生物,可由基因改造阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生。我国是全球最大的阿维菌素生产基地,产能过剩,但相关企业普遍因技术原因无法实现产品更新换代,国内多拉菌素市场仍主要依靠进口。阿维链霉菌bkdFGH基因编码的支链α-酮酸脱氢酶参与阿维菌素起始单元的合成,其缺失突变可导致阿维链霉菌丧失产生阿维菌素的能力。但当在该突变菌株的发酵过程中添加环己烷甲酸为前体时,就可产生多拉菌素(CHC-B1),同时也会得到CHC-B2、CHC-A1和CHC-A2等无效的多拉菌素类似物。aveD基因编码的C5-O-甲基转移酶可介导多拉菌素B组分向A组分的转化,从而降低发酵产物中多拉菌素的含量。此外,阿维链霉菌中功能未知基因aveC的特定位点突变也有可能提高产物中多拉菌素有效组分的比例。因此,为获取能够生产多拉菌素的菌株,应对阿维链霉菌中bkdFGH, aveD和aveC这三个基因进行改造。本研究以筛选获得的阿维菌素高产菌株为出发菌株,通过基因工程技术对多拉菌素合成基因bkdFGH, aveD和aveC进行改造,获取能够高效产生多拉菌素的工程菌株,并对其发酵条件进行初步优化,为构建稳定高效产生多拉菌素的工程菌株奠定基础。取得的主要结果如下：1.利用同源双交换法构建bkdFGH基因缺失阿维链霉菌突变菌株,在其发酵过程中添加外源前体环己甲酸,发酵产物经高效液相色谱检测发现有多拉菌素(CHC-B1)产生,但同时还有CHC-A1和CHC-A2等无效组分。在此基础上进而对aveD基因进行缺失,构建成功bkdFGH和aveD双缺失突变株,检测发现其仍可发酵产生多拉菌素(CHC-B1),但CHC-A1和CHC-A2等无效组分的含量显著降低。2.在获得bkdFGH和aveD双缺失阿维链霉菌突变菌株的基础上,采取两种方法对aveC基因进行改造：1)利用同源双交换将aveC基因缺失;2)利用全基因合成技术获得包含10个突变位点的aveC*,然后将其整合入bkdFGH和aveD双缺失突变株基因组中,获取可高效表达aveC*的突变株。对其发酵产物分别进行检测,发现aveC缺失可阻断阿维链霉菌中多拉菌素的生物合成,这说明aveC对多拉菌素生物合成是必需的。而该基因的定点改造则能提高多拉菌素的产量,但并未显著改变产物中CHC-B1和CHC-B2的比例。3.以上述突变菌株为研究对象,检测发酵时间、氮源和无机盐等因素对基因改造阿维链霉菌合成多拉菌素能力的影响,通过单因子实验初步摸索最佳发酵条件。结果显示：多拉菌素最佳发酵时间为13天,最佳单一氮源为棉籽粉,在培养基中添加七水合硫酸锌可提高多拉菌素产量。

关键词： 胚胎干细胞   多能性   细胞系   体细胞重编程   PHLDA3  

摘要： 胚胎干细胞(ESCs)取自囊胚的内细胞团,它具有分化成为多种多能干细胞和终端分化的体细胞的潜能,并且具有自我更新的能力,因此一直受到研究人员的青睐。近年来,胚胎干细胞的研究取得了飞跃性的发展。随着胚胎干细胞定向分化成各种终端细胞的技术日趋成熟,它在医学和临床上的应用前景也越来越明朗。同时,在基因组学、蛋白质组学、生物信息学发展的影响下,胚胎干细胞保持其分化潜能的复杂调控网络也日趋清晰地展现在人们眼前。然而,胚胎干细胞在临床应用上面临着来源有限、伦理争议等限制。体细胞重编程技术可以得到与胚胎干细胞(ESCs)特性相似的诱导性多能性干细胞(iPS)。诱导性多能干细胞技术的出现弥补了胚胎干细胞在应用领域的不足。成体细胞的来源十分广泛、取材方便,并且不具有伦理方面的困扰。这为今后干细胞在临床上的大规模应用提供了可能性。同时,这项技术打破了人们对高等动物细胞的固有认识,人们第一次发现高等动物的体细胞也可以在一定条件下转变为具有分化潜能的细胞,为后来的研究提供了启发性的思路。体细胞重编程的效率往往较低,许多基因对该过程起到抑制作用,p53就是其中之一,但是其中的分子机制并不完全明朗。我们在研究中发现,p53的一个直接靶基因,PHLDA3,具有抑制体细胞重编程的功能。该基因在之前的研究中主要被视为一个抑癌基因,而我们发现它参与了 iPS诱导过程。PHLDA3在iPS、R1、E14等干细胞当中含量相对于体细胞更低,并且该基因的表达在体细胞重编程的过程中逐渐下降,而在RA诱导胚胎干细胞分化和拟胚体形成过程中表达上升,暗示它可能与体细胞重编程和干细胞的多能性有关。过表达PHLDA3会明显降低iPS诱导效率,而它的敲低会使诱导效率提高。在体细胞重编程过程中,PHLDA3会抑制AKT的活性,从而激活AKT下游GSK3 β的活性。而抑制GSK3β可以回复PHLDA3过表达所造成的体细胞重编程效率下降,说明PHLDA3通过激活GSK3β抑制体细胞重编程。此外,在体细胞重编程过程当中PHLDA3也受到p53的正调控,并且可以替代一部分p53对体细胞重编程的抑制作用。另外,Oct4会对PHLDA3的表达起到负调控。