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关键词： 转基因生物   基因工程   转基因食品   生物技术产品   农业  

摘要： 1.什么是基因?答:"基因"为英语"gene"的音译,是DNA(脱氧核糖核酸)分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列的总称,是具有遗传效应的DNA分子片段,是控制生物性状的基本遗传单位,是生命的密码,记录和传递着遗传信息。所有的基因都由4种碱基组成。地球生物包括动物、植物、微生物,数量巨大,种类繁多,形态各异,生存环境和生活习性各不相同,这都是由基因控制的。"种瓜得瓜,种豆得豆"是人们对这种

关键词： 新诗   郑敏   胡适   散文化   白话诗   诗歌   诗艺   西方诗歌   诗歌节奏   中国古典诗歌  

摘要： 一新诗粉碎了旧诗的镣铐,取代古典诗歌成为诗坛的正统,迫使古典诗歌退居二线,在中国千年诗歌史上创造了横空出世的自由诗形式。一个世纪以来,经历了尝试、突进、分化、颠覆、危机、建构的曲折历程,思潮的大起大落,流派的迅猛翻新,语言情感的嬗变,风格诡异的衍化,其辉煌,其惊险在中国诗歌史上堪称空前绝后。仅仅百年工夫,其诗艺建构跨越了西方诗歌两三百年的历史,吸收了西方古典主义、浪漫主义、现代

关键词： 妊娠期糖尿病   人胚胎干细胞   胰内胚层干细胞   柚皮素   小鼠模型  

摘要： 妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）是指妊娠期间母体由于胰岛素分泌或者应答异常而造成的不同程度葡萄糖代谢异常。近年来,在中国妊娠期糖尿病发病率逐渐升高,已成为影响妊娠妇女的严重的代谢性疾病,临床上常表现为妊娠期间严重的糖代谢异常。现今对妊娠期糖尿病的治疗手段仍然以传统的治疗方式为主,即饮食指导、运动治疗、胰岛素治疗。然而,受患者依从性及教育程度不同的影响,传统治疗方式对妊娠期糖尿病的控制并不理想。而胰内胚层干细胞移植作为一种新兴的治疗方式,其治疗方法及其疗效越来越受到临床的重视。干细胞治疗相比于胰岛移植具有不受供体不足的限制、可长期供应胰岛β细胞以及减少免疫抑制剂使用等优点,其中人胚胎干细胞由于其全能性较高、分化能力强的优点,具有极大治疗妊娠期糖尿病的潜力。由于妊娠期的特殊性和伦理限制,很多有创研究无法开展,而动物模型是一种较好的研究媒介。本研究根据以往文献构建妊娠期糖尿病小鼠模型,通过Kroon E的四部分离法从人胚胎干细胞定向诱导分化出胰腺胚胎干细胞（hESC-PE）,移植于小鼠体内,检测移植hESC-PE后对妊娠期糖尿病小鼠的治疗效果,疗效分析内容包括检测随机血糖、胰岛素水平、体重等糖尿病常用的监测指标。文献表明,妊娠期糖尿病患者表现出较多的胚胎停育并且在动物实验中妊娠期糖尿病小鼠产生胎儿的数目明显降低,同时在db/+妊娠期糖尿病模型的小鼠中,胎儿的体重增高了5-8%,本研究对其胎鼠体重、胎鼠活胎存活率、2周后胎鼠死亡率也进行观察统计。此外,前期实验还发现,治疗所需要移植的hESC-PE细胞数量较大,而这一现象推测可能与移植手术时容易产生氧化应激反应有关,从而导致疗效的降低。本研究利用柚皮素的的抗氧化作用,提高干细胞应用效率,观察胰内胚层干细胞移植妊娠期糖尿病小鼠联合应用柚皮素缓解妊娠期糖尿病的症状的疗效。第一部分:小鼠妊娠期糖尿病模型的建立和验证目的:建立妊娠期糖尿病GDM小鼠模型,并验证建模是否成功,为后续实验奠定研究平台。方法:1实验选用6-8周龄C57BL/KsJ+/+（野生型,WT）雌性小鼠20只,雄性WT小鼠10只、6-8周龄C57BL/KsJ-Lepdb/+（杂合子,db/+）雌性小鼠20只,雄性db/+小鼠10只。db/+小鼠是由于瘦素受体（Ob R）突变,无法抑制进食行为,在妊娠的过程中,db/+雌性小鼠会表现出食欲过盛的进食行为,肥胖程度增加,进一步导致胰岛素抵抗的发生并出现妊娠期糖尿病症状,表现为轻微的葡萄糖耐受不良,因此,是模拟人类妊娠期糖尿病的最佳小鼠模型。给予小鼠自由饮用灭菌水以及自由进食正常普通饲料（Chow Diet,CD）。13周龄时交配,选取db/+健康雄鼠与db/+雌鼠按1:2比例进行配种,合笼时间为下午五点左右,次日清晨检测雌鼠是否有阴道栓,若有阴道栓记为妊娠第0天（GD0）,配种时间控制在第13周内。同时,野生型WT雌性以及雄性WT小鼠也按上述方法进行交配,作为对照组。2在妊娠期间给予足够一定质量的饲料,让小鼠自由进食,每隔24小时分别记录WT组和db/+组妊娠小鼠的进食量。并在妊娠期第16天（GD16）用天平测定各组妊娠小鼠的体重。在GD 20时,将母鼠异氟烷麻醉后打开腹腔,从子宫中取出胎鼠,称量并记录各组胎鼠重量及胎盘重量。3通过外观行为学观察、GD10及GD18未禁食随机血糖水平测定、外周血胰岛素水平测定,鉴定GDM小鼠模型是否造模成功。4进一步通过糖耐量以及胰岛素激发实验的检测对GDM小鼠模型的糖代谢功能异常进行进一步验证是否造模成功。糖耐量实验具体方法为:两组小鼠先饥饿6小时,然后给予腹腔注射2g/kg体重的葡萄糖,并于注射后0 min、30 min、60 min通过剪尾采取小鼠尾静脉外周血,并立即用罗氏便携式血糖仪测定两组血糖水平。胰岛素激发实验具体方法为:两组小鼠先饥饿6小时,然后给予腹腔注射0.75 U/kg体重的胰岛素,并于注射后0 min、30 min、60 min采集小鼠尾静脉外周血,并立即用罗氏便携式血糖仪测定测定WT和db/+这两组母鼠外周血葡糖糖水平,结果以占胰岛素注射前血糖水平的百分比形式显示（初始值%）。结果:1由于不是所有雌性小鼠在交配后都能够妊娠,最终入组15只WT妊娠小鼠以及12只妊娠db/+小鼠进行实验。2在妊娠前,WT小鼠以及db/+小鼠的能量摄入并没有明显的差异（3.82±0.09克/天、3.98±0.11克/天;P>0.05）,然而妊娠以后,相较于WT小鼠在妊娠期GD0-5、GD6-11、GD12-16的能量摄入量（3.76±0.07克/天、4.01±0.06克/天、4.82±0.08克/天）,db/+小鼠均明显上升（4.08±0.09克/天、4.67±0.08克/天、5.93±0.09克

关键词： 植物基因工程   位点特异性重组酶   基因叠加   筛选标记基因删除  

摘要： 植物遗传转化经历了由“能够实施遗传转化”到“提高遗传转化事件的质量”两个阶段。第一阶段，人们试图转化更多的植物品种和尽量提高遗传转化效率。第二阶段，人们开始着手解决遗传转化过程中的质量问题。在提高遗传转化质量方面，位点特异性重组酶是一个不可忽略的遗传操作工具。位点特异性重组酶已被证明可用来实施筛选标记基因的删除、管理外源基因的表达、提高单拷贝整合效率以及基因叠加等诸多应用。　　在本文第二章中，我们介绍了一种基于重组酶的体外基因叠加系统。该系统运用来源于链霉菌温和噬菌体的phiC31-att系统共整合两个不同的DNA分子，从而将两个基因体外叠加到一个载体中;运用来源于噬菌体P1的Cre-lox系统删除不必要的DNA序列;运用来源于分枝杆菌噬菌体的Bxb1-att系统将体外叠加的载体转移到合适的目标位点中。为了验证该系统的可行性，我们构建了一系列含有单个基因的载体，并运用体外基因叠加的方法构建了一个含有6个外源基因的叠加载体。进而利用农杆菌介导的方式将这6个基因转化到植物基因组中并使其表达。另外，使用同样的方法，我们构建了另外2个含有不同性状基因的载体pWq9和pWq10。载体pWq9含有水稻基因oxs3的2B片段和水稻PTR9基因;pWq10中除pWq9中的基因外，额外增加了水稻WS1基因。我们试图把这两个载体分别定点叠加到我们的水稻目标位点中。能够运用重组酶同时实施体内和体外的基因叠加，并使两个系统相互兼容，这为重组酶介导的植物基因叠加系统提供了新的柔韧性。　　本文第三章介绍了一种热激诱导的筛选标记基因删除技术。gfp基因首先被定点整合到水稻的目标系中，从而生成了一种特殊的结构，使得热激诱导的cre基因和筛选标记基因bar位于两个同向的lox位点之间。对植物热激刺激后，通过PCR和Southern DNA印记检测发现，T0代的13个转基因事件中有4个事件发生了筛选标记基因的删除。因此，该技术具有加快筛选标记基因删除的潜力。

关键词： 纳豆激酶   aprN基因   基因工程菌   酶活   高密度发酵  

摘要： 血栓引起的发病率和死亡率的比重越来越高,溶栓剂是治疗的最有效药物,但当前临床使用的溶栓剂都存在一些缺点,溶栓剂仍需要不断被开发和改进,尤其是预防性的食源性的溶栓剂很有必要。纳豆激酶(nattokinase,NK)最早来自日本传统食品纳豆中,是由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶,由aprN基因编码。作为新型溶栓剂的代表,NK无免疫原性,不仅溶栓效果显著且安全无毒,正成为一种具有开发和利用价值的功能性食品。生产NK的传统方式为固态发酵,尽管产量较高,但NK分离纯化步骤繁琐、酶活损失严重;采用基因工程菌液体发酵又可能存在产生包涵体、酶活性低的问题。为提高NK的产量,本研究主要内容如下:(1)利用PCR技术扩增*** natto的aprN基因,并依据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,添加六个组氨酸片段便于纯化,构建了重组表达质粒pHT01-aprN1。经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其序列的正确性。通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprN1导入*** 168,利用氯霉素抗性筛选获得*** 168/pHT01-aprN1工程菌。(2)探究IPTG和2,6-吡啶二羧酸用量、诱导温度、培养基浓度和接种量对酶活的影响,经摇瓶培养,采用四肽底物法检测最高酶活为289 U/mL(RSD%=1.1),酶活表达稳定性良好,是野生菌的3.9倍。用镍柱纯化发酵上清液,经SDS-PAGE和Western-Blot验证得到电泳纯NK。(3)为实现工业化生产,进行补料发酵实验,酶活达到4521.78IU/mL(RSD%=1.2),进一步优化补料方案,酶活达7778.5 IU/mL(RSD%=1.1)。发酵液经硫酸铵沉淀的酶活回收率为89.02%。冷冻干燥蛋白浓缩液后经镍柱纯化,酶活回收率为93.78%。纯化液经脱盐、冻干后,酶活为20000 FU/mL标准品的4.07倍。

关键词： 猪   核转染技术   诱导性多能干细胞   红色荧光蛋白   iPS技术   胚胎干细胞  

摘要： 多能干细胞是一类具有无限制自我更新能力、同时可以分化成特定组织细胞的细胞,其主要包括胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell,ESC）与诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cell,iPS）两大类,在研究细胞的分化、基因的遗传修饰和再生医学等方面具有重要的研究和应用价值。猪因在解剖、生理及遗传学方面与人类很相似,因此被当作人类疾病模型及异种器官移植的潜在供体。目前虽然也有诸多关于猪的多能干细胞方面的研究,但一直没有建立起真正的猪naive状态的多能干细胞建系。本研究首先利用核转染技术将鼠源OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC四个转录因子表达载体转入猪胎儿成纤维细胞,并通过在培养液中添加 LIF、bFGF、CHIR99021、PD0325901 及 SB431542,成功的建立了猪naive-like诱导性多能干细胞系,并对其进行了红色荧光蛋白标记;本研究同时利用转有鼠源OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC基因的PEF细胞作为核供体,经体细胞核移植获得克隆囊胚,继而将囊胚的内细胞团接种于饲养层细胞之上,在与培养诱导性多能干细胞相同的培养条件下,建立起了猪naive-like胚胎干细胞系。通过以上两个方面的研究,本文着重探索利用iPS技术辅助建立猪naive胚胎干细胞的新方法,为以后通过猪胚胎干细胞研究猪的胚胎发育、基因连续打靶及胚胎嵌合等提供研究基础。目的建立猪naive-like诱导性多能干细胞系,并向所建立的猪iPS细胞系中转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行红色荧光标记;利用iPS技术辅助建立猪naive-like胚胎干细胞系。方法1.建立红色荧光标记的猪iPS细胞系:利用核转染技术,向猪胎儿成纤维细胞（Porcine Embryonic Fibroblast,PEF）中转入鼠源 OCT4、SOX2、KLF4 及 c-MYC四因子表达载体TetO-FUW-OSKM（OSKM）与激活表达载体FUW-M2rtTA（M2rtTA）,通过药物筛选并结合PCR鉴定,获得同时转入OSKM与M2rtTA质粒的转基因细胞株;以ICR小鼠胎儿成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblast,MEF）作为饲养层,将转基因细胞株接入到饲养层细胞之上,在含有DOX的干细胞培养液的诱导下建立猪iPS细胞系;对长出的猪iPS细胞的多能性进行鉴定,包括碱性磷酸酶染色、RT-PCR鉴定多能基因表达、免疫荧光染色及western blot鉴定多能因子表达、体外类胚体分化实验及细胞信号通路鉴定;向所建立的猪iPS细胞中转入红色荧光表达载体pEF1alpha-DsRed-Express2 Vector,对其进行红色荧光标记;通过碱性磷酸酶染色、RT-qPCR及免疫荧光染色鉴定携带有红色荧光标记的猪iPS细胞是否依然具有多能性。2.利用iPS技术辅助建立猪naive-like胚胎干细胞系:以同时转入OSKM与M2rt-TA质粒的转基因细胞作为核供体细胞,通过体细胞核移植的方法获得转基因克隆囊胚,并利用免疫外科法去掉囊胚的滋胚层获得内细胞团,继而将其接种到饲养层细胞上,经含有DOX的干细胞培养液培养,获得naive-like猪胚胎干细胞;通过碱性磷酸酶染色鉴定不同传代次数的胚胎干细胞的多能性;经RT-PCR鉴定干细胞内外源OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC以及其他相关基因的表达;免疫荧光染色结合western blot鉴定干细胞多能因子的表达;体外类胚体分化实验鉴定干细胞的体外分化能力;通过向培养液中添加小分子抑制剂以及western blot鉴定干细胞增殖所依赖的信号通路;降低培养液中DOX的浓度,通过RT-qPCR鉴定干细胞中内外源OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC表达的变化;RT-qPCR鉴定所建立的胚胎干细胞与所建立的iPS细胞之间内外源OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC表达的差异;利用microRNA芯片分析所建立胚胎干细胞、猪体外受精囊胚内细胞团及猪胎儿成纤维细胞之间microRNA表达谱的差异。结果1.成功建立了红色荧光标记的猪iPS细胞系:转基因细胞经含有DOX的干细胞培养液的诱导培养,成功获得了猪naive-like诱导性多能干细胞系。该细胞系克隆外形呈三维立体状,可以通过胰蛋白酶消化进行单细胞传代,具有正常的核型,碱性磷酸酶染色结果呈阳性;经过RT-PCR、免疫荧光染色及western blot结果显示,该细胞系表达 OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG、SSEA-1及TRA-1-81等多种多能因子;提取通过悬滴培养形成的类胚体的RNA,RT-PCR鉴定结果显示有NCSTN、OSTEONECTIN及NEUROD等三胚层相关的基因的表达;P-STAT

关键词： 胚胎干细胞   PRC   灵长类   基因编辑   多能性   人类胚胎   食蟹猴   神经分化  

摘要： 靶向基因编辑猴模型—瑞特综合征研究昆明理工大学、云南省灵长类生物医学重点实验室季维智、陈永昌、牛昱宇团队和同济大学医学院孙毅团队等合作,首次利用运用TALEN技术构建非人灵长类模型对食蟹猴瑞特综合征(Rettsyndrome,RTT)从行为模式、病理发生及其机制的系统研究,相关论文发表于Cell。不同于啮齿类模型,基因突变MECP2的小猴表现出非常类似临床患者的一系列病理和行为学特

关键词： 减数分裂   干细胞   成熟分裂   配子   配偶子   配子体   不孕不育症   原始生殖细胞   功能  

摘要： 文章简介随着不孕不育症的全球性高发,通过体外培养的方式获得功能配子被认为是解决不孕不育症生殖细胞缺乏问题最为有效的途径,但过往的研究表明真实的再现减数分裂过程是体外获得功能配子难以逾越的障碍。本研究首先将小鼠胚胎干细胞分化成原始生殖细胞样细胞,与不育症(KitW/KitW-V)小鼠睾丸细胞共培养及多种细

关键词： 人胚胎干细胞   PHB   HIRA   α-酮戊二酸  

摘要： 染色质地貌和细胞代谢对细胞命运决定有着重要的作用,但人们对它们之间的互相作用却了解甚少。我们运用基因组范围的si RNA筛选,发现PHB对于维持人胚胎干细胞的自我更新具有重要的作用。其具体机制如下:PHB可以和H3.3的伴侣蛋白HIRA形成蛋白复合体;与PHB相似的是,HIRA对人胚胎干细胞特性的维持也起着重要的作用;特别是PHB和HIRA对异柠檬酸脱氢酶启动子区域染色质结构的调节,调控着对胚胎干细胞命运有着重要作用的代谢产物—α-酮戊二酸的产生。我们的研究揭示了在人胚胎干细胞的细胞核中,PHB通过与HIRA复合体相互作用参与维持正常染色质的结构和重要代谢产物的生成,进而使人胚胎干细胞处于自我更新状态。

关键词： L-苏氨酸   大肠杆菌   发酵   甜菜碱   维生素B族   代谢流  

摘要： L-苏氨酸是人体所必须的八种氨基酸之一,具有独特的生理功能,在食品、医药、化妆品、饲料等多个行业有较广泛的应用。本论文首先对菌种进行了改造,探究了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）过表达对L-苏氨酸发酵的影响。然后对大肠杆菌产生L-苏氨酸的发酵过程进行了优化,探究了甜菜碱、B族维生素等不同发酵促进剂对L-苏氨酸发酵的影响。同时分析了添加甜菜碱对L-苏氨酸发酵的代谢流分布的影响。最后探究了细胞循环发酵对L-苏氨酸发酵的影响。本论文所进行的发酵实验是在实验室5L发酵罐中完成的。主要研究内容和结果如下:（1）将过表达pep C基因的质粒p JL225-9导入到*** JLTHR菌株,并进行发酵。发酵30h,产量达到111.2g/L,比*** JLTHR产量提高2.8%。代谢流分析结果表明通过过表达pep C基因,对菌种的代谢途径的代谢流量进行重新分配。其中在GLC6P节点处,流向HMP途径代谢流量提高了22%,流向EMP途径代谢流量降低了7.5%。在PEP节点处,*** JLTHR p JL225-9的代谢流量流向草酰乙酸回补途径提高了4%。（2）通过添加sigma无水甜菜碱、国产无水甜菜碱以及去除了硬脂酸钙的国产无水甜菜碱等三种不同类型的无水甜菜碱探究了其对L-苏氨酸发酵的影响。结果表明,去除了硬脂酸钙的国产无水甜菜碱对L-苏氨酸发酵的提升效果最显著,产量达到119.3g/L,与对照组比较提高7.3%。此外,通过添加不同浓度的甜菜碱盐酸盐和甜菜碱磷酸盐探究了甜菜碱盐类类型和浓度对L-苏氨酸发酵的影响,发酵30h结果表明:甜菜碱盐酸盐在浓度为2g/L的添加量下,L-苏氨酸的产量最高,达到了127.3g/L,与对照组比较提高14.5%;甜菜碱磷酸盐在添加浓度为2g/L的条件下,大肠杆菌的OD600nm最高,达到了63.4,与对照组比较提高了15.3%。甜菜碱含有三个活性甲基,氯化胆碱和甲硫氨酸同样含有活性甲基,在L-苏氨酸合成方面有促进作用。实验表明添加氯化胆碱L-苏氨酸产量为119.3g/L,与对照组比较相等。添加甲硫氨酸进行L-苏氨酸发酵,产量为118.4g/L,与无水甜菜碱效果相似。（3）探究甜菜碱对L-苏氨酸菌种代谢流分布的影响。构建L-苏氨酸菌株的代谢网络,根据代谢流分析理论,使用MATLAB软件线性规划得到L-苏氨酸菌株在发酵中后期的代谢流量的分配。通过代谢流分析,得出葡萄糖在EMP、HMP以及TCA循环中代谢流量分配情况,并确定关键节点GLC6P、PEP和-KG。实验结果表明在节点GLC6P处,添加甜菜碱发酵液后,细胞内葡萄糖流向HMP途径的代谢流量比不添加甜菜碱提高了57.3%。在节点PEP处,添加甜菜碱中细胞中的草酰乙酸（OAA）代谢流比未添加甜菜碱菌体中的OAA的代谢流,提高了10.1%,流向TCA途径的代谢流降低了6.9%。a（4）通过添加不同发酵维生素B族探究其对L-苏氨酸发酵的影响。本论文使用的维生素B有氯化胆碱（VB4）、烟酰胺（VB3）、泛酸钙（VB5）以及钴胺素(VB12),实验表明:添加氯化胆碱对L-苏氨酸的促进效果最显著,L-苏氨酸产量达到133.4g/L。VB3对L-苏氨酸发酵促进效果较显著,产量达到130.6g/L。添加甜菜碱盐酸盐、VB4和VB3的混合发酵促进剂,L-苏氨酸产量达到138.4g/L。（5）细胞循环发酵试验结果表明:离心分离发酵L-苏氨酸产量（达到141.4g/L）较不进行循环发酵提高了7.9%,效果优于陶瓷膜分离发酵。对细胞循环周期和循环发酵策略进行初步探究,发现在菌体循环周期16h,循环策略为V（上清液）:V（浓缩液）=1:2时,L-苏氨酸产量最高,达到148.4g/L,较不进行循环发酵提高了13.1%。