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关键词： 基因工程   翻转课堂   应用研究  

摘要： 针对基因工程课程的特点,以改革当前传统的课堂讲授式教学模式作为突破口,在教学中运用翻转课堂教学模式进行授课,以学生为主体,提高学生分析、解决问题的能力及语言表述能力,以达到更好地教学效果,实现教学相长,培养高素质应用型人才。

关键词： 技术主题发现   共词分析   战略坐标图   基因工程疫苗  

摘要： 本文梳理基于专利文献进行技术领域主题发现的研究方法发展进程,提出一套高效获取专利技术主题词、生成战略坐标图的研究流程,并以基因工程疫苗技术为例,对我国基因工程疫苗技术主题分布及发展趋势进行实证分析。研究结果显示,采用本文构建的共词分析流程和方法,利用专利共词聚类和战略坐标图能较好地识别技术主题及其发展现状。

关键词： CHIR99021   Wnt3a   小鼠胚胎干细胞   心肌细胞  

摘要： 目的观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞(m ESCs)向心肌细胞分化中的作用。方法采用悬浮一步培养法形成拟胚体(EBs),在EBs形成后第2天至第5天分别加入CHIR99021、Wnt3a,命名为CHIR99021组及Wnt3a组,将自动分化的EBs作为对照组。用免疫荧光法检测心肌特异性蛋白肌球蛋白重链(α-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)及膜联蛋白43(CX43)的表达。用qRT-PCR检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达。用Western blot法检测α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达。结果免疫荧光法提示各组m ESCs能够向心肌细胞分化。在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中,Brachyury在分化第7天达高峰;Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的mRNA表达量随着分化时间的延长而逐渐增加,第15天增加最为明显,且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组;CHIR99021组优于Wnt3a组(P<0.05,P<0.01)。Western blot检测结果显示CHIR99021组和Wnt3a组α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达量明显高于对照组,CHIR99021组高于Wnt3a组。结论 CHIR99021和Wnt3a在分化早期阶段通过活化Wnt/β-catenin信号通路可促进m ESCs心肌细胞分化,且CHIR99021促心肌分化作用优于Wnt3a。

关键词： 比格犬   肠道菌群   微生物   益生菌   DNA测序  

摘要： 比格犬在生命科学上的研究意义重大，比格犬粪便菌群分析是非常有必要的。本试验对比格犬粪便中微生物的16S rRNA V4区域DNA进行测序，对大量数据进行统计分析，揭示粪便中微生物的种类以及它们之间的相对丰度和进化关系，探讨粪便微生物的多样性。通过分析可知不同年龄段的比格犬粪便菌群的多样性和结构都有所不同。\n 比格犬专用微生态制剂的研究迫在眉睫。本研究从比格犬粪便内分离并选择4株常见益生菌，对其进行分离纯化，形态学、生理生化、分子生物学鉴定及生物学特性研究：生长曲线测定，耐热性、耐酸性、耐胆盐、耐胃液、耐肠液试验。试验结果表明：43号菌为乳白色菌落，有特殊酸味，经鉴定为嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）。18号菌常成对出现，在KF培养基上呈枣红色，经鉴定为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。25号菌在培养基上呈不规则圆形，边缘不整齐，有粘滞感，经鉴定为地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）。1号菌在WL培养基上绿色，生长速度较慢，经鉴定为热带假丝酵母菌（Candida tropicalis）。实际生产过程中，43号菌、18号菌应当尤为注意加工温度和时间的控制。这四株菌在强酸强碱环境中性能良好，为实际生产应用提供参考。\n 安全性试验显示，这四株菌对小白鼠无致死性，无毒副作用。试验组与对照组小白鼠体重、体温无显著性差异（P>0.05）。25号菌可能对公鼠和母鼠肾脏有促进生长的作用，18号菌对公鼠有促进作用。43号、18号、25号菌对公鼠的脾脏有促进生长的作用。这四种菌对小白鼠肝脏、脾脏、肠均无特异性病理变化。\n 本试验使用的四株益生菌株都是从比格犬粪便中分离到的，为今后比格犬源益生菌活菌制剂的研究奠定基础。

关键词： 胚胎干细胞   线粒体自噬   Pink1调控   多能性诱导   分子机理  

摘要： 自噬是一个高度保守的生理过程，通过囊泡结构将细胞质内的组分进行隔离、包裹，进而与溶酶体融合降解。自噬作为细胞内一个主要的降解和回收途径，在个体发育过程和细胞稳态维持中都起到非常关键的作用。线粒体自噬是细胞内功能异常或者多余的线粒体通过自噬途径降解的过程，对于细胞内线粒体的质量控制发挥着重要作用。在细胞内线粒体主要通过产生ATP为细胞提供能量，但当线粒体受到损伤的时候，就会产生过多的压力信号，从而导致细胞损伤并且最终引起细胞程序性死亡的发生。因此，受损线粒体的识别和降解也是细胞体内稳态维持中非常重要的组成部分。\n 干细胞具有自我更新和多向分化潜能，在疾病模型建立、细胞治疗修复、再生医学方面，有着广阔的应用前景。线粒体作为多能干细胞重要的细胞器，其质量控制和稳态维持对于多能性的影响还不是很清楚。这里我们研究了Pink1调控的线粒体自噬对多能性获得和多能性调控的影响。\n 我们发现多能干细胞中将线粒体自噬介导蛋白Pink1敲除能够引起多能干细胞中线粒体数量会发生积累，线粒体的膜电势降低，ATP产量降低，而细胞中ROS的含量增加。这些结果表明，当多能干细胞中Pink1介导的线粒体自噬缺失后，会导致多能干细胞中功能异常的线粒体发生积累。进一步，我们发现当敲除Pink1后，多能干细胞的自我更新能力显著降低。通过实时荧光定量PCR检测多能性基因的表达情况后发现，Pink1的缺失会显著降低多能性基因的表达，并且体内分化形成的畸胎瘤体积和重量均较野生型的小。\n 重编程过程中，我们发现Pink1敲减会导致细胞内线粒体不能有效清除，从而降低重编程效率。这些结果都表明了Pink1参与了多能性诱导和维持中的线粒体调控。\n 使用Parkin基因敲除的MEF细胞进行体细胞重编程并未发现重编程中线粒体的累积和重编程效率的降低，这些结果表明Pink1并不是通过激活Parkin而调控重编程及胚胎干细胞多能性的。未来的工作我们将筛选Pink1下游作用分子，进一步阐明Pink调控多能性的分子机理。

关键词： 转座子   piggyBac   动物模型   基因工程   基因治疗  

摘要： DNA转座子可以持久、有效地改变哺乳动物以及其他生物物种的基因组,是一类可以改变在其自身基因组中所处位置的遗传因子。piggy Bac转座系统是一种目前常用的哺乳动物基因工程研究工具,用于癌基因发现、转基因动物制备、体内基因转移以及体外细胞的基因修饰如多能性干细胞诱导分化等。此外,piggy Bac转座子还具有宿主基因组无痕剪切、目的DNA序列靶向整合等多种特性,因而在构建动物模型和基因治疗中得到了广泛应用。作为一种新的分子遗传工具,piggy Bac转座系统将在医学和生命科学研究中发挥越来越重要的作用。

关键词： 人胚胎干细胞   原始精原细胞   Wnt信号通路   诱导分化  

摘要： 获得早期发育人原始精原细胞对于研究精子发生过程及深入研究男性不育的病理机制具有重要意义。但是由于取材困难，在体研究的不安全性及伦理限制等问题使其一直成为困扰学者研究的难题。自1998年第一株人胚胎干细胞（hESCs，human embryonic stem cells）成功建系以来，鉴于其在体外有无限增殖、自我更新及向各类细胞分化的特性，有关它的多潜能性维持与诱导分化的机制研究得到许多学者的关注。因此，体外通过诱导人胚胎干细胞向精原细胞分化进而探索原始精原细胞发育的过程，不仅可以避免上述诸多问题的困扰，而且对于我们深入认识精子发生与男性不育，同时为临床药物的研发及筛选建立可靠模型等工作的开展提供坚实的理论依据。\n 目前虽已有文献报道将hESCs诱导成原始精原细胞的研究，这其中包括有添加诱导分化因子，比如骨形态生成蛋白4（BMP4, bone morphogenetic protein4）、BMP7、 BMP8b、干细胞因子（SCF, stem cell factor）、表皮生长因子（EGF, epidermal growth factor）、神经胶质源性神经营养因子（ GDNF, glial cell line-derived neurotrophic factor）及视黄酸（RA, retinoic acid）等，或者与人源/鼠源睾丸基质细胞来源的条件培养基进行共培养，亦有通过在hESCs中过表达DAZL或者VASA(也称作DDX4)进而联合诱导分化因子等方法。但是这些方法因为存在有诱导步骤繁琐，重复性差，周期过长，机制不清楚或者由于慢病毒载体本身带来的安全问题等尚存在一定的争议与讨论。\n 2012年，有学者使用小分子化合物（small molecular compound）对小鼠成纤维细胞进行重编成为化学药物诱导的多潜能干细胞（CiPSCs, chemically induced piuripotent stem cells），当时引起国内外学者的广泛关注与讨论。CHIR99021作为其中之一，是常见的糖原合成激酶（GSK3, glycogen synthase kinase3）的抑制剂，近年来被报道在参与胚胎干细胞多潜能性维持方面，或者促进胚胎干细胞/诱导多潜能干细胞（iPSCs, induced pluripotent stem cells）体外向心肌细胞，肾源性细胞，原始的肾脏近端管状细胞等中内胚层的分化过程中均起着重要的调节作用。视黄酸（RA, retinoic acid）是由维生素A氧化代谢产生的一种具有生物活性的产物，在细胞的增殖与分化、器官形成及内稳态的平衡（视力调节、生殖系统、免疫反应）等生命活动中发挥着关键的调控作用。在体实验研究表明RA在精子发生过程及调控减数分裂的发生中均起着重要的诱导功能。同样体外RA在hESCs或者是iPSCs向原始精原细胞方向的诱导分化中也发挥着不可替代的作用。目前尚没有联合CHIR99021和RA促进hESCs向原始精原细胞的诱导分化的相关报道。\n 近年来有学者报道Wnt信号通路对于哺乳动物睾丸的发育过程中起着重要的作用，其中包括对PGCs的特定化、增殖、迁移、精原干细胞（SSCs， spermatogonia stem cells）的维持及精子发生过程调控均有紧密的关系。但是对于体外诱导原始精原分化过程中，Wnt信号通路是否有参与及如何发挥作用目前尚没有相关报道。\n 本文就上述研究的热点和难点问题从以下三个方面进行相关研究：第一部分：小分子化合物（CHIR99021）联合视黄酸（retinoic acid）作用于hESCs促进原始精原细胞的产生及单倍体细胞的出现；第二部分：Wnt/β-catenin信号通路在CHIR99021诱导胚胎干细胞向原始精原细胞分化中的作用；第三部分：IWR-1阻断由CHIR99021与RA联合诱导胚胎干细胞向原始精原细胞分化。\n 第一部分：小分子化合物（CHIR99021）联合视黄酸（retinoic acid）作用于hESCs促进原始精原细胞产生及单倍体细胞的出现\n 目的：\n 检测小分子化合物（CHIR99021）联合视黄酸（retinoic acid）对于体外hESCs向原始精原细胞诱导分化的作用。\n 方法：\n 通过immunofluorescence，western blotting，flow cytometry，Real-time-qPCR, synaptonemal complex protein(SCP) straining, fluorescence in situ hybridization(FISH)的方法，探索CHIR99021联合RA以不同的作用顺序及作用

关键词： 生物技术   转基因   规划布局   产业化  

摘要： 21世纪是生物技术的世纪,加快转基因技术研发已成为世界各国增强核心竞争力的战略决策。介绍了全球转基因作物的研发、种植及应用状况。农业生物技术产业进入全球化布局的新阶段,各国纷纷规划和布局,以期在渐趋垄断的技术与市场中争得先机。经过20年的发展,我国在生物技术研发领域已取得长足进步,抗虫棉大面积推广,产生了良好的经济效益和社会效益。但受消极舆论环境等因素的影响,推动其他转基因作物产业化的进程缓慢。我国是一个人口大国,粮食供需矛盾突出,大力发展生物技术产业是我国未来的必然选择。我国一方面要在确保安全的基础上坚持走自主创新之路;另一方面政府要建立及时的信息披漏机制,营造良好的舆论环境,从国计民生出发,在科学的基础上自主决策,推动我国生物技术产业的健康、有序发展。

关键词： 人胚胎干细胞   红系祖细胞   透明质酸   三维培养   造血干/祖细胞   诱导   分化  

摘要： 目的探讨采用透明质酸材料的三维培养方法将人胚胎干细胞(h ESCs)来源造血干/祖细胞向红系细胞诱导分化的效果。方法将hESCs与小鼠主动脉-性腺-中肾基质细胞(AGM-S3)共培养(37℃、5%CO_2)12 d的细胞(1.0×10~6)分别种植进海藻酸钠水凝胶、胶原蛋白水凝胶、透明质酸水凝胶内,并以悬浮法培养h ESCs作对照。以流式细胞仪检测细胞表面抗原表达,比较不同材料建立的三维培养的优劣,优化红系诱导分化的三维培养体系。结果海藻酸钠组内细胞培养10 d的GPA^+细胞为2.3%,GPA^+CD36+细胞仅为0.9%而悬浮培养分别为15.8%和6.1%。胶原蛋白组内细胞培养10 d的GPA^+细胞为11.1%,GPA^+CD36+细胞为5.2%,而悬浮培养分别为35.7%和27.7%。透明质酸组内红系细胞GPA^+细胞量和比率分别为2.06×105个和19.6%,而悬浮培养的红系细胞GPA^+细胞量和比率分别为1.62×10~5个和15.7%,透明质酸组是悬浮培养的1.27倍,其中悬浮培养GPA^+CD36-为9.7%,而透明质酸水凝胶为GPA^+CD36-为13.1%。结论与悬浮培养相比,海藻酸钠水凝胶和胶原蛋白水凝胶未表现出明显的扩增红系细胞的效果。透明质酸凝胶建立的三维培养方法利于红系细胞生长,该培养方法诱导分化hESCs得到的红系细胞成熟度提高。

关键词： 基因工程   布鲁氏菌   免疫应答  

摘要： 本研究在S19弱毒菌株的基础上通过一系列手段获得布鲁氏菌Bp26蛋白、Bmp18蛋白双缺失株,待遗传学鉴定合格后用于小鼠实验。将120只小鼠分为实验组、S19对照组和空白对照组3组,将双基因缺失株和S19弱毒株培养24 h后离心收集菌体,使用PBS清洗重悬后进行细菌计数,实验组小鼠腹腔接种检验合格的双基因缺失株5×10~5 CFU的剂量,病菌对照组腹腔接种S19弱毒菌株5×10~5 CFU的剂量,空白对照组腹腔注射同等体积的PBS溶液,观察分析Bp26蛋白做抗原的免疫原性、双基因缺失菌株的毒力情况和免疫应答情况。最终构建出能够区分自然免疫和人工免疫并具低毒性的布鲁氏弱毒菌株。双基因缺失株具有遗传稳定性,采用Bp26蛋白做抗原对3组小鼠的免疫原性测定,表明实验组40只小鼠均未表现出免疫原性,S19对照组40只小鼠中有28只表现出了免疫原性,占70%,空白对照组40只小鼠均未表现出免疫原性,双基因缺失株与原S19弱毒株的免疫应答基本一致,且更为安全。