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关键词： 造血发育   胚胎干细胞   血液谱系细胞   Hoxa9   Runx1c  

摘要： 背景 血液谱系细胞（B细胞、T细胞、NK细胞、髓系细胞等）作为机体免疫应答的核心参与者,在抵御外来病原体、抗击肿瘤等过程中发挥重要作用,细胞的缺失或功能异常都会导致多种疾病的发生。造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）作为一种拥有自我更新能力的多潜能干细胞,可以持续供给所有血液谱系细胞,是正常生理状态下各血液谱系细胞的主要来源。HSCs移植可重建整个造血系统,临床上利用HSCs移植来治疗多种血液类疾病。但在实际应用的过程中,HSCs的来源有限,体外扩增HSCs技术尚无实质性突破,这限制了成熟血液细胞和HSCs的应用。胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）具有易于进行基因编辑和无限来源的特性。因此,结合基因编辑技术,探索利用转录因子组合诱导ESCs定向分化获得造血干/祖细胞（Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs）以及成熟血液谱系细胞具有重要的研究价值。Hoxa9可以增强HSCs的自我更新能力。Runx1c对于HSPCs的发育至关重要。基于此,我们研究了Hoxa9和Runx1c转录因子组合诱导ESCs定向分化再生HSPCs及血液谱系细胞的潜能。 方法 首先利用同源重组的方法将携带Hoxa9和Runx1c基因片段的质粒导入到小鼠胚胎干细胞系（m ESCs）中,构建能够通过药物强力霉素（doxcycline,Dox）诱导从而特异性表达Hoxa9和Runx1c的i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs细胞系。接下来利用实验室前期建立的“两步法”分化策略进行造血谱系细胞分化的研究,即先在体外诱导i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs定向分化获得造血祖细胞（inducible hematopoietic progenitors,i HPCs）,再将i HPCs移植到C57BL/6野生型受体鼠或Rag1-/-免疫缺陷受体鼠体内进行谱系分化。通过流式分析术检测i HPCs在体内再生谱系细胞的能力,以及再生谱系细胞的类型和比例;分选再生的谱系细胞进行基因组PCR明确再生细胞的来源;利用10X单细胞RNA-Seq测序技术解析再生谱系细胞的转录谱特征。最后分选B细胞缺陷的μMT免疫缺陷鼠的LSK细胞分别移植到C57BL/6野生型受体鼠和Rag1-/-免疫缺陷鼠体内,解析i Hoxa9-p2a-Runx1c i HPCs移植到不同种类受体鼠体内再生不同谱系细胞的机制。 结果 （1）通过基因编辑成功构建了i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs细胞系,使用基因组PCR和q PCR实验证明m ESCs细胞系的基因组中包含i Hoxa9-p2a-Runx1c序列片段且细胞系能够在Dox的诱导下特异性表达Hoxa9和Runx1c基因。利用实验室前期构建的体外诱导分化体系,发现i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs细胞系在体外经过诱导分化后能够产生生血内皮细胞（inducible hematopoietic endothelial cells,i HECs）,分选i HECs并将其与OP9-DL1基质细胞共培养,可进一步诱导分化产生i HPCs。将i HPCs分别移植到经亚致死辐照处理的C57BL/6野生型受体鼠和Rag1-/-免疫缺陷鼠体内后,发现i Hoxa9-p2a-Runx1c m ESCs来源的i HPCs在这两种受体鼠体内可分化为不同类型的血液谱系细胞。（2）i HPCs移植到C57BL/6野生型受体鼠体内能够再生包括B细胞、T细胞、NK细胞和髓系细胞在内的多种血液谱系细胞,这些再生的多谱系血液细胞包含多种亚型;分选再生的B/T/NK/髓系细胞进行基因组PCR鉴定进一步确定了再生的各谱系细胞均来源于移植到体内的i Hoxa9-p2a-Runx1c i HPCs;通过10X单细胞RNA-Seq测序实验发现再生的各谱系细胞具有与天然发育来源的对应细胞群相应的转录谱特征。i HPCs移植Rag1-/-受体鼠体内仅能产生T淋巴谱系细胞。（3）进一步分析两种受体鼠体内再生的T细胞激活状态,发现C57BL/6野生型受体鼠脾脏中存在效应T细胞、记忆T细胞和初始T细胞,而Rag1-/-免疫缺陷鼠脾脏中大部分为效应T细胞,不存在初始T细胞。此外,分析两种受体鼠胸腺中的DN细胞,发现野生型受体鼠体内可检测到各个时期的DN细胞,而Rag1-/-免疫缺陷鼠体内几乎检测不到DN细胞,表明Rag1-/-受体鼠体内的T细胞发育存在缺陷;（4）为了解析i Hoxa9-p2a-Runx1c i HPCs移植到不同种类受体鼠体内再生的T细胞具有不同激活状态的机制,将μMT免疫缺陷鼠的LSK细胞（μMT-LSK）和野生型小

关键词： 核酸扩增   CRISPR/Cas12a   可视化检测   转基因作物   DNA甲基化  

摘要： 基于核酸扩增的检测技术作为可以对真实样品中的痕量核酸靶标进行高灵敏检测的方法,在食品安全、农业生产和生物医学等领域发挥着重要作用。经典的核酸扩增方法,例如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等,虽然已经实现了对特定核酸靶标的灵敏、特异性检测,然而仅仅依靠单一扩增反应很难实现超高灵敏度检测,尤其难以达到单分子水平。基于此,本论文从新型核酸扩增体系的构建以及可视化检测等方面进行研究,建立了多种高灵敏、高特异性、可视化的检测方法,并将其应用于转基因作物和DNA甲基化的分析。具体研究内容和结果如下: (1)基于多重LAMP的CRISPR/Cas12a法简单、便携和可视化检测转基因作物。选用转基因玉米的三个外源基因作为目标基因,根据LAMP的引物设计原则,分别针对每个基因设计两条茎环引物。每个基因对应茎环引物的茎环部分设计成相同的序列,因此,仅用一对通用引物即可实现所有目标基因的扩增。向体系中加入所有基因对应的引物,经多重LAMP扩增后,产生大量双链DNA扩增产物。随后,分别将扩增产物加至对应的CRISPR/Cas12a体系中,激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性,切割报告探针释放荧光信号,经紫外灯照射后即可肉眼观测结果。此方法解决了传统DNA嵌入型荧光染料无特异性识别能力的缺点,保证了方法的高特异性和高选择性。结合基于茎环引物的多重LAMP的高效扩增能力和CRISPR/Cas12a的高特异性识别能力,此方法实现了对转基因作物的多重、高灵敏、可视化分析,并可从大量非转基因玉米基因组DNA中检测低至0.5%的转基因玉米基因组DNA。 (2)双指数扩增法对转基因作物的超灵敏、可视化检测。为了进一步提高检测的灵敏度,我们在上一个工作的基础上,增加双指数扩增反应,以期提高扩增效率。首先根据LAMP的引物设计原则分别针对转基因玉米的启动子基因35S和报告基因GUS设计靶向识别目标基因四个区域的引物。经多个热循环的预扩增,一个目标基因可以产生大量的双茎环DNA。此双茎环DNA可以作为LAMP反应起始物,引发后续LAMP扩增。随后利用扩增产物作为桥梁,诱发阳离子共轭聚合物(cationic conjugate polymerization,CCPs)PFP 和荧光染料 SYBR GreenⅠ之间的高效荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET),经紫外灯照射可实现可视化检测。此方法将双指数扩增反应与基于阳离子共轭聚合物的荧光共振能量转移相结合,实现了低至5 pg转基因玉米的快速、超灵敏、可视化检测,并可以从大量非转基因玉米基因组DNA中区分0.01%的转基因玉米基因组DNA。 (3)基于单酶切的级联指数扩增法高灵敏、可视化分析DNA甲基化。利用甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ的高特异性识别能力和级联指数扩增的高效扩增能力,我们建立了一种高特异性和高灵敏检测特定位点DNA甲基化的方法。HpaⅡ选择性地将非甲基化DNA靶标切断,而甲基化DNA保持完整。因此,甲基化DNA可以引发后续级联指数扩增反应,扩增产物激活CRISPR/Cas12a系统的反式切割活性,切割荧光探针释放荧光信号,而非甲基化DNA因被切断而无法引发后续扩增反应,由此可实现DNA甲基化的高特异性、可视化检测。本方法可以精确检测低至1 aM的甲基化DNA,相当于10 μL体系只有6个分子,灵敏度接近单分子水平。此外,此方法能从大量非甲基化DNA中区分低至0.1%的甲基化DNA,并且实现了癌细胞和正常细胞中甲基化DNA含量的分析。

关键词： 石油污染土壤   生物修复   基因工程菌  

摘要： 随着石油开采量和使用量的不断增加,其在开采、运输、储存过程中的不规范操作或事故,导致大量石油进入环境中,造成了严重的环境污染问题。石油是一种成份十分复杂的天然有机化合物的混合物,通常由烷烃、芳香烃、胶质和沥青质组成。根据油源的不同,烷烃组分可占石油的50%～95%,且我国原油含蜡量高,其中石蜡主要成份为长链烷烃,导致了烷烃组分中的长链烷烃含量较高。长链烷烃因其含量高,难降解的特点,提高其处理效率就尤为重要。微生物修复是迄今为止修复石油污染较为有效安全的一种方法,但微生物往往受限于其降解能力,导致了处理效果不理想,通过分子生物学手段构建可降解石油污染物的基因工程菌用于污染修复是一种较为有效的方法,工程菌株因其具有降解能力强、降解底物范围广的特点,成为修复石油污染的理想菌株。 本研究对Acinetobacter vivianii KJ-1中长链烷烃降解基因almA进行原核表达并分析其降解功能。将该基因通过三亲接合转化法转入至野生型石油降解菌Acinetobacter calcoaceticus 21#中,分析其生长特性、降解能力、产酶活性的变化。考虑到基因工程菌直接投加到环境中可能存在着安全性问题,实验制备了石油降解酶制剂用于石油污染土壤修复中。最终对野生型菌株*** 21#进行了全基因组分析及工程菌株*** 21#-A3重测序分析,在分子水平上验证了其石油烃降解能力。主要研究结果如下: （1）对本实验室保藏菌株*** KJ-1中长链烷烃降解基因almA进行原核表达,测定了AlmA蛋白对2-癸酮和2-十二酮的酶活性,分别达到0.39（U/mg）和0.37（U/mg）。并测定了AlmA蛋白的代谢产物,其可催化脂肪酮转化为相应的酯,而在相同条件下不进行长链正构烷烃的羟基化。实验结果证明菌株KJ-1中AlmA蛋白具有Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）活性,参与了烷烃降解途径中的次末端氧化途径。 （2）通过三亲接合转化法将*** KJ-1中almA基因转入至野生型石油降解菌Acinetobacter calcoaceticus 21#中,并通过PCR扩增及测序验证了almA基因被整合至*** 21#基因组中,成功构建出一株基因工程菌。对其生长特性、降解能力及产酶活性进行检测发现:外源基因的导入并未显著影响野生型菌株*** 21#的生长能力,受体菌与工程菌生长趋势大致相同,而在以正二十八烷为唯一碳源的无机盐培养基中,工程菌株*** 21#-A3表现出比野生型菌更强的增殖能力。在正二十八烷降解实验中,与野生型菌株21#相比,工程菌株21#-A3在7 d和14 d时对C的降解率分别提高了6.72%和6.89%。在测定粗酶液酶活时发现,重组工程菌21#-A3制备的粗酶液对2-癸酮、2-十二酮的酶活性分别提高了18.81%和18.56%。 （3）通过对菌株21#和21#-A3制备的酶制剂分别进行土壤修复实验可知,在第1 d和第4 d时两种酶制剂对石油的降解率并无显著差异,第7 d时,二者对1%和5%石油浓度土壤的石油降解率分别达到了20.32%、23.1%和31.64%、35.92%,两种酶制剂对5%石油污染土壤的石油降解率高于1%石油污染土壤,且21#-A3制备的酶制剂石油降解率显著高于21#制备的酶制剂（P<0.05）。 （4）完成了对*** 21#的全基因组分析。菌株*** 21#仅有一个环状的染色体,拼装后序列全长4089750 bp,不含有质粒,GC含量38.67%,预测共有3829条编码基因。通过对编码基因进行KEGG、COG、GO进行功能注释后发现:21#基因组中具有多条与石油烃降解相关基因,包括2个中链烷烃降解基因alk B1＿1、alk B1＿2,长链烷烃降解基因almA、Lad A基因及芳香烃降解基因cat A、cat B、cat C、ben D,并对其相应代谢通路进行了分析。通过对*** 21#中AlmA蛋白进行系统进化发育树及蛋白多重序列比对分析,预测了该蛋白同样具有BVMO活性。同时发现21#基因组中具有氯霉素、头孢菌素等小类抗生素及磺胺类、四环素抗生素等大类抗生素抗性基因。 （5）完成了对*** 21#-A3的重测序分析。编码区上共有11个核苷酸序列发生变化,1个短片段缺失,通过对蛋白功能分析后,预测该变化不会显著影响菌株21#-A3的生长发育能力。并在重测序过程中发现了一段新增氨基酸序列,此序列与*** KJ-1中AlmA序列相似性达到了

关键词： 产琥珀酸放线杆菌   丁二酸   CRISPRi   碱基编辑器   谷氨酸脱羧酶系统  

摘要： 丁二酸是一种重要的C4平台化合物,在食品、医药、表面活性剂、绿色溶剂、生物可降解塑料等领域具有广泛的应用前景。产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）以丁二酸为主要代谢产物,被认为是最有应用前景的丁二酸生产菌之一。然而,由于在发酵产酸的过程中,需添加pH中和剂MgCO,增加了工程操作的难度和染菌的机会;同时,遗传操作工具的匮乏使得获得性能优良菌株困难,从而阻碍了***的工业化应用。针对上述问题,本文通过基因组测序和耐酸机制分析,研究外源引入耐酸系统对改善菌株发酵产酸的作用。研究建立基于CRISPR/Cas的系列基因编辑方法,以及构建***工程菌株,以期实现对***的改造,提高菌株发酵产丁二酸性能。主要研究内容如下:（1）通过对*** ZK进行基因组测序和分析,发现***存在与耐酸机制相关的FF-ATP酶、修复蛋白Rce F、Rad C、Rce O、DNA错配修复蛋白Mut S、Dna K和对大分子修复或保护的AP内切酶,确定缺少细菌中较常见的谷氨酸脱羧酶（Gad）耐酸系统。通过在***菌株中引入Gad系统,构建重组菌gadB-SW和gadBC-SW,发现细胞在pH4.6环境下的存活率提高,但在中性pH下生长受影响;在减少MgCO添加量的摇瓶发酵条件下,gadBC-SW产量比野生菌提高了8.4%;3-L发酵罐分批发酵34 h,用NaCO控制pH 6.5和pH 6.0时,gadBC-SW的丁二酸浓度分别可达47 g/L和31 g/L。（2）以编码乙酸激酶的基因（ackA）为靶基因,研究产琥珀酸放线杆菌的基因敲除方法。就*** CRISPR/Cas基因敲除系统:Western Blotting结果显示来自土拉弗朗西丝菌的Cpf1和经过密码子优化的来自化脓性链球菌Cas9可以成功在***中表达;以e GFP为报告蛋白,鉴定了7个不同表达强度的启动子:pck A>J23119>kasop>gadph>Km>erm E;构建了不同的CRISPR/Cas9基因敲除质粒和CRISPR/Cpf1基因敲除质粒,推测优化Cas蛋白和g RNA的表达量、筛选可辅助的重组酶可能是今后构建CRISPR/Cas基因敲除系统的关键。建立了同源重组基因敲除系统:以质粒p CVD442作为基因敲除载体,利用接合作用、两次同源重组、抗性筛选及蔗糖反筛,获得基因敲除菌株ΔackA。（3）研究构建***基因干扰系统（CRISPRi）。以pLGZ922为骨架载体,通过定点突变Cas9获得dCas9,构建基于CRISPR/Cas9的CRISPRi,但对靶基因ackA的抑制作用不明显。通过定点突变Cpf1获得dCpf1,构建基于CRISPR/Cpf1的CRISPRi,对靶基因ackA有抑制作用,其中dCpf1（E1006A）CRISPRi对ackA抑制效果可达75%以上。与ackA基因敲除菌相比,下调ackA表达菌株的生长OD得到改善,在葡萄糖或木糖培养基中,发酵液副产物乙酸浓度显著下降。下调ackA表达菌株在3-L发酵罐分批补料发酵60 h,产丁二酸57.06 g/L,乙酸2.44 g/L,糖酸转化率0.79 g/g。（4）研究构建基于CRISPR/Cas的碱基编辑器。分别设计构建了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）,发现只有基于CRISPR/Cas9构建的ABE和CBE,可以在***中实现A到G和C到T的转换。通过延长linker和引入2拷贝UGI优化CBE,得到nCas9（D10A）max,编辑效率提高到50%,编辑窗口在PAM上游C-2-12。将大肠杆菌腺苷脱氨酶突变体（Tad A-8e）与Cas9的氨基端融合,构建得到nCas9（D10A）-ABE,编辑窗口在PAM上游A4-8,编辑效率达到100%。此外,对Tad A-8e进行N46L突变,构建鸟嘌呤碱基编辑器（Td-GABE）,在PAM上游G4位点实现了G到T的转换,编辑效率为11%;构建Td-CBE和Td-CBEmax,在PAM上游C5位点,编辑效率100%,实现了C到T的精准转换。同时,考察了碱基编辑器在多位点的碱基编辑情况,发现nCas9（D10A）-ABE可同时编辑至少6个位点,编辑效率可达100%;CBE中的Td-CBE和Td-CBEmax可同时编辑2个位点,且第一个位点的编辑效率为100%,第二个位点的编辑效率为10%。（5）基因工程改造***发酵产丁二酸。根据

关键词： 心肌纤维化   肥厚型心肌病   金属有机框架   微小RNA CTGF   仿生纳米酶  

摘要： 研究背景: 心肌纤维化与肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM）患者的恶性心律失常、心衰、猝死等密切相关,因此早期干预以延缓心肌纤维化进程对预防HCM患者出现恶性不良事件至关重要。但HCM心肌纤维化的发生机制受多重因素的相互影响,导致临床缺乏有效的抗纤维化策略。目前认为炎症,氧化应激,转化生长因子β1（Transforming growth factor-β,TGF-β1）通路等参与心肌纤维化的进展,其中活性氧（ReactiveOxygen Species,ROS）在心肌纤维化的形成过程中发挥着重要作用,过量的ROS可加速心肌纤维化的形成,因此有效清除ROS对于治疗心肌纤维化至关重要。二氧化铈（CeO2）纳米粒因其具有类超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）双重特性,因此具有明显的清除ROS的能力。但是复杂的心肌纤维化病理生理过程提示我们,仅依靠清除ROS不足以逆转心肌纤维化,因此多靶点、多维度的抗纤维化治疗方式可能更有潜力助力心肌纤维化的治疗。 基因治疗可为HCM心肌纤维化的治疗提供新思路,最新研究表明:siRNA CTGF（siCTGF）具有抑制胶原生成,改善心肌纤维化的作用。若能够将化学药物CeO2与核酸药物siCTGF相结合可能发挥协同治疗的作用,起到“1+1>2”的疗效。但由于裸露的siRNA存在易降解,免疫原性高且不容易穿过细胞膜等缺点,同时单独的CeO2纳米粒也存在半衰期短,易发生聚集等问题。因此,如何将siCTGF与CeO2共同递送到心肌纤维化部位,是二者发挥协同作用治疗心肌纤维化的关键。 金属有机框架（Metal-organic framework,MOF）是由有机桥联体和无机结构基元组成的多孔材料,这种材料具有孔径大、生物降解能力好等优点目前已成为核酸药物的一种“明星载体”。其中金属有机框架zif-90材料,是以锌离子和2-甲醛咪唑为原料构造而成的多孔材料,制备过程简单、孔径大,生物相容性好,同时zif-90具有ATP响应作用。由于细胞内的ATP含量明显高于细胞外,故ATP响应可促使药物在细胞内释放,提高治疗效果,因此,zif-90是一种理想的siRNA和CeO2的递送载体。但普通MOF材料存在受单核巨噬细胞系统的阻碍,易被巨噬细胞吞噬,缺乏靶向性等问题。而细胞膜包裹的仿生纳米系统因其低免疫原性、长半衰期、低毒性和先天靶向性等特点,弥补了普通纳米载体的不足。但普通的仿生纳米材料缺乏对心肌纤维化部位的靶向性,而成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein,FAP）在HCM心肌纤维化部位高表达,是天然优良的心脏纤维化病变的靶标分子。文献研究证实细胞经基因编辑后表达抗FAP嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,Car）可实现靶向高表达FAP的心脏纤维化部位作用。故采用anti FAP-car修饰的细胞膜包裹具有促使纳米粒实现心肌纤维化部位靶向聚集的潜力。 第一部分:FM@zif-90/Ce/siR NPs的合成、表征及性能检测 目的:合成具有多功能的基因工程化仿生纳米酶递送系统（FM@zif-90/Ce/siR NPs）,并对其进行表征和性能检测。 方法:利用一锅法将CeO2和siCTGF包裹于zif-90材料中得到zif-90/Ce/siR NPs,通过脂质体挤出法将anti FAP-car修饰的细胞膜封装在zif-90/Ce/siR NPs表面组装成基因工程化仿生纳米酶FM@zif-90/Ce/siR NPs,并对其基本表征,体外释药,酶活性等进行检测。 结果:当siCTGF与zif-90/Ce NPs的质量比为1:100时,zif-90/Ce NPs与siCTGF完全连接。电镜结果显示合成的FM@zif-90/Ce/siR NPs大小、形态均一,在zif-90/Ce/siR NPs的正十二面体核心表面被覆盖着约10 nm厚的细胞膜结构。FM@zif-90/Ce/siR NPs直径约为99.3±3 nm,ζ电势为-17.76±3.03 mV,稳定性良好。X射线衍射技术（XRD）结果显示所制备的FM@zif-90/Ce/siR NPs与zif-90单晶结构一致,证明药物负载对zif-90晶体结构并无影响,X射线光电子能谱技术（XPS）结果证实FM@zif-90/Ce/siR NPs同时存在Ce3+和Ce4+两种价位,具有能够发挥SOD和CAT双重模拟酶活性的潜力。电镜结果表明ATP存在时纳米材料出现明显的崩解,体外释药实验结果显示FM@zif-90/Ce/siR NPs具有良好的ATP响应的药物释放特性。酶学活性检测结果提示该体系具有SOD和CA

关键词： 生物保守主义   人类增强   人性   基因工程  

摘要： 生物保守主义出于保护人性的目的在原则上反对人类增强。这种主张可以从三个方面来理解：一是我们应当保护人性中固有的内在价值，也就是人性所具有的神圣性；二是人性为人类尊严、人权、道德地位等其他重要的价值提供了基础；三是人类增强对人性产生影响，最终会危及人类社会的政治体制。然而，生物保守主义并未对人性给出清晰的解释，将人性等同于由遗传产生的一系列特质的做法也存在问题。在此基础上形成的对人类增强的反对意见难以成立。对于人类增强的讨论应当从人性的概念框架转向特定增强技术在具体情境中产生的伦理问题。

关键词： 关中奶山羊   胚胎干细胞   4i/LA体系   多能性   转录组测序  

摘要： 关中奶山羊是我国关中平原地区的特色山羊品种,上世纪80年代以西农萨能奶山羊为父本,本地优质奶山羊为母本选育而成,具有产奶量稳定、乳品质好等特点。但相比于其他家畜,奶山羊研究起步晚,育种基础薄弱,导致奶山羊的遗传育种进展十分缓慢。传统育种存在周期长、性状选择不显著以及遗传资源利用不够充分等问题。因此,利用生物技术对奶山羊进行遗传改良是奶山羊育种的趋势。干细胞育种是指通过在体外建立稳定的家畜干细胞系,与核移植、体外受精、基因编辑等技术相结合,快速获得优良个体,从而实现家畜遗传改良的一种育种手段。同传统育种相比,干细胞育种可以大大缩短世代间隔,快速生产具有优良性状的家畜,为家畜育种提供了新的思路。然而,截至目前,能够在体外稳定生长的山羊胚胎干细胞尚未见报道。 本研究以关中奶山羊第5天囊胚为试验材料,分离获得了能够在体外稳定生长的关中奶山羊胚胎干细胞,并通过观察细胞形态、碱性磷酸酶染色、检测多能性标记基因在mRNA及蛋白水平上的表达和拟胚体试验等验证分离获得的胚胎干细胞的多能性,获得的主要结果如下: (1)利用已公开的两种培养体系pEPSCM、bEPSCM和本实验室前期提出的TePR体系(未公开)以及本实验室前期在绵羊ESCs培养中优化得到的4i/LA培养体系,进行关中奶山羊胚胎干细胞的体外分离培养,成功利用4i/LA培养体系(以mTeSR PLUS为基础培养液,补充添加WNT信号通路抑制剂IWR-1、MEK信号通路抑制剂PD0325901、PKC信号通路抑制剂Go6983、SRC信号通路抑制剂CGP77675、LIF、Activin A和Vitamin C)从D5囊胚中分离获得了山羊胚胎干细胞(Goat embryonic stem cells,gESCs),gESCs呈边缘清晰的圆顶状克隆,核质比高,目前已在体外培养至20代。 (2)初步对分离获得的gESCs多能性进行鉴定,相关鉴定试验结果显示gESCs碱性磷酸酶染色呈阳性;实时荧光定量PCR结果显示,在mRNA水平,gESCs中OCT4、SOX2和NANOG等多能性标记基因的表达显著高于山羊成纤维细胞(Goat fetal fibroblasts,gFF)(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,gESCs在蛋白水平表达多能性标志基因OCT4、SOX2和NANOG,此外还表达干细胞表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA4;体外拟胚体试验结果表明,gESCs能够形成类似胚胎的球状结构,在分化培养液中培养28 d后,实时荧光定量PCR结果表明分化后的拟胚体表达三胚层标记基因,包括外胚层标记基因PAX2,中胚层标记基因PDGFRA和内胚层标记基因GATA6,表明分离获得的gESCs具备一定的体外发育潜能。 (3)gESCs及gFF转录组测序共鉴定出7364个差异基因,其中3945个基因上调,3419个基因下调。COG分类分析和GO富集分析结果显示,差异基因主要集中在蛋白质翻译、WNT信号通路调节和细胞增殖等生物学过程。KEGG分析进一步富集到多个与维持gESCs多能性及分化相关的差异基因,主要靶向WNT信号通路、PI3K信号通路和MAPK信号通路,从分子水平上初步对gESCs多能性调控网络进行解析。 综上所述,本研究利用4i/LA培养体系成功分离获得了可在体外稳定生长的gESCs,并对分离获得的gESCs多能性和体外发育潜能进行了初步鉴定,同时利用转录组测序对调节gESCs分化的分子机制进行了初步研究,为山羊胚胎干细胞研究提供了实践与理论参考。