教学课程资源库 更多>>

关键词： 骨髓间充质干细胞   分离纯化   鉴定   生长曲线   阳离子脂质体   Sox9基因   软骨   温敏性水凝胶   壳聚糖   组织工程   组织工程   软骨细胞   基因工程  

摘要： 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞(RMSCs)的分离纯化培养及鉴定【目的】体外分离纯化、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(Rat bone marrow mesenchymal stem cells,RMSCs),为下一步实验和研究提供材料。【材料与方法】***的分离纯化培养从5-6周龄的Sprague Dawley(SD)大鼠后腿骨中提取大鼠骨髓,用D-Hanks液稀释以充分掺入,800 rpm/min离心5分钟;弃去上清液,用DMEM轻柔地将细胞分散成单细胞悬浮液。将此悬浮液缓慢加入密度淋巴细胞分离培养基(ρ:1.077g/cm-3)的表面,并以3000 rpm/min离心20分钟,取出单核细胞层并用D-Hanks液洗涤两次,置入含有20%胎牛血清(FBS)的DMEM培养瓶中进一步培养。***的鉴定通过台盼蓝实验检测细胞存活率。将培养瓶放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,48小时后更换培养基,弃去未贴壁的细胞,并且每天在倒置相差显微镜下观察细胞状态。待细胞融合长满培养瓶底部时,用0.25%胰蛋白酶消化并传代。通过流式细胞术及体外定向诱导分化鉴定第三代RMSCs细胞。【结果】1.形态观察:接种后,RMSCs分布于培养瓶底部,呈圆形,细胞质明亮,折射性好。单个细胞在24小时后开始粘附于壁,增大并且细胞质向外延伸,类似于成纤维细胞,48小时后,贴壁细胞的形态为梭形,三角形,扇形及圆形。5天后,细胞形成分散的集落。2.流式细胞检测:流式细胞检测结果显示CD29和CD44阳性率分别达到95.34%、85.12%,而CD34和CD45阴性率分别为4.69%、5.12%。MTT生长曲线显示细胞增殖较快,生长状况稳定。3.体外定向诱导分化:诱导成脂实验中,经鉴定细胞内有脂滴集聚,证明定向成脂较好;诱导成骨细胞,采用茜素红染色,观察到细胞内有较多的钙结节,证明定向成骨较好;诱导软骨细胞,经Ⅱ型胶原-FITC染色测定,在绿色荧光显微镜下细胞呈现绿色,呈阳性表达软骨细胞特性。【结论】联合运用密度梯度离心和贴壁筛选法分离纯化培养RMSCs,可获得纯度高、增殖速度快、生物学特征稳定的RMSCs,为下一步实验提供理想的种子细胞。第二部分纳米阳离子脂质体的制备及Sox9基因转染【目的】探讨通过纳米阳离子脂质体将Sox9基因转入RMSCs并实现其表达的可行性。【材料与方法】1.阳离子脂质体的制备采用薄膜分散法制备阳离子脂质体。简而言之,准确称取350mg 2,3-二油酰基-丙基(2,3-Dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium,DOTAP)溶解于1ml氯仿中,并与370mg二油酰基卵磷脂(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)混合。用氯仿将混合物总体积稀释至10ml并涡旋10分钟。使用旋转蒸发器在50℃下蒸发溶剂,使DOTAP和DOPC以薄膜分散在管壁上。干燥后继续蒸发1小时以除去残余溶剂。将脂质膜制成粉末并在剧烈搅拌下溶解于4ml水中以形成阳离子脂质体。通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)和动态激光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)对该制剂进行进一步表征。取一定量的阳离子脂质体,加水稀释定容至10 m L,稀释液加入样品池中进行测定,以微粒个数为基准,测定粒径和Zeta电位。每个样品测定6次,取平均值。取一定量的阳离子脂质体,加水稀释定容至10 m L,取稀释液适量至小烧杯中,静置10 min,加3%磷钨酸负染,吸取负染液滴至铜网上,滤纸吸去多余染色液,静置30 min,使微粒沉积在铜网上,利用TEM观察粒径大小和形态。所有测量均在25℃下进行。2.阳离子脂质体介导转录因子Sox9的RMSCs诱导分化研究采用体外培养的第三代RMSCs进行后续实验。首先将Sox9质粒与阳离子脂质体溶液(不含FBS)在室温下充分混合,静置20分钟。然后将此混合物添加到含有RMSCs的6孔板中,并在37℃、5%CO2培养箱中培养。4小时后换完全培养基培养,继续培养做后续检测与鉴定。其中,细胞转染分为3组,(1)实验组:阳离子脂质体载Sox9质粒的转染组;(2)对照组1:仅含等量的阳离子脂质体;(3)对照组2:市售Lipofectamine 2000载Sox9质粒的转染组。培养6天后,用免疫化学法鉴定细胞。3.检测Sox9基因表达对于上述实验,接着连续培养7天后,收集细胞上清,采用酶联免疫吸附法(ELISA实验)测定RMSCs中Sox 9的表达量及持续时间。使用SPSS统计软件进行统计分析。【结果】1.阳离子脂质体的鉴定阳离子脂质体的平均粒径为85.76±3.48nm,zeta电位为1

关键词： 基因编辑技术   伦理原则   菲尔德   艾滋病   胚胎基因   人类胚胎   基因疗法   编辑器   胚胎细胞   生物伦理学   编辑修改   宽体客机   基因武器  

摘要： 2018年世界艾滋病日前夕,一条消息引起轩然大波,中国科学家贺建奎宣布,世界首例基因编辑婴儿—一对名为露露和娜娜的双胞胎健康诞生。这对双胞胎的一个基因经过修改,使她们出生后就能天然抵抗艾滋病。基因编辑婴儿究竟是否可行,需要从基因编辑和基因疗法本质和发展来看待。

关键词： SPOC   翻转课堂   基因工程   教学调查  

摘要： 针对《基因工程》慕课学习情况,教学团队结合大学生特点和课程特点进行了调查问卷设计,并通过蓝墨云班课APP开展调查,分析SPOC教学模式的教学效果,结果显示学生自主学习能力有了显著提高,课堂气氛活跃,学生踊跃发言,学生的问题多了,学生的大脑动起来了,学生的演讲能力提高了。

关键词： 胚胎干细胞   纳米颗粒   蛋白质组学   二氧化钛   毒性分析  

摘要： 人胚胎干细胞具有无限的自我更新能力及分化潜能,可作为药物研发及化合物毒性预测的体外模型,也是目前唯一一个国际公认的利用细胞系而无需怀孕动物的发育毒性体外模型。近年来,纳米颗粒越来越多地被应用于食品和医药等行业,因此,纳米颗粒对人体健康的潜在风险越来越受到人们的关注。虽然已有多种纳米颗粒造成生物效应的报道,但其对人体的影响及其潜在的机制尚未有系统研究。在本研究中,我们以人胚胎干细胞体外分化系统为模型,结合定量蛋白质组学方法,从细胞应激反应、分化抑制以及分子通路等途径,评估广泛应用的纳米二氧化钛对人胚胎干细胞的影响。研究通过细胞生物学分析,明确了粒径20nm的纳米二氧化钛对人胚胎干细胞的毒性,并在蛋白质组学分析中发现了 328个蛋白的表达水平在人胚胎干细胞暴露于纳米二氧化钛后发生了的显著变化。通过进一步的富集分析发现,纳米二氧化钛会导致人胚胎干细胞的DNA损伤增加,氧化应激水平升高,细胞凋亡增多以及细胞分化抑制。同时,在畸胎瘤形成实验中,人胚胎干细胞在暴露于纳米二氧化钛后所形成的畸胎瘤明显小于对照组,这说明纳米二氧化钛严重影响了人胚胎干细胞的多向分化潜能。而在人胚胎干细胞向心肌细胞的体外分化实验中,亦发现人胚胎干细胞在暴露于纳米二氧化钛后,其向心肌细胞分化的能力显著减弱。综上,本研究以人胚胎干细胞体外分化系统为模型,结合定量蛋白质组学方法,建立了纳米颗粒对人体生物效应的体外研究平台,并系统全面地揭示了人胚胎干细胞在长期暴露于20nm纳米二氧化钛后其分子水平的变化,亦明确了其多能性和分化潜能受到了严重的影响。该研究为胚胎干细胞联合纳米技术、新材料在生物医学的应用提供了指导,也为纳米材料在医药食品应用的安全评估提供理论依据,为纳米科学在多学科的应用前沿研究方向提供了参考。

关键词： 人胚胎干细胞   多能干细胞   神经中胚层祖细胞   自我更新   后端神经板   细胞治疗  

摘要： 人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）在体外可以维持稳定自我更新,是能够分化产生所有类型成体细胞的多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）。通过体外定向分化产生各种不同类型的细胞,可为细胞替代治疗提供潜在的细胞来源,在再生医学应用方面拥有巨大的发展前景。脊髓作为中枢神经系,具有上下传导神经信号、神经信号整合、协调运动等多种功能。肌萎缩性脊髓侧索硬化、神经性肌肉萎缩等脊髓退行性病变以及外源性创伤都将导致脊柱损伤,目前的手术、药物治疗方式对脊髓损伤的治疗效果有限,细胞移植有望成为脊髓损伤治疗的新手段。神经中胚层祖细胞（neuromesodermal progenitors,NMPs）不仅可以分化为脊髓中的神经细胞,而且还可以产生脊髓周边的中胚层组织,在脊髓损伤的细胞治疗中具有独特的应用价值。目前已经建立了较为成熟的诱导手段,将人PSCs分化为SOX2和T阳性的NMPs,但是如何实现NMPs的自我更新仍是有待解决的问题。本论文遵循体内发育线索,通过使用双重Smad抑制,同时激活WNT和FGF信号通路,成功获得了可以稳定自我更新的NMPs（self-renewing neuromesodermal progenitors,srNMPs）。该细胞共表达神经标志基因SOX2和中胚层标志基因T,同时还表达神经干细胞标志基因NESTIN、NCAD、CD133,增殖标志基因MKI67以及HOX家族基因HOXB8、HOXB9,验证了其脊髓后端神经干细胞的特征。srNMPs可在体外稳定传代超过30代,并维持细胞表型的稳定。在不添加任何形态发生素的神经分化条件下,srNMPs细胞分化产生vGLUT2、TACR1、SST、PAX2、HOXB8、HOXB9阳性的脊髓V0G神经元。添加SHH、RA进行腹侧化诱导一周,srNMPs细胞被诱导为OLIG2阳性的运动神经前体细胞,神经分化三周后可产生共表达ISL1、ChAT、vAChT的运动神经元。激活WNT、BMP4进行背侧化诱导一周,再经过三周的神经分化,srNMPs细胞可分化为ATOH1、PAX3、PAX7阳性的脊髓dl1区中间神经元。该结果说明了srNMPs细胞可响应背腹轴信号的诱导,从而分化产生脊髓不同背腹轴定位的神经元。NMPs不仅是脊髓的前体细胞,而且是临近的轴旁中胚层（paraxial mesoderm）的前体细胞,轴旁中胚层主导了体节的形成,可进一步分化为软骨、骨骼肌、骨和真皮等中胚层组织。目前对NMPs的鉴定主要基于SOX2和T的共表达和向脊髓神经细胞的分化,NMPs在体外向中胚层细胞的分化尚有待验证。为了进一步证明srNMPs的中胚层分化潜能,我们通过单克隆分化、悬浮培养成球分化和体内肾包膜移植等实验来证明srNMPs具有神经和中胚层双向分化潜能。单克隆形成实验中,单个srNMPs细胞形成的克隆可在N2B27基础培养基中自发分化,可产生α-SMA阳性的中胚层细胞和MAP2阳性的神经元。同样,srNMPs也可在肾包膜下可分化成α-SMA阳性的中胚层组织和MAP2阳性的神经组织。悬浮培养实验中,srNMPs细胞成球后自发分化,可产生包含神经组织、软骨组织、肌肉组织的复杂结构,类似于胚胎发育过程中的脊柱。以上结果进一步证明了srNMPs细胞是神经中胚层祖细胞,具有中胚层和神经外胚层的双向分化潜能。本论文还对NMPs的发育起源及机制进行了一些探讨:1.使用小分子抑制剂SB431542、DMH1、LGK974分别抑制TGFβ、BMP、WNT信号通路,可将hESCs诱导成FOXG1阳性的前端神经上皮细胞,但是再激活WNT和FGF信号通路时,其无法转变为NMPs,从而证明了NMPs和前端神经外胚层细胞具有不同的发育起源。2.过表达FOXG1的细胞可以被成功诱导为NMPs,证明了前端神经外胚层细胞无法被诱导为NMPs的关键基因并非是FOXG1。3.有文献报道,SP8敲除小鼠的脊柱发育异常,所以本研究通过CRISPR/Cas9技术获得SP8敲除的hESCs,但是该细胞仍可被成功诱导为NMPs,证明了SP8不是NMPs诱导过程的关键基因。4.有报道证明,NMPs细胞中调控SOX2表达的增强子原件与ESCs、神经上皮细胞不同,NMPs细胞的SOX2的表达受增强子N1调控,ESCs和神经上皮细胞的SOX2的表达受增强子N2调控。通过甲基化测序检测,人的ESCs、NE及NMPs的SOX2增强子N1、N2中的甲基化状态,检测其是否存在差异。检测结果显示SOX2的增强子N1、N2的甲基化位点基本上没有发生甲基化现象,所以SOX2的增强子N1、N2的表达活性差异并非通过甲基化调控实现。综上,本研究成功获得了可以稳定自我更新的NMPs,该细胞共表达基因SO

关键词： 细胞膜表面改性   糖聚物   胚胎干细胞   巨噬细胞   免疫反应  

摘要： 细胞膜表面的糖作为细胞的最外层,是一类被细胞外环境最先识别的分子,因此细胞膜表面糖类参与了众多重要的生物过程,比如细胞分化、免疫反应、疾病进展及细胞的凋亡等。然而天然糖类结构的多变、异质和复杂性,限制了研究者们探索糖分子的结构和种类对特定细胞功能的影响,因此通过化学合成的手段制备结构规整可控的糖聚物并结合细胞膜表面改性方案将其修饰到细胞膜表面,有助于研究具有特定结构的糖聚物对细胞间的信号交流以及细胞功能的影响,为细胞膜表面工程的发展提供方法论指导及应用基础。基于以上思路,本论文围绕“合成糖聚物对细胞膜的改性及对细胞功能的调控研究”这一主题展开了系列研究工作。鉴于细胞膜表面糖类在调控胚胎干细胞(ESCs)分化行为和免疫反应这两个过程中的重要性,本论文利用合成糖聚物修饰到细胞膜表面实现对上述两种过程中细胞功能的调控。首先通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合与聚合后修饰(PPM)相结合,制备了新型的磷脂化糖胺聚糖类似物,系统研究了其对不同种类细胞膜表面的修饰,以及对小鼠ESCs(mESCs)神经分化行为的影响和对特定信号通路的调控作用,为细胞膜表面糖类和受体参与的ESCs其他分化行为的研究提供了新的途径和思路。鉴于磷脂化糖聚物在细胞膜表面的停留半衰期通常为几个小时,在后续的研究中我们进一步发展了一种基于膜结合HaloTag蛋白(HTP)平台在细胞膜表面稳定修饰外源糖聚物的方案,拟研究发生在较长时间尺度上的生物过程,例如免疫调控过程。我们结合了重组蛋白技术与RAFT聚合方法在细胞膜表面稳定修饰系列特定结构糖聚物,研究了不同种类的合成糖聚物修饰癌细胞后对巨噬细胞极化及树突状细胞成熟的影响,突出了癌细胞膜表面特定结构糖聚物在调控免疫细胞活性过程中的重要性,有望实现糖聚物改性的癌细胞在肿瘤免疫治疗中的应用。主要研究内容如下:(一)新型磷脂化糖胺聚糖类似物的合成及其对细胞膜表面的修饰。首先采用RAFT聚合方法,将4-乙烯基苯磺酸钠(SS)、N-甲基丙烯酰葡糖胺(MAG)和甲基丙烯酰氧基荧光素(FluMA)进行聚合,制备了一系列绿色荧光素标记的糖胺聚糖类似物(pSMF),进一步将聚合物末端还原成巯基后与合成的马来酰亚胺化的磷脂分子(MAL-DPPE)发生点击反应,从而将磷脂分子接枝到糖胺聚糖类似物主链上。通过核磁氢谱、红外以及聚合物溶液巯基密度的测定验证了磷脂化糖胺聚糖类似物(DPPE-pSMF)的成功合成。激光共聚焦显微镜荧光照片及单个细胞绿色荧光强度分布证明了 DPPE-pSMF成功结合到模型细胞HeLa的表面,而不带磷脂基团的pSMF则被HeLa细胞内吞;流式细胞仪结果证明了 DPPE-pSMF 结合到 HeLa 细胞膜表面的量有一定的聚合物浓度依赖性;并且结合到细胞膜表面的糖胺聚糖类似物具有促进L929细胞增殖的效果。(二)磷脂化糖胺聚糖类似物对mESCs细胞膜表面的修饰及其对mESCs神经分化的影响。倒置荧光显微镜图片证明了 DPPE-pSMF孵育mESCs细胞1小时后能成功修饰到mESCs表面上。用不同糖聚物诱导神经分化14天后的结果显示:DPPE-pSMF孵育细胞的β3-tubulin(神经元特异性表达marker)表达量分别达到pSMF和天然肝素孵育的细胞表达量的～1.9倍和～3.8倍,并且在相同的分化周期下,与pSMF和天然肝素孵育的细胞相比,DPPE-pSMF孵育的细胞分化的神经细胞更多。我们进一步探索了 DPPE-pSMF促进mESCs高效分化成神经细胞的机制,结果显示修饰到mESCs细胞膜表面的合成糖胺聚糖类似物可以增强成纤维生长因子2(FGF2)与细胞膜表面的结合,并增强了细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化,表明DPPE-pSMF修饰mESCs膜后增强了对FGF2-ERK1/2信号通路的激活。上述结果揭示了我们合成的特定结构糖胺聚糖类似物引入到mESCs能够促进其神经分化的高效性,且该细胞膜表面修饰糖聚物的方案也可以用于调控细胞膜表面受体介导的其他细胞功能。(三)基于HTP的蛋白融合技术与RAFT聚合相结合在细胞膜表面稳定修饰合成糖聚物。首先通过基因转染将合成的HTP质粒转染进HeLa细胞,筛选21天后得到细胞膜表面稳定表达HTP的HeLa细胞系(HTP-HeLa);进一步通过化学合成的手段制备了一种新型的氯代烷烃修饰的链转移剂(CPADB-C1),利用该合成的链转移剂进行了 MAG和生物素单体的RAFT聚合,得到氯代烷烃修饰的生物素标记的葡萄糖聚合物pMB。通过核磁及体积排除色谱(SEC)验证了pMB的成功制备。激光共聚焦荧光图片结果证明了 pMB于37oC下孵育HTP-HeLa 1 h可以成功修饰到细胞膜表面,并且其在细胞膜表面的停留时间长达7天,证明通过细胞膜表面结合的HTP在细胞膜表面引入外源

关键词： 课程基地   高中生物   生活化教学  

摘要： 课程基地是现有教学课堂的延伸、升华和补充,江苏基础教育正进入大机会时代,课程基地是内涵发展的大平台大机会,校外有特色的课程基地就是一个很好的平台.到富有水乡特色的千岛菜花校外课程基地进行基因工程及其应用的生活化教学,不仅能够使学生掌握生物学知识和科学方法,而且能够提升学生的生物学素养.

关键词： 微课教学   重难点   《基因工程》  

摘要： 微课教学是近些年较为先进的一种教学方式,已经引起了广泛关注。微课教学在《基因工程》教学中的应用能够更显著吸引学生的学习兴趣,提高课堂教学效果。随着生物专业的持续发展进步,《基因工程》课程越来越注重培养学生实践能力、促进学生创新意识,为生物技术专业本科生后续的研究深造提供可靠的理论和技术支持。将现有的微课模式引入到《基因工程》的重难点教学中,不仅有利于学生更好掌握并融会贯通课程的重难点,还有利于推动微课教学的发展和应用。本文在分析当前大学课堂教学现状和存在问题的基础上,尝试并分析重难点微课教学模式嵌入《基因工程》教学的效果,以期为大学生教育教学改革提供参考价值。

关键词： African bioethics   Research ethics   Ethical imperialism   Critical thinking   Bioethical principles   Africanity   Ubuntu  

摘要： BackgroundA trend called African bioethics' is growing on the continent due to perceptions of existing bioethics, especially guidelines for international collaborative research, as ethical imperialism'. As a potential alternative to Western Principlism,' African bioethics' is supposed to be indigenous to Africa and reflective of African identity. However, despite many positive insights in the on-going discussions, it is feared that the growth of bioethics in Africa lacks a clear direction. Some of the views threaten to distort the essence of bioethics and its development on the *** textThis paper presents some of the dominant views on African bioethics', an examination of which reveals some valuable insights into the direction bioethics in Africa ought to take, but at the same time confirms some methodological challenges in some contributions to the discussion. On top of acknowledging critical insights in the discussion, the paper reveals that some views are characterized by arbitrariness and rhetorical discussions based on a strong negative and yet hard-to-accept assumption;doubtful designation;lack of a clearer problem being addressed and consequently obscure question(s) and aim(s) of the discourse. Finally, some methodological insights are proposed to guide bioethics research and scholarship in Africa. Specifically, the paper proposes that in search for the legitimacy of bioethics in Africa, we ought to protect the essence of bioethics by giving considerable attention to the utility of subsequent bioethics. To achieve this we need to specify the problem and proper designation for the discourse;focus on principles qua principles with impartiality and how to ensure their strict implementation;and encourage critical thinking as part of *** cultivating bioethics in Africa, the pursuit of identity is legitimate but must be conditional in light of other competing considerations. We should focus on an objective search for bioethical princip