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关键词： 迷你植片   前房注射   人胚胎干细胞   角膜内皮样细胞   角膜内皮功能失代偿  

摘要： 研究目的外伤、手术、眼内炎等多种因素均可造成角膜内皮细胞的损伤或丧失,由于人角膜内皮细胞不能再生,内皮细胞的缺失超过其临界值时,将会导致角膜内皮功能失代偿,出现角膜水肿、视物模糊和眼部刺激等症状,严重者继发角膜溃疡。目前临床治疗主要依赖角膜移植,但角膜供体的缺乏严重限制了手术开展和患者复明。随着组织工程和细胞工程技术的不断发展,组织工程角膜的研究也取得一定进展,组织工程角膜内皮是当前研究的热点。人胚胎干细胞是组织工程角膜内皮种子细胞的理想来源,但目前存在诱导时间长、效率低、移植手术要求高、体内功能差、细胞存活期短等问题。本研究改良了角膜内皮细胞的移植方法,通过制备迷你植片进行前房注射;采用小分子维甲酸（retinoic acid,RA）、Y-27632和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESC）分化为角膜内皮样细胞,建立了hESC来源的角膜内皮样细胞定向分化体系;利用新西兰大白兔和食蟹猴角膜内皮失代偿动物模型,结合迷你植片前房注射移植方法,验证hESC来源的角膜内皮样细胞体内功能,为临床治疗角膜内皮功能失代偿提供新的策略和方法。研究方法1.角膜内皮迷你植片的制备和移植通过单细胞前房注射法与角膜后弹力层剥除内皮移植术（Descemet's Stripping Endothelial Keratoplasty,DSEK）行兔原代角膜内皮细胞（Rabbit Corneal Endothelial Cells,RCECs）移植,通过裂隙灯显微镜观察对比术后效果;利用不同的细胞消化酶（Accutase、胰蛋白酶-EDTA或Dispase）处理原代培养的兔角膜内皮细胞,通过对比植片大小、细胞存活率优化迷你植片制备条件;对比迷你植片与单细胞的贴附能力、细胞链接形成能力以及术后角膜透明度和厚度恢复情况。2.体外诱导hESC分化为角膜内皮样细胞hESC在mTeSRTM1培养基中培养传代,采用添加RA+bFGF的UM培养液诱导hESC向神经嵴细胞分化,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测,对hESC来源神经嵴细胞进行鉴定;采用添加Y-27632的DP培养液诱导分化为角膜内皮细胞,通过免疫荧光染色、流式细胞仪检测和PCR检测,对hESC来源的角膜内皮样细胞进行鉴定;通过NOD/SCID免疫缺陷鼠接种评估hESC来源的角膜内皮样细胞的安全性。***来源的角膜内皮样细胞移植功能鉴定将诱导的角膜内皮样细胞制备成迷你植片,通过前房注射法移植于新西兰大白兔右眼,以单纯刮除角膜内皮细胞的实验兔作为对照组。术后采用裂隙灯显微镜和超声测厚仪观察角膜及测量角膜厚度,比较两组角膜透明度和角膜厚度的恢复情况。使用活体共焦角膜显微镜扫描角膜中央区观察不同时间点移植细胞的形态。细胞移植术后不同时间点取材,通过免疫荧光染色观察移植细胞的紧密链接情况及内皮泵功能,利用地高辛标记细胞观察移植细胞的存活情况。同时采用迷你植片前房注射法移植于角膜内皮功能失代偿的食蟹猴模型,术后通过裂隙灯显微镜观察角膜透明度的恢复情况,采用超声测厚仪观察角膜厚度的变化情况,活体共焦角膜显微镜扫描角膜中央区观察移植内皮细胞的形态。诱导的角膜内皮样细胞移植术后取材行免疫荧光染色观察移植细胞在后弹力层的贴附存活情况及细胞紧密链接和内皮泵功能。研究结果1.角膜内皮细胞移植方法比较（1）单细胞前房注射法与DSEK法移植细胞的结果对比单细胞前房注射法与DSEK法行培养的兔原代角膜细胞移植术后角膜水肿消退的速度无明显差异。单细胞前房注射后角膜水肿逐渐消退,角膜恢复透明并维持稳定。DSEK法移植的角膜植片在术后早期有贴附不良现象,可见少量层间积液,角膜水肿消退后,植片可见部分混浊。（2）不同消化酶对兔原代角膜内皮细胞的影响Dispase消化能力过弱,细胞主要解离成大片状细胞植片。胰蛋白酶-EDTA消化能力过强,细胞迅速解离成单细胞。Accutase消化能力适中,细胞主要解离成含有4-10个细胞的细胞植片,并且随着消化时间的延长,植片形态变化不大。10分钟内Acutase或胰蛋白酶-EDTA对离体细胞消化损伤较小,细胞活力接近或超过90%,15分钟后两种消化酶解离的细胞存活率显著下降。（3）迷你植片移植动物实验迷你植片和单细胞悬液体外1小时及移植6小时后贴壁情况对比可见迷你植片组贴壁的细胞数目明显高于单细胞组。前房注射后48小时取材免疫荧光染色显示迷你植片组紧密链接蛋白ZO-1和内皮泵Na+/K+-ATPase表达量高于单细胞组。术后活体共焦角膜显微镜扫描显示迷你植片组术后7天角膜内皮细胞可见明显的六边形细胞形态,细胞之间链接紧密,而单细胞组术后7-21天之间细胞形态不规则,细胞

关键词： 新型制剂   热原检测   细菌内毒素   补充方法   方法学研究  

摘要： 目的:针对目前现有热原检查法缺点,建立基因工程细胞系检测微球和脂质体制剂中的内毒素含量的检测方法,为新型制剂中热原物质的质量控制提供补充检测方法。方法:对基因工程细胞系检测细菌内毒素含量进行精密度、准确度、专属性、线性和范围等方法学验证。并对3种微球和3种脂质体进行方法适用性研究。结果:精密度、准确度、专属性、线性和范围符合规定。干扰实验结果显示3种微球的回收率均在50%～200%; 3种脂质体的回收率均不在50%～200%。结论:基因工程细胞系法可以作为微球制剂的质量控制补充方法,脂质体制剂不能使用该方法检测。

关键词： 作物新品种   常规育种技术   分子育种技术   转基因作物   常规杂交育种   自然突变   育种周期   遗传资源  

摘要： 作物新品种的选育实质上就是创造变异和选择变异的过程,无论是自然诱发的变异还是人工创造的变异,均源于基因和重组基因突变.基因重组发生在同一种生物体内,由不同 DNA链的断裂和连接而产生基因的交换或重新组合,是常规杂交育种技术的理论基础.而基因突变则是 DNA 在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变,从而改变基因所包含的遗传信息,这是现代分子育种技术的理论基础.自然突变发生频率较低,具有随机性和不定向性,且通常是有害的,不能满足育种的需求;采用杂交、自交等常规育种技术存在育种周期长、效率低、遗传资源狭窄等问题;以转基因和基因编辑技术为代表的现代分子育种技术迅猛发展,逐渐成为选育作物新品种的重要途径.本文就这两项技术的原理、管理规则、检测方法和应用前景进行对比分析.

关键词： 胚胎干细胞   线粒体代谢   电子传递链   TTC19   CRISPR/Cas9  

摘要： 胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎的全能性细胞,它能够在体外无限制地增殖、分化,具有发育为完整个体的潜能。胚胎干细胞内表达Oct4、Sox2、Nanog等转录因子,这些调节因子形成了一个多能性调控网络,通过彼此调节表达水平来维持ESCs的多能性。线粒体代谢在干细胞命运决定中起着非常重要的作用,而我们前期的研究已经证明,线粒体稳态的维持对干细胞自我更新能力及多能性的维持起着非常关键的作用,但具体的调控机制还有待于进一步阐明。正常体细胞中,缺氧环境中线粒体靠糖酵解产生少量ATP,有氧条件下主要靠氧化磷酸化产生的ATP供能。而胚胎干细胞线粒体的供能方式及具体的机制还没有一个清晰的结论。复合体Ⅲ处于电子传递链的核心位置,它将复合体Ⅰ和复合体Ⅱ通过辅酶Q传递过来的电子继续向细胞色素c传递,同时将质子泵出线粒体内膜形成膜电势。TTC19作为线粒体复合体Ⅲ中一个重要的装配因子,对于复合体Ⅲ二聚体的形成至关重要,对线粒体电子传递与氧化磷酸化功能起关键的调控作用。我们以小鼠胚胎干细胞为研究对象,选取了线粒体复合体Ⅲ的装配因子TTC19作为靶标,来研究氧化磷酸化缺陷对于胚胎干细胞干性的维持有何影响。在本实验研究中,我们首先初步分析了小鼠胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中线粒体的功能。与体细胞相比,胚胎干细胞氧化磷酸化与ATP产生之间是低耦联的,但是也具有完整的线粒体功能。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对Ttc19基因的外显子作为靶序列在网站上设计gRNA,构建pX330-gRNA-Cas9质粒,利用核转染技术将质粒转染到小鼠ESCs中。经过检测切割效率,我们选择效率最高的gRNA相对应的质粒去构建Ttc19基因敲除的小鼠ES细胞系。挑选单克隆后扩大培养,当细胞数足够时收集部分细胞提取其基因组DNA,扩增需要检测的靶序列及其上下游共约700bp大小的DNA片段,进行TA克隆后挑取单菌落送去测序。根据测序结果,选择有且只有两种编辑结果所对应的细胞系,即为我们需要的Ttc19敲除细胞系,核型检测显示为正常的二倍体核型。通过与野生型ESCs在能量代谢上的比较,证明Ttc19敲除ESCs的线粒体氧化磷酸功能受到了明显的抑制,同时对构建好的Ttc19敲除的ES细胞系进行自我更新能力检测、检测多能性基因在转录水平和蛋白水平的表达,我们发现其多能性也较野生型明显降低。此结果表明,敲除Ttc19基因造成胚胎干细胞的氧化呼吸链的缺陷会使其多能性降低。本研究中成功构建Ttc19基因敲除的ES细胞系,为进一步研究线粒体功能与干细胞命运调控的机制提供了重要的细胞模型。

关键词： 人体细胞   重编程   人诱导多能干细胞   胚胎干细胞  

摘要： 目的:体细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell,iPSC)有多种体细胞来源,但不同体细胞来源iPSC在分子水平,转录调控水平有何差异仍不清楚。在此基础上本文首次建立了同一人不同体细胞来源诱导多能干细胞系,比较不同体细胞来源的iPSC在转录组水平上的差异,为后期iPSC在细胞治疗以及临床应用方面提供理论依据。方法:分别收集三个人的三种不同体细胞,分离纯化后将带有重编程因子质粒分别电转入尿液细胞、皮肤成纤维细胞及血细胞,重编程诱导培养基培养,待克隆长大挑取、纯化培养以及扩增,并鉴定其有效性与多能性,从而建立不同体细胞来源的iPSC细胞系。基于Illumina技术测序平台,利用双末端测序方法对细胞进行转录组测序分析,通过生物信息学及统计学方法分析细胞差异性基因表达,生物学功能,比较不同体细胞来源重编程过程中的分子调控机制,解析不同细胞重编程的分子机理,进而为揭示重编程的分子机制提供理论依据。结果:不同来源体细胞在电转染10-15天后观察到有类似胚胎干细胞形态的克隆形成,纯化扩增后细胞显示正常染色体核型、表达多能性标记物及多能性基因,畸胎瘤实验证明细胞具有体内分化为三胚层能力,从而建立了不同体细胞来源的人诱导多能干细胞系。转录组分析发现三种不同体细胞来源诱导的iPSC无显著性差异,原代细胞尿液细胞与皮肤成纤维细胞无显著性差异,而血细胞与皮肤成纤维细胞、尿液细胞具有明显差异。发现血细胞重编程与尿液细胞及皮肤成纤维细胞不同,进一步发现血细胞重编程中细胞粘附性明显上调。结论:通过非整合质粒转染成功将不同组织来源体细胞重编程为诱导多能干细胞,建立了同一个体不同体细胞来源的诱导多能干细胞系。证明了遗传背景对iPS细胞的产生无影响。在遗传背景相同情况下,血细胞重编程与尿液细胞及皮肤细胞重编程有明显差异,其中发现血细胞重编程后其粘附性明显上调。这就为后期细胞治疗,药物筛选及组织工程等临床应用使用何种细胞来源的人iPSC细胞提供更好的理论支持,从而加快干细胞的临床应用。

关键词： 胶质瘤干细胞   胚胎干细胞   KRAS   重编程   神经分化  

摘要： 神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤,其具有高度增殖和侵袭的特性,胶质瘤手术切除难度大,对放化疗不敏感且容易复发,严重危害人体健康。肿瘤干细胞与肿瘤细胞增殖、转移和耐药等密不可分,从胶质瘤干细胞角度研究肿瘤发病对其治疗靶点选择及预后评估意义重大,但目前尚缺乏可靠的细胞模型研究胶质瘤干细胞发生及肿瘤形成机制。利用细胞重编程技术可有效建立多种疾病模型用于发病机制及治疗相关研究。癌基因的激活、抑癌基因的失活可以驱动肿瘤的发生,此过程也涉及多种信号通路的调控异常,其中Ras/Raf/MAPK信号通路在胶质瘤发生中发挥重要作用。为了建立胶质瘤干细胞发生模型用于胶质瘤的发病机制研究,我们构建了Ras/Raf/MAPK信号通路上的关键基因EGFR、KRAS（G13D突变）、BRAF过表达和PTEN基因敲降表达的shRNA质粒载体,通过慢病毒感染的方式单独或组合转入胚胎干细胞（H1细胞）,建立了稳定的多种携带肿瘤相关基因的胚胎干细胞,包括H1-KRASG13D、H1-shPTEN、H1-KRASG13D-shPTEN、H1-BRAF-shPTEN、H1-BRAF-EGFR-shPTEN。通过诱导胚胎干细胞向神经方向分化,获得了携带肿瘤相关基因改变的神经干细胞（Neural progenitor cell,NPC）NPC-KRASG13D、NPC-KRASG13D-shPTEN、NPC-BRAF-shPTEN及NPC-BRAF-EGFR-shPTEN。通过荧光定量PCR、免疫荧光染色及免疫印迹方法检测,确认这些诱导产生的细胞表达神经干细胞特征性基因和蛋白并可进一步分化为神经元和胶质细胞。CCK-8细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验及细胞克隆形成实验检测结果显示,诱导产生的携带肿瘤相关基因的神经干细胞与H1细胞分化产生的正常神经干细胞（NPC-H1）相比具有更强的增殖及侵袭能力,其中以携带KRAS基因G13D突变的神经干细胞(NPC-KRASG13D)最为突出。我们通过转录组测序（RNA-seq）、生物信息学分析发现NPC-KRASG13D细胞的基因表达谱与NPC-H1细胞存在差别,而在调控细胞增殖、迁移、代谢等功能的基因方面呈现出与胶质瘤干细胞类似的表达谱特征。Seahorse和DCFH-DA代谢相关实验检测结果显示,NPC-KRASG13D细胞代谢能力显著增强。NPC-KRASG13D细胞移植至体内后表现出比NPC-H1细胞更强的增殖能力,并呈肿瘤性生长。上述实验证实了NPC-KRASG13D细胞具有胶质瘤干细胞样细胞特征,我们称其为诱导性胶质瘤干细胞（iGSCs）。综上所述,我们建立了一种多能干细胞来源的诱导性胶质瘤干细胞获取方法,初步构建了人胶质瘤干细胞的发生模型,本研究不仅为胶质瘤发生模型的构建开辟了新的途径,更对肿瘤的发病机制及靶向治疗研究具有重要意义。

关键词： 甲羟戊酸途径   甲羟戊酸   角鲨烯   聚异戊二烯   代谢工程   合成生物  

摘要： 类聚异戊二烯产物一类以焦磷酸异戊二烯酯聚合形成的聚合产物,类聚异戊二烯产物包括低聚产物和高聚产物,其都有很广泛的应用价值。低聚产物如角鲨烯作为保湿剂和润肤剂广泛用于化妆品中,并有多种促进健康的功能,包括抑制肿瘤,增强免疫力等作用。高聚产物如聚异戊二烯作为天然橡胶主要应用于制造轮胎、胶乳、胶鞋、胶带等。但目前两者在大量生产上都受到限制,因此开发类聚异戊二烯产物的合成生物方法具有重要的应用价值。本课题在合成生物学的基础上进行代谢工程的构建,主要是以大肠杆菌为宿主菌,构建甲羟戊酸途径(MVA pathway)的完整途径。通过微生物细胞来生产目标产物角鲨烯和聚异戊二烯。本课题主要工作:(1)甲羟戊酸菌株的优化。基于构建甲羟戊酸上游代谢途径pET28a-ES,将其酶切筛选后进行大肠杆菌为宿主菌的优化。首先对大肠杆菌宿主菌优化时选取了*** DH5α和*** BL21两种宿主菌进行比较优化,明确*** BL21对于甲羟戊酸代谢途径的适配性更好;然后发酵培养基选取了 LB培养基、M9培养基和X培养基三种培养基进行比较优化,经比较菌株在X培养基中发酵生长最佳。其中实验菌株BLES在X培养基中MVA的产量最高,达到1.25 g/L。最终选取BL21作为宿主菌并在X培养基中进行发酵。(2)构建角鲨烯的代谢途径。根据已优化的甲羟戊酸上游途径,构建下游途径来完善代谢通路,并对目标产物角鲨烯进行发酵检测产物。主要是以ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、fds为基础通过同尾酶的拼接连接到pET-22b的载体质粒上,形成基本的下游途径,即重组质粒pET22b-X。再添加来源于耶氏解脂酵母的ERG9,用于合成角鲨烯,即重组质粒pET22b-XQ。将 pET28a-ES 和 pET22b-XQ 共同转化到*** BL21 感受态中,得到角鲨烯工程菌株BLESXQ。发酵培养,对产物进行检测。测得产物角鲨烯,说明构建的角鲨烯代谢途径是可行的,且菌株BLESXQ在X培养基中产量明显达到最大值16.12 mg/L,同时进一步证明构建的甲羟戊酸的基本上下游途径在大肠杆菌中是可行的。(3)构建聚异戊二烯代谢途径。在上面构建pET22b-X的重组质粒的基础上添加来源于拟南芥的CPT和巴西橡胶树的SRPP,以形成目标代谢途径。得到两套聚异戊二烯代谢途径pET22b-XC重组质粒和pET22b-XS重组质粒。将两组重组质粒分别和pET28a-ES共同转化到*** BL21感受态中,得到聚异戊二烯工程菌株BLESXC和BLESXS,在菌株发酵验证产物,随后测CPT酶的酶活,没有检测到酶活和聚异戊二烯。说明CPT和SRPP基因所表达的酶并没有对聚异戊二烯的产生起到单独的作用。推测可能植物来源的酶与宿主不适配,可能缺少某种辅因子。

关键词： 生料制醋   高通量测序   真菌多样性   群落结构  

摘要： 在我国,传统食醋的酿造有着上千年的历史,最具代表性的就是被称为中国“四大名醋”的山西老陈醋、镇江香醋、福建永春老醋和四川保宁醋。随着传统食醋酿造工艺的不断发展与优化,食醋酿造技术也得到了很大的发展。20世纪70年代后期,北京、天津、山西等地的一些食醋生产企业开始生料制醋技术的研究以及生产。经过几十年的发展,生料酿醋取得了良好的效果。山西省长治市潞城市圣堂食品有限公司是一家专门以生料制醋工艺酿造食醋的企业。从该公司采集样品51份,包括原料、大曲、发酵缸样品(采集13个不同发酵时间点的样品)、淋醋样和熏醅样等共17组样品,每组3个平行样。本研究以这51份样品为研究对象,扩增nrDNA ITS区域并进行DNA高通量测序,分析生料制醋工艺流程中真菌多样性的变化。主要结果如下:(1)在原料中,酿酒酵母为优势物种(相对丰度为99.73%);在大曲中黑曲霉为优势物种(相对丰度98.86%);发酵缸各组样品群落结构组成大体相似,只是各物种在每组样品的相对丰度不同;熏醅和淋醋与其他样品的群落组成和物种丰富度都存在显著差异。(2)对发酵缸采集的样品做了真菌群落结构比较。样本层级聚类结果表明,发酵2、6、10、13天的所有样品聚为一支,属于发酵前期,而发酵17、22、26、29、32、35、39和46天的样品聚为一支,统称为发酵后期。发酵前期与后期真菌群落结构存在显著性差异(P值),尤其在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、未经分类的新球腔菌科(unclassified Davidiellaceae)、未分类的链格孢属(unclassified Alternaria)、红曲霉菌(Monascus purpureus)等至少9个物种中相对丰度存在显著差异。(3)发酵期真菌来源分析表明:在生料制醋发酵过程中,来自原料、大曲中的真菌数量占比分别为1.44%和2.26%,几乎全部为子囊菌门的真菌,但也存在很小比例的接合菌门和担子菌门的真菌;约94.6%的真菌来源未知,可能来源于发酵室或工人翻缸过程带入。(4)通过对翻缸(代表发酵缸底部的样品)与未翻缸(代表发酵缸顶部的样品)样品的样本层级聚类分析、群落Heatmap图分析和组间差异检验可知,发酵缸顶部和底部真菌群落结构几乎没有差异性。本研究所采集的51份样品涉及生料制醋的全过程,对其在门、纲、目、科、属、种分类学水平上进行了全面的研究,研究结果可反映实际生料制醋过程中真菌群落结构组成、变化及其多样性,为生料制醋技术的发展提供了一定的理论基础。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   Nanog   分化   Tbx3  

摘要： 小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell,mESCs）全能性和自我复制的维持依赖于核心转录因子Oct4,Sox2和Nanog等组成的调控网络。其中,Nanog在干细胞多能性与重编程中的作用及分子机制己经有了较为透彻的研究,但是其在分化中的调控机理仍然未知。因此,本文着重于探究Nanog调控小鼠胚胎干细胞分化的分子机制。为解决这一科学问题,本课题利用Nanog条件性敲除mESCs,通过拟胚体分化实验,证明Nanog缺失促使mESCs向中、内、外三胚层分化,但是干性相关的转录因子Tbx3表达却显著上调。Tbx3作为T-box家族的一员,,它在胚胎发育过程及干细胞维持中发挥着必不可少的作用,Tbx3的过表达能够促进细胞向中内胚层发育。为验证Nanog是否通过调控Tbx3的表达抑制mESCs分化,本研究利用CRISPR/Cas9系统在Nanog条件敲除细胞中对Tbx3进行敲除,发现Tbx3缺失能恢复Nanog敲除产生的分化异常表型;进而,我们通过ChIP-Seq和Luciferase实验鉴定Nanog结合Tbx3基因的几个潜在靶向位点;接着,利用ChIP-qPCR与CRISPR/dCas9系统,我们证实Nanog能够与Tbx3启动子区域结合,从而抑制Tbx3表达。总之,本文证明了 Nanog缺失的mESCs其干性仍能维持;Nanog通过结合在Tbx3基因的启动子区域下调Tbx3的表达,从而抑制mESCs向三胚层的分化。该研究有利于丰富核心转录因子Nanog调控小鼠胚胎干细胞分化的分子机理,为我们理解早期胚胎发育的过程及机制提供了理论依据。

关键词： 三角褐指藻   三磷酸甘油脱氢酶   脂肪酸   基因工程   甘油三酯  

摘要： 硅藻的模式生物三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)被认为是生物柴油的理想来源,但大体而言微藻生物质能源的工业化发展受限于产量及提取成本等因素。随着现代分子生物学技术的发展,我们可以对相应藻株进行基因水平的改造。本研究以前人发现的能高效提高三角褐指藻总脂和甘油产量的甘油三磷酸脱氢酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDH)为基础,通过蛋白序列分析对此酶在三角褐指藻中的两种亚型GPDH2和GPDH3,本研究通过分子生物学手段进行目的基因过表达、设计人工microRNA对两种亚型进行干扰来对其功能进行研究。通过成熟高效的遗传转化体系,成功获得GPDH2和GPDH3内源基因过表达工程藻株OEG2、OEG3;人工microRNA干扰藻株AMiG2和AMiG3。通过对这4种突变工程藻株的生理生化分析研究此基因两种亚型的功能。研究结果发现过表达GPDH2和GPDH3的藻株在对数期前期的生长速率与叶绿素a含量有明显提高,光合作用效率有轻微改变。两株GPDH2过表达突变工程藻中总脂含量分别降低25%、18%,甘油总产量分别提高27%、24%;两株GPDH3转化藻中脂质含量相比野生型提高114%、83%,甘油含量减少7%、5%;对比不同脂肪酸含量的变化发现,GPDH2对脂肪酸C14:0,C16:1固定有一定的偏好性,GPDH3则对脂肪酸C16:0含量的提高有较大的促进作用。研究结果初步阐明了三角褐指藻中GPDH2具有更强的甘油三磷酸酶活性,可诱导更多的三磷酸甘油脱磷产生甘油;GPDH3具有更强的脂肪酸固定作用,三磷酸甘油更多的偏向于结合脂肪酸先形成磷脂酸,最终合成甘油三酯以提高总脂含量。另外,通过人工microRNA干扰,特异性降低GPDH2和GPDH3转录表达后也取得了与上述研究相吻合的结果。本研究结果提升了对三角褐指藻的甘油三磷酸脱氢酶不同亚型功能的认知,同时也获得了性状优良的高产油脂、高生长速率的三角褐指藻工程藻株,为推动微藻资源高值化利用提供了理论依据和新的思路。