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关键词： 基因工程技术   应用成果  

摘要： 近年来,基因工程在理论研究与实际生产方面都取得了很大的成就,对社会和经济的发展都起到了很大的促进作用。同时,随着人们生活水平的提高,基因工程技术在现代生活中的应用也为人们提供了更加舒适的生活空间。本文主要浅析基因工程技术的研究成果及对人们生活的改善作用。

关键词： 胚胎干细胞   转座元件   表观遗传   细胞命运决定  

摘要： 转座元件是哺乳动物基因组内含量最多的元素。尽管转座元件的存在对基因组的稳定性具有潜在的危险，但它们同时还是潜在的基因调控序列、蛋白质编码序列和染色质结构序列，并参与物种进化过程。在早期胚胎发育过程中，染色质被重塑并激活大量的转座元件表达。因此，基因组中转座元件潜在的有害性和有益性保持着谨慎的平衡，并且这种平衡的控制是由表观遗传调控系统来执行的。以往对转座元件的具体表观遗传调控方式并不清楚，比如简单认为会被DNA甲基化或H3K9甲基化沉默，宏观上对它们的表观遗传调控模式和规律并不清楚。同时，也并不重视它们作为遗传信息在细胞分化等命运决定过程中的作用。本研究第一部分通过生物信息学方法系统性分析了小鼠胚胎干细胞中32种不同的表观遗传修饰数据，解析了小鼠胚胎干细胞中所有转座元件的表观遗传图谱，发现转座元件除部分已知的H3K9me3等异染色质标记修饰外，还有多种不同的表观遗传修饰调控模式，其中包括激活型的H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3以及H2BK20ac等。进一步根据该表观修饰图谱筛选到Rnf2、Ncor2、Kat5、Prmt5、Uhrf1和Rrp8等表观遗传因子参与了转座元件的转录调控，其中Rnf2、Brd7及Hdac5还可通过影响转座元件活性参与2细胞期细胞命运决定的调控。这部分工作揭示了小鼠胚胎干细胞中转座元件类型特异性的表观遗传调控方式。论文第二部分利用人胚胎干细胞往肝细胞分化为模型，发现了转座元件LTR6B在定型内胚层阶段特异性高表达，并通过顺式作用调控定型内胚层相关基因表达。进一步通过生物信息学分析发现人胚胎干细胞中LTR6B受DNA甲基化沉默，并且DNA去甲基化酶TETs负责定型内胚层分化过程中LTR6B的激活。这部分工作发现了体细胞分化过程中新的细胞命运调控元件及表观修饰调控机制。论文第三部分对一个全新的细胞命运转变模型进行了研究，该模型利用小分子化合物将小鼠上胚层干细胞(EpiSC)诱导为胚胎干细胞(ESC)状态，通过ATAC-seq以及单细胞转录组表达分析，发现转座元件RLTR13B2在ESCs及重编程分支中特异性被激活。机理上，我们发现转录因子TFAP2C可以直接结合到RLTR13B2上激活其表达，并证明Tfap2c对EpiSCs往ESCs细胞命运重编程所必需。这部分工作揭示了小分子化合物如何通过影响染色质状态、调控转座元件活性介导细胞命运转变。综合以上结果，本研究工作将对深入研究转座元件表观遗传调控、转座元件在细胞命运转变过程中的功能和机制具有重要指导意义。

关键词： 基因编辑技术   基因工程   高彩霞   中国科学院遗传与发育生物学研究所   农作物  

摘要： 植物生物学家,全世界最优秀的小麦基因工程专家2016年,英国《自然》杂志刊发"中国科学之星"的文章,对十位中国科学家进行了介绍,中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员因其采用基因编辑技术改进重要农作物的贡献入选。一开始,植物生物学家高彩霞对使用CRISPR–Cas9技术进行基因编辑有些犹豫。这一技术正在横扫全世界的生

关键词： 结核病   基因芯片   DNA测序   耐药基因   位点突变   治疗结局  

摘要： 研究背景与目的中国是全球30个结核病高负担国家之一,据WHO最新报告结果显示结核病估算新发病人数为88.9万,发病人数位于高负担国家的第二位。2017年,全球有近60万利福平耐药/耐多药患者(RR/MDR-TB),其中MDR-TB 45.7万例,MDR-TB已成为控制结核病流行的主要难点之一。根据WHO公布数据2017年中国估算新发MDR/RR-TB患者7.3万人,仅次于印度,位居全球第二,约占到全球估算总数的13.1%。但是我国的RR/MDR-TB患者登记数只有近1万人,仅占估算数的17%,在金砖五国中排末位,中国极低的MDR-TB发现率已成为MDR-TB疫情居高不下的关键因素。传统药敏耗时较长,灵敏度和时效性较差,严重影响了 MDR-TB的早期发现。为了提高耐药诊断速度,世界卫生组织2007-2015年陆续推荐了多种基因检测技术。基因芯片技术是基于多重PCR并结合反向杂交的耐多药基因检测试剂盒,该技术能根据检测位点的突变情况快速检测出利福平与异烟肼耐药结果,并判断结核分枝杆菌耐多药情况,既往研究显示该方法的灵敏度和特异度都很高。根据国家结核病“十三五”规划要求,全国将逐步推广MDR-TB快速诊断技术,2017年以来江苏省全面实施结核病分级诊疗综合防治服务模式,积极推广结核病新诊断技术,但是目前应用大样本痰标本直接评估基因芯片技术有效性和适用性的研究还很少。本研究收集大样本的涂片阳性患者的标本,以传统药物敏感结果为金标准,评估基因芯片技术在地市级结核病定点医院开展的效价性。2017年全球MDR/RR-TB患者平均治疗成功率为55%,而我国MDR/RR-TB患者治疗成功率仅为41%,在30个结核病高负担国家中居末位。MDR-TB患者极易在治疗中发生获得性耐药,引发对于喹诺酮类以及二线注射剂药物的进一步耐药,而标准耐多药治疗方案中又包含喹诺酮类药物与二线注射剂。全球9.7%的MDR-TB会进一步发展成为Pre-XDR-TB或XDR-TB。对于这些MDR-TB患者,临床医生一方面要监测与预防患者对其他药物发生耐药,另一方面,对于在治疗中获得性耐药的患者需要做到及时发现、变更治疗方案。国外研究发现耐药基因突变不仅可引发不同的耐药水平,甚至可以将耐药基因突变作为预测MDR-TB患者治疗结局的标志物。目前江苏省还未见报道过抗结核药物的耐药基因突变与MDR-TB患者治疗结局的关联研究。探寻分子层面的耐药基因突变对于治疗结局的影响将对于协助临床做出合理治疗决策有重要意义。研究方法研究对象为2014年1月至2016年7月在江苏省连云港市第四人民医院连续纳入的痰涂片阳性的结核病患者,对其开展利福平、异烟肼的固体培养与传统比例法药物敏感性试验,同时直接应用痰标本开展基因芯片检测,检测位点包括利福平耐药基因rpoB531、526、516、533、511、513的六个位点,异烟肼的耐药基位点katG315与InhA-15。以传统药敏试验结果为金标准,计算基因芯片在检测利福平、异烟肼方面的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值以及一致率。2013-2014年在江苏省的连云港市、镇江市、南通市、泰州市、常州市连续纳入具有完整治疗记录的MDR-TB患者,并随访调查获取MDR-TB患者治疗结局的资料(见附录)。对耐多药患者进行利福平、异烟肼、氧氟沙星和卡那霉素的传统药敏试验。在开始标准耐多药方案治疗前,提取MDR-TB患者核酸并进行DNA测序,测序的耐药基因主要包括一线抗结核药物利福平的耐药基因rpoB相关突变位点、异烟肼的耐药基因katG和InhA启动子区域、吡嗪酰胺的耐药基因pncA、rpsA、二线抗结核药物喹诺酮类药物耐药基因gyrA和gyrB、以及二线注射剂药物耐药基因rrs基因和eis启动子区域。应用DNA测序比对软件ApE将测序结果与标准菌株H37RV的碱基序列比对,在EXCEL中整理各耐药基因在相关位点的突变频率与突变类型。最后将所有数据导入spss25.0中,应用卡方检验、多因素logistics回归分析方法探索耐多药结核病患者治疗结局的影响因素。研究结果在同时开展传统药敏试验与基因芯片检测的1297涂片阳性患者中,最终共有1100例纳入最终的基因芯片诊断价值的研究中。以传统药敏为金标准,基因芯片技术诊断利福平耐药的灵敏度与特异度分别为84.48%,98.18%,一致率为97.45%,阳性预测值与阴性预测值分别为72.06%,99.13%;基因芯片技术诊断异烟肼耐药性的灵敏度与特异度分别为81.91%,97.42%,一致率为96.09%,阳性预测值与阴性预测值分别为74.76%,98.29%。基因芯片技术诊断MDR-TB的灵敏度为80.56%,特异度为99.15%,一致率为98.55%,阳性预测值与阴性预测值分别为76.32%,99.34%。

关键词： 木薯   马铃薯   基因工程   MechlPPDK基因  

摘要： 马铃薯是继水稻和小麦之后世界第三大粮食作物,随着世界人口增长、耕地面积以及可利用资源减少,培育具有优良性状的马铃薯是马铃薯育种的重要目标。木薯是具有高光合的C3、C4中间型典型热带作物,其叶绿体型丙酮酸磷酸双激酶MechlPPDK(EC 2.***.1.40)基因是C4代谢途径碳固定的限速酶,它对木薯的生长发育起着重要作用。将MechlPPDK导入C3型马铃薯对评价马铃薯生物积累的影响和创制新种质具有理论和实用价值,同时可以验证该基因的功能。本研究将木薯中的MechlPPDK基因通过农杆菌介导转化马铃薯,使其在马铃薯中过表达,获得9个阳性株系。第一季挑取了其中6个株系种植,第二季挑取了第一季中3个性状显著株系进行种植,研究结果如下:1、提取4-6、4-8和4-9株系的总DNA进行Southern-blot检测,结果显示均有杂交信号,说明目的基因MechlPPDK成功整合到马铃薯基因组上,其中4-8株系是单拷贝插入,4-6和4-9株系是双拷贝插入。2、MechlPPDK基因在马铃薯块茎中表达,株系4-8和4-9块茎薯型显著变长、芽眼数增多、单株结薯数量显著,但是其产量变异不显著,干重率和淀粉含量略低,与野生型比较未达到显著水平。3、转基因株系4-8和4-9休眠期短且芽眼发芽能力强于野生型。两个株系在发育早期叶片叶绿素含量和净光合速率略高于野生型,但未达到显著水平。4、MechlPPDK基因在马铃薯块茎中表达,导致4-8和4-9株系块茎蔗糖含量增加,还原糖含量与野生型相比无显著差异。5、相对定量PCR表达分析表明,MechlPPDK基因在转基因株系叶片中都有较高表达,野生型中无表达。株系4-8和4-9中MechlPPDK基因在块茎具有较高表达,分别为管家基因EF1α的0.053、0.11倍,野生型无表达,其他转基因株系表达量不高。本研究将木薯MechlPPDK基因转入马铃薯基因组中获得具有优良性状的马铃薯新种质,同时验证了该基因的功能。

关键词： 小麦   叶酸   花青素   生物强化   遗传转化  

摘要： 世界上很多人正在遭受营养不良的困扰,而谷类和块茎类作物无法提供所有类型的必需的营养物质。为了解决这一问题,人们尝试了多种方法,比如营养添加剂、食品营养强化和粮食作物生物强化。小麦作为“谷物之王”,是谷物中非常重要的粮食作物,并被认为是全球粮食安全的关键作物。因此,小麦具有很大的生物强化潜力。叶酸是维持细胞功能的基本要素,包括植物在内的许多生物可以自己合成叶酸。人类与其他脊椎动物一样,靠食物来摄入叶酸,并常因叶酸摄入不足而患上许多疾病。花青素是高等植物合成的次生代谢产物,负责花和果实的着色,也用作常规和分子育种中的可见标记。植物源的花青素也很重要,花青素具有抗炎、抗癌活性,所以摄入花青素可以预防冠心病。MYB和bHLH转录因子参与到花青素生物合成途径中,并与WD40蛋白形成一个三元复合物调控花青素合成通路中的结构基因。在本研究中,我们评估了中国不同的小麦种质,探索不同小麦种质中叶酸含量的自然变化。此外,通过代谢工程对小麦籽粒进行生物强化以获得高叶酸含量。首先,将参与叶酸前体蝶呤和对氨基苯甲酸合成的大豆基因GmGCHI(GTP cyclohydrolase I)和GmADCS(aminodeoxychorismate synthase)分别在胚乳启动子水稻GluC和玉米Leg1A的控制下在小麦中表达。另外,将大豆密码子优化的GmGCHI和番茄LeADCS基因在小麦胚乳特异性谷蛋白(1Dx5)启动子控制下共转化小麦。同时,在小麦中分别表达和共表达玉米MYB和bHLH,评估这些基因在小麦中的功能。主要研究结果如下:1.利用HPLC-MS/MS测定了360份小麦样品(包含315个小麦品种)的叶酸含量,发现小麦品种间叶酸含量的差异为10.15±2.86～91.44±5.64μg/100 g。河农58-3等52个小麦品种叶酸含量较高,超过50μg/100 g,是小麦高叶酸含量育种的理想资源。同时发现,环境因素对小麦中叶酸含量有很大影响,如良星66在石家庄、北京和郑州每100克籽粒中叶酸含量分别为36.9、29.4和57.5μg,石4185在石家庄、北京和郑州每100克籽粒中的叶酸含量分别为20.4、28.3和41.5μg。2.发现在小麦籽粒中叶酸主要以5-甲酰基四水合物(5-CHO-THF)和5-甲基四氢叶酸(5-CH3-THF)的形式存在,占叶酸总量的50%以上。3.为了提高小麦植株的叶酸含量,利用农杆菌转化法在小麦中过表达2个与叶酸合成相关的大豆基因GmGCHI和GmADCS,发现转基因小麦籽粒中叶酸含量为65μg/100 g,相比受体对照的28μg/100 g提高了2.3倍。4.进一步利用农杆菌转化法将大豆密码子优化的GmGCHI基因和番茄LeADCS基因在小麦中表达,发现转基因小麦籽粒中叶酸含量为127μg/100 g,相比受体对照的23μg/100 g提高了5.6倍。5.利用农杆菌转化法将玉米ZmC1(MYB-C1)和ZmR(bHLH R)基因转入小麦,发现ZmC1和ZmR在转基因植株中以组织特异性方式调控花青素的生物合成。6.过表达ZmC1和ZmR的小麦转基因植株在叶、茎、叶耳、小穗和籽粒等几乎所有组织都显示高色素沉积;过表达ZmC1的小麦转基因植株在胚芽鞘、叶耳和茎中显示色素沉积,表明ZmC1调控营养组织中的色素沉积;表达ZmR基因的小麦转基因植株在籽粒中显示出高色素沉积,表明ZmR调控籽粒中的色素沉积;在表达ZmC1和ZmR的转基因小麦植株中花青素含量达到了6.51 mg/kg。7.利用qRT-PCR技术分析了转基因植株中ZmC1和ZmR、2个小麦同源基因(TaC1和TaR)、6个花青素合成相关基因(TaCHS、TaCHI、TaF3H、TaF3'H、TaDFR和TaANS)的表达水平,发现它们在转基因小麦植株中都显著上调表达。

关键词： 鹿茸干细胞   胚胎干细胞   呋虫胺   新烟碱类农药  

摘要： 植保所为解决蜜蜂生态毒性难题提供新思路近日,中国农业科学院植物保护研究所农药残留与环境行为研究组及昆虫功能基因研究组,联合从手性对映体水平阐明了新烟碱杀虫剂呋虫胺,对意大利蜜蜂的致毒机理及其立体选择性差异分子机制,研究成果为解决新烟碱类农药对蜜蜂生态毒性的难题提供了新思路。相关研究成果在线发表在《环境国际(Environment International)》上。新烟碱类农药是全球用量最大的杀虫剂品种,对全球重要媒介昆虫蜜蜂的高毒问题日益凸显,成为威胁全球农

关键词： 桃   mtDNA提取   叶片愈伤组织   高通量测序  

摘要： 线粒体为植物体内各项生命活动提供能量,其DNA编码植物体内一些重要酶类和蛋白质。提取高质量的线粒体DNA是线粒体基因组测序的重要前提。本研究以‘21世纪’、‘珲春’、‘早霞露’、‘中华寿桃’、‘Mafirm’、‘瑞光21’6个品种的桃叶片作为外植体,24℃完全避光条件下进行了愈伤组织诱导及增殖。并以获得的‘21世纪’桃愈伤组织为材料,通过匀浆化处理、差速离心和蔗糖衬垫等操作提取并纯化线粒体、利用SDS裂解法等方法提取并纯化mtDNA,最终获得了满足测序要求的‘21世纪’桃mtDNA,建立了一套适合桃的简便快速高效的mtDNA提取技术体系,丰富了蔷薇科果树mtDNA提取的研究。对‘21世纪’桃线粒体基因组进行了测序,初步分析了桃线粒体基因组的特点和基因的功能,为后续开展更广泛、更深入的研究奠定了基础。主要结果如下:***培养基中同时添加6-BA和2,4-D可显著提高6个桃品种愈伤组织的诱导率,缩短诱导时间。当6-BA浓度达到3 mg/L时,诱导率可达到100%,愈伤组织的生长情况良好。最佳愈伤组织诱导培养基为MS+3.0 mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D。2.荧光显微镜检测显示本研究提取的线粒体完整且具有活性。电泳检测显示桃mtDNA条带大小约为23 kb,无降解。核酸纯度分析表明提取的mtDNA无RNA和蛋白质污染。特异性基因PCR检测表明本试验提取出的mtDNA无核DNA和叶绿体DNA的污染,其纯度可满足测序要求。3.线粒体基因组测序结果显示‘21世纪’桃线粒体基因组平均GC含量为59.33%。共测得基因40个。GO功能显著性富集分析表明线粒体基因组中40个基因比对到3类生物功能下的22个亚分组,包括5个分子功能亚分组、7个细胞构成组分亚分组以及10个生物学过程亚分组,其中参与的主要生物功能有细胞进程、代谢过程、结合功能和催化活性。

关键词： 基因治疗   动物医学   应用   治疗作用   基因工程   细胞  

摘要： 借助基因治疗方法,能够将发挥治疗作用的基因或是借助相应的操作将其导进靶细胞,从而可以对基因所存在的缺陷予以纠正,其所发挥的作用是有目共睹的.第一例成功的基因治疗案例发生于 1990 年,这使得基因工程治疗从理想变为现实,而且现阶段的基因治疗受到的关注程度在不断提高.

关键词： 炎症性肠病   人孤雌胚胎干细胞   诱导分化   限定性内胚层   肠上皮干细胞  

摘要： 背景:炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组肠道炎症疾病,病程迁延反复,严重影响了患者的生活质量。IBD的发病机制还没有彻底研究清楚,目前认为由多因素之间相互作用造成的,主要包括环境、感染、遗传、免疫等因素。IBD是当今临床治疗的一个重大医学难题,目前仍然缺乏有效的治疗措施。随着再生医学的兴起,干细胞疗法起着越来越重要的作用。人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)在分化能力上和胚胎干细胞类似,具有分化的全能性,且避免了伦理道德的争议,在IBD的治疗中有着很大的潜力。本实验研究的是人孤雌胚胎干细胞向肠上皮干细胞(intestinal epithelial stem cells,IESCs)分化的过程。目的:对hPESCs体外定向诱导分化为IESCs的可行性进行初步探索,为IBD患者提供一条更加切实可行的治疗手段。方法:1)建立hPESCs/MEF、hPESCs/hFF、hPESCs/3T3-L1三种体外培养体系,通过形态学观察和碱性磷酸酶法检测hPESCs能否稳定生长并保持未分化状态。2)使用诱导因子Activin A诱导hPESCs向限定性内胚层(definitive endoderm,DE)分化。通过检测Sox17、Gsc和E-Cad的表达来判断诱导细胞是否转化为DE。3)使用表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导DE向IESCs分化。通过检测Musashi1和Hes1的表达来判断诱导DE细胞是否转化为IESCs。结果:1)hPESCs在hPESCs/MEF、hPESCs/hFF、hPESCs/3T3-L1三种培养体系中生长状态良好。在经过超过60代的体外培养之后,仍能保持未分化的状态。2)DE标记物Sox17、Gsc和E-Cad在诱导组的表达显著高于对照组,在第4d的表达量达到峰值。3)IESCs标记物Musashi1和Hes1在诱导组的表达量显著高对照组,在第5d的表达量达到了峰值。结论:1)hPESCs/MEF、hPESCs/hFF、hPESCs/3T3-L1三种培养体系可有效扩增hPESCs并维持其未分化状态。2)Activin A可成功诱导hPESCs分化DE。3)EGF可成功诱导DE分化为IESCs。4)经分阶段诱导法,成功将hPESCs向IESCs发生分化。