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关键词： 转基因作物   转基因作物产业化   转基因作物检测   风险预防原则   社会中间层主体   基因污染检测  

摘要： 转基因作物的检测贯穿于转基因作物产业化的全过程,在转基因作物产业化中具有基础性的重要作用,有利于对转基因作物产业化中的风险进行预防和救济。然而,现有转基因作物产业化中的检测法律规范较为零散、缺乏长远性和系统性的制度构建,在立法、执法与司法方面均存在较多法律问题,不利于我国转基因作物产业化的顺利推进。《“十三五”国家科技创新规划》中明确表示,“十三五”期间要推进新型抗虫棉、抗虫玉米、抗除草剂大豆等转基因作物的产业化。在这样的背景之下,我们应对与转基因作物检测有关的法律规范和转基因作物检测中所可能产生的法律关系进行全面的重新审视,找出法律问题并加以解决,以求发挥出转基因作物检测在转基因作物产业化中应有的积极作用。本研究首先对“转基因作物检测”、“转基因作物产业化”等相关概念从写作目的等角度进行了讨论、辨析和界定,揭示了转基因作物产业化中检测的应然功能,介绍了转基因作物产业化中检测法律问题解决的基本理论。其次,通过规范分析法梳理了转基因作物产业化中检测的立法现状,并对其运行现状进行了介绍;运用经济法学等法学学科中的基本原理和学术理论对转基因作物产业化中的检测法律问题进行分析,并进行了类型化的归纳与概括,最后指出我国转基因作物产业化中的法律问题涉及立法、执法与司法三个方面。再次,结合域外实践与经验,对我国转基因作物产业化中检测法律问题的解决进行制度化的思考和探讨。提出了转基因作物产业化中检测法律问题制度化解决的基本原则、基本制度和运行保障制度。最后,试图通过立法与修法途径对转基因作物产业化中的检测问题加以解决。提出应将转基因作物检测相关法律法规放在生物安全法的大法律框架中进行统筹考量,并建议先修改部分相关法律规范与法律制度。

关键词： 基因工程能源微藻   原始小球藻   废弃糖蜜   油脂产率   生物柴油  

摘要： 随着全球经济社会快速发展,以化石燃料为主的传统能源利用排放了大量温室气体,导致全球变暖、海平面上升、环境污染加剧及化石资源枯竭等严重能源环境问题,使得寻找清洁有效的可持续替代能源成为人类发展进程中亟待解决的重大难题。而第三代生物燃料中的能源微藻,由于生长繁殖快速、生存能力强以及土地需求量少,已成为制备生物柴油及相关能源产品的重要原料,有望成为化石燃料的可持续有效替代方案之一。为此,本课题基于目前能源微藻及其生物柴油的研究现状,拟从上游微藻菌株筛选改造出发,重点研究所选基因工程能源微藻的中游培养工艺,旨在通过培养条件调控优化其生物量以及油脂产率,并初步预测分析下游合成生物柴油的品质,以期为能源微藻的商业化提供技术支撑。在实验室前期研究基础上,筛选出较原始菌株生物量提高25.26%和油脂产率提高36.28%的基因工程小球藻作为主要研究对象,在SE(Selenite Enrichment Solution)原始异养培养基的基础上进行响应面优化设计分析,优化后其生物量达1.40±0.02 g/L、油脂产率达32.23±0.24 mg/L/d,较SE原始培养条件分别提高了35.48%和56.43%。为实现低培养成本下的高油脂产出,选用价格低廉且含糖量较高的制糖工业废弃糖蜜替代精制葡萄糖碳源进行可行性研究,经葡萄糖为碳源的SE对照培养基(GC)、废弃糖蜜水解液与SE混合的完全培养基(MHC)、废弃糖蜜水解液与不含氮源的SE混合培养基(MHNL)、废弃糖蜜水解液直接培养基(MHD)和废弃糖蜜直接培养基(MD)下的培养对比,筛选出生物量和油脂产率最高的MHNL异养培养条件作为有效平价替代策略,并在此基础上进一步进行系统响应面优化。在MHNL优化培养条件下其生物量达2.34±0.06g/L;油脂产率达59.34±1.13mg/L/d,较MHNL原始培养条件高出58.98%,较GC对照培养条件高出132.81%,且较此前的SE优化培养条件高出78.60%,为本课题研究中的最优经济化替代方案。

摘要： "Review of John McMillan, The Methods of Bioethics: An Essay in Meta-Bioethics."The American Journal of Bioethics, 19(7), pp. W4–W5

关键词： 柠檬酸   黑曲霉   基因工程  

摘要： 柠檬酸因其独特的酸爽口味和安全无毒的特性,在食品行业颇受亲睐。不仅如此,柠檬酸在医药、化妆品、化工等领域的应用也颇为广泛,是世界上消耗量最大的有机酸。我国柠檬酸原料来源丰富,生产前景较好,目前已成为世界上柠檬酸最大的生产国和出口国。柠檬酸生产的主要方法是利用黑曲霉液体深层发酵,虽然目前柠檬酸发酵滴度和糖酸转化率均达到较高水平,但是仍有进一步提升空间。因此,构建黑曲霉发酵高产柠檬酸工程菌种显得尤为重要。本文以黑曲霉ATCC1015为初始菌株,利用分子生物学的手段,通过分析三羧酸循环中草酰乙酸水解酶基因（oahA）,苹果酸脱氢酶基因（cmdh）,丙酮酸羧化酶基因（cpyc）,富马酸酶基因（fumr）,富马酸还原酶基因（frds）以及EMP途径中的磷酸果糖激酶基因（pfk）对柠檬酸合成的影响,从而构建柠檬酸高产菌株。主要研究结果如下:（1）以实验室构建的表达质粒pLH454为出发载体构建了pfk、fumr、frds的表达载体。（2）农杆菌介导黑曲霉转化,获得oahA敲除菌作为出发菌株,然后分别构建了pfk、fumr、frds、mdh、pyc等过表达菌株。（3）通过摇瓶发酵分析柠檬酸产量,发现单独过表达了pfk、fumr、frds、mdh和pyc基因的过表达菌株与出发菌株相比其产量提高分别为4.16%、4.89%、4.98%、1.17%和1.03%;双过表达fumr和frds基因的菌株比出发菌株提高了 6.13%。（4）提取RNA分析过表达基因的转录情况,异源表达的fumr和frds在黑曲霉中都实现了表达;pfk、mdh以及pyc基因的表达量与出发菌株相比都有不同程度的提高,其中pfk的表达量提高最多为出发菌株S549的3.03倍,mdh和pyc的表达量则分别为出发菌株2.42倍和1.28倍。（5）通过酶学分析发现,与出发菌株S549相比,过表达pfk的菌株S642、过表达mdh的菌株S703、过表达pyc的菌株S706其酶活与出发菌株相比分别提高了1.23、1.59 和 1.34 倍。

关键词： 胚胎干细胞   无血清培养基   微载体   动态悬浮培养  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有自我更新和多向分化潜能,在科学研究和临床医学领域具有巨大的应用前景,但要实现其实际应用价值必须克服干细胞数量稀少的瓶颈问题,因此,亟需建立高效、可控的ESCs培养过程。为此,本文以鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,mESCs)为研究对象,首先考察了饲养层的制备方法、血清对mESCs扩增特性的影响。结果发现:采用丝裂霉素处理制备的饲养层支持mESCs扩增效果优于固定化饲养层;采用明胶代替饲养层同样能支持mESCs稳定扩增并维持未分化状态;培养基血清浓度达5%既能支持mESCs的扩增也能使其维持未分化状态,据此建立了以明胶为饲养层、血清替代物代替血清的mESCs的无血清培养体系,该体系中mESCs的扩增倍数可达到2.95±0.5倍,SSEA-1+细胞比例在80%以上。在此基础上,分别考察了GSK3、MEK及FGFR抑制剂三类小分子化合物种类及相互作用对mESCs扩增及全能性维持的影响。结果发现:与对照组相比,GSK3抑制剂(BIO及SB-216763)都能促进总细胞增殖,但会明显降低SSEA-1+细胞的比例;MEK和FGFR抑制剂均有利于mESCs的扩增;GSK3抑制剂SB-216763与MEK抑制剂(PD184352、PD0325901)或FGFR抑制剂(SU5402)中的一种或二种组合均可以促进mESCs的扩增;特别是SB-216763+PD0325901+SU5402组合不仅能促进总细胞扩增,还能显著提高SSEA-1+细胞比例,培养3代后总细胞扩增倍数和SSEA-1+细胞的比例可达318.78±47.95和80%以上明显高于对照组的38.89±18.44和70%左右(p<0.05)。其次,采用转瓶在无血清培养体系中考察了mESCs在Cytodex3微载体上的扩增特性,培养到第5天时mESCs扩增倍数最大可达到31.68±7.74倍明显高于静态培养时的17.92±9.80(p<0.05),SSEA-1+细胞比例在85%以上,且AKP染色及Oct4免疫荧光染色均呈阳性,实现了mESCs无血清无饲养层的动态悬浮培养。以上研究结果为胚胎干细胞的规模化制备技术的开发提供了依据。

关键词： 恒温扩增   LAMP   RPA   快速PCR   DNA分子计数  

摘要： 核酸扩增检测技术通过对模板分子进行百万倍扩增来实现对核酸的高灵敏检测,在食品安全检测领域发挥着重要作用。但目前的核酸扩增检测技术主要局限于实验室应用,不适用于现场快速检测。本课题以食源性致病菌和转基因作物为研究对象,从核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个方面展开研究,开发了快速、简便、可视化的检测方法用于食品安全快速检测,并且开发了可视化的DNA分子计数方法对样本中的模板分子进行计数。主要研究内容及结果如下:(1)本课题采用环介导恒温扩增和基于磷酸根的可视化检测方法对加标对虾样本中的副溶血性弧菌进行快速检测。首先,采用棉签擦拭加标对虾样本进行取样;然后,采用NaOH溶液对获得的样本进行快速细胞裂解,并将细胞裂解液稀释10倍后直接作为模板进行LAMP扩增;最后采用磷酸根比色法对扩增结果进行可视化检测。结果显示,该可视化检测方法对纯培养的副溶血性弧菌的检测限为2.63×10 CFU/mL,对加标对虾样本中的副溶血性弧菌的检测限为3.00×10 CFU/g。采用传统菌落培养计数法做为标准对照,对151个对虾样本进行可视化检测。结果显示可视化检测方法对加标对虾样本的阳性检出率为94.7%(143/151),检测特异性和灵敏度分别为100%(65/65)和90.7%(78/86)。该方法可在1小时内完成从样本获取到结果输出的整个过程,避免了取样过程中的样本交叉污染问题,仅需一个简单的热块即可完成检测,在食源性致病菌的快速检测中展现出巨大应用潜力。(2)为了进一步缩短检测时间,本课题探究了一种交叉引物恒温扩增的加速剂——普鲁兰多糖。结果显示,1%(w/v)工作浓度的普鲁兰多糖对CPA扩增的加速作用最为明显,可使CPA扩增提速7 min左右,使扩增到达阈值的时间缩短三分之一。将普鲁兰多糖作为CPA扩增的加速剂并采用试纸条对扩增产物进行检测,可在20 min内完成对转基因大米DNA的检测。为了避免试纸条检测中由开盖操作引发的扩增子气溶胶污染问题,本课题开发了三种类型的密闭性、便携式、防污染试纸条装置。在核酸扩增完成后,通过简单的摇动或按压操作使反应液与试纸条接触,从而完成试纸条对扩增产物的检测。将普鲁兰多糖作为CPA扩增的加速剂并与试纸条终点检测相结合,可实现对样本的快速、高灵敏、特异性检测。开发的试纸条防污染装置使核酸扩增和检测在密闭空间内进行,从源头上避免了扩增子交叉污染问题。(3)为了进一步缩短检测时间和减少对仪器的使用,本课题开发了一种简便、快速、可视化的检测方法用于现场筛选GTS 40-3-2转基因大豆。该方法以非纯化的DNA为模板,采用体温孵育的方式进行重组酶聚合酶扩增。扩增完成后向扩增产物中加入SYBR Green I染料并对检测结果进行肉眼观察。该方法无需加热设备,仅需一个迷你紫外手电筒即可完成检测,并且从样本获取到结果输出的整个过程可在10 min内完成。该方法具有很高的检测灵敏度和特异性,并且对不同长度的引物(220 bp)、非纯化的DNA模板和不同的反应温度(300°C)展现出强健的鲁棒性。20名志愿者在不同环境温度下采用该方法对GTS40-3-2转基因大豆进行了筛选,结果显示阳性样本的检出率为100%。该体温触发的RPA扩增及可视化检测方法耗时短、灵敏度高、鲁棒性强、无需加热设备即可实现,适用于对转基因作物的现场快速筛查。(4)为了实现对DNA模板的快速计数,本课题开发了一种简便的方法,无需任何DNA分子预修饰或预分离过程,可在几分钟内通过读取扩增子荧光簇的个数得到样本中DNA分子的数目。该方法基于细柔性塑料管的快速热传导效应及扩增子在细柔性塑料管内极弱的对流和扩散效应。通过采用自主设计的自动化PCR装置将含有扩增样本的细柔性塑料管在两个不同温度的水浴间穿梭,可在5 min内完成快速PCR扩增。扩增子与预先加入体系的荧光染料结合,在紫外灯照射下呈现出明亮的荧光簇。通过用肉眼观察计数扩增子荧光簇的个数可得到每个样本中初始加入的DNA分子数目。通过分析扩增子荧光簇在细柔性塑料管中的扩散过程,我们提出了快速PCR扩增过程中的DNA分子扩增-扩散模型。该可视化DNA计数方法直接、快速、易于实现,无需借助任何微流控设备和精密光学设备,为DNA分子快速计数提供了新方法,并且为单分子检测提供了新思路。

关键词： 肝癌   发病机制   氧化应激   不对称二甲基精氨酸水解酶  

摘要： 肝癌是全球最常见消化系统肿瘤之一，成因复杂、生存率极低，其治疗一直都是世界难题。越来越多的证据表明，氧化应激在肝癌的发生发展过程中起到了不可忽视的作用。线粒体功能障碍和高活性氧与肝癌具有很好的相关性。研究如何调控和干预肝癌的氧化应激水平，对于治疗肝癌具有重要的意义。　　不对称二甲基精氨酸水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase1，DDAH1)能够把不对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine，ADMA)代谢成瓜氨酸，从而提高内源一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)的活性。有研究表明，ADMA/DDAH1/NO通路参与了细胞氧化还原状态的调节和肿瘤血管的发生，然而DDAH1能否在肝癌的发生和发展中起到调控作用还没有研究。在本论文中，我们首先发现，和人正常肝细胞系L02相比，人肝癌细胞系HepG2具有更高的DDAH1蛋白表达。在HepG2中过表达DDAH1能够减少细胞内活性氧水平，缓解叔丁基过氧化氢诱导的细胞死亡，而敲低DDAH1对细胞内活性氧和细胞存活的作用则相反。为了进一步探索DDAH1的功能，我们通过免疫共沉淀、SDS串联质谱和双分子荧光等技术手段，发现DDAH1可以通过其1个α螺旋和4个B折叠结构与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)发生相互作用并能影响其活性和在细胞内的分布。　　为了研究DDAH1在肝癌发生中的作用，我们利用连续注射二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)的方式在对照C57BL6小鼠和DDAH1转基因小鼠中建立了肝癌模型。我们发现，DDAH1在DEN处理小鼠肝脏中的表达显著降低，而过表达DDAH1能够缓解DEN诱导的肝癌的分子标记、肝功能异常，肝脏纤维化，炎症反应和氧化应激，表明DDAH1能够缓解肝癌的发生发展。　　我们的实验结果显示，DDAH1在肝癌的发生发展中起着重要作用，这些作用不仅和降解ADMA有关，还可能和调节细胞氧化还原状态以及与GAPDH的蛋白相互作用有关。

关键词： CSPR2BP   人胚胎干细胞   滋养细胞   细胞凋亡  

摘要： 目的:研究组蛋白乙酰化转移酶CSRP2BP对人胚胎干细胞向滋养层细胞诱导分化的影响,寻找CSRP2BP与滋养细胞引起的妊娠相关疾病的相关性。同时结合基因芯片检测结果,探究CSRP2BP对H1细胞凋亡的影响机制。方法:利用慢病毒转染的方式构建沉默CSRP2BP的H1细胞株,将其向滋养层细胞进行定向诱导,观察细胞形态的变化情况;采用免疫荧光、细胞上清液HCG含量检测、q-PCR的方法对比沉默CSRP2BP的H1细胞和对照组两组细胞向滋养层细胞分化的情况,分析沉默CSRP2BP具体影响H1细胞向哪种类型的滋养细胞分化。利用基因表达芯片技术,分析沉默CSRP2BP后H1细胞基因表达谱的变化,筛选出沉默内源性CSRP2BP与凋亡相关的基因及其可能的靶基因。利用流式细胞检测的验证沉默CSRP2BP的H1细胞的细胞凋亡情况。结果:成功构建两株沉默CSRP2BP的H1细胞,在诱导第3天时细胞形态发生细胞滋养层细胞样改变,随着诱导时间的延长,滋养层样细胞形态越明显,沉默对照组在第6天时出现明显滋养层样细胞,沉默组在第9天时出现明显滋养层样细胞。滋养细胞分泌的特殊物质HCG在诱导第9天时检测结果示,检测到对照组H1shbpCON上清液中的HCG值为1320.71 mIU/ml;实验组H1shbp1#2上清液中的HCG值为12.62 mIU/ml;实验组H1shbp3#8上清液中的HCG值为14.24 mIU/ml;表达有显著性差异(P<0.001);用免疫荧光方法检测滋养层细胞的标志抗体CK7,统计CK7的阳性率,对照组H1shbpCON中为25.2%;实验组H1shbp1#2 中为 11.5%;实验组 H1shbp3#8 中为 7.7%,p<0.05,结果有统计学意义。q-PCR结果显示两组滋养层相关标志物PGF、SYNCYTIN、HCG-A、HCG-B、HLA-G、GATA3的表达都有升高,但对照组的升高程度高于沉默CSRP2BP组。其中合体滋养细胞的标志基因HCG-A、HCG-B的升高比例大于细胞滋养细胞的标志基因HLA-G。基因芯片结果提示与细胞凋亡相关的基因中,与对照组相比,沉默CSRP2BP 组 CDK1、PITX2、PCSK9 高表达,而 FAS、FGF、FOS、GADD45、DDIT3、VEGFA低表达。流式检测结果示,沉默组相比对照组之间细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)增加,有统计学差异(p<0.05)。结论:内源性沉默CSRP2BP抑制H1细胞向滋养层细胞分化,其影响H1细胞向合体滋养细胞分化程度大于向绒毛外滋养细胞分化程度。沉默CSRP2BP促进H1细胞凋亡,可能与其促进凋亡相关基因CDK1、PITX2、PCSK9、FAS、FGF、FOS、GADD45、DDIT3、VEGFA 有关。

关键词： 微量细胞转录组测序   非对称细胞分裂   干性维持   组蛋白遗传   雌性生殖干细胞   胚胎干细胞   小鼠  

摘要： 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干性维持作为其主要特征,对干细胞池稳态和谱系正常发育起到重要调控作用,因此,本研究选择成体干细胞(雌性生殖干细胞)和多能干细胞(胚胎干细胞),对它们干性维持的发育机制进行探究,旨在帮助我们更好的理解哺乳动物的干细胞发育过程,同时为干细胞的临床应用提供理论依据。生殖干细胞的干性维持机制一直是生殖领域备受关注的焦点。目前对精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)自我更新机制的研究较为清楚,而对雌性生殖干细胞(Female germline stem cells,FGSCs)的干性维持机制及其上下游信号通路仍知之甚少。为解析FGSCs干性维持相关的发育调控机制,我们采用微量细胞转录组测序技术(RNA-Seq)分析了小鼠早期雌性生殖细胞发育过程,揭示了原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs),FGSCs,生发泡期(Germinalvesicle,GV)及第二次减数分裂中期(Metaphase II,MII)卵母细胞的转录组学特征,进一步确定了FGSCs是雌性生殖细胞发育中继PGCs之后和GV期卵母细胞之前的一个特定时期。同时,我们用甲基化DNA免疫共沉淀测序(Me DIP-Seq)技术分析了这四个发育阶段的全基因组甲基化水平,发现DNA甲基化在PGCs和FGSCs中均维持较低水平,为FGSCs干性维持的表观遗传调控机制提供了证据。通过基因表达趋势分析,我们发现了磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶(PI3K-AKT)通路伴随雌性生殖细胞发育过程呈下降趋势,进而我们通过特异性小分子抑制剂对其功能和下游靶基因进行实验验证,证实PI3K-AKT通路对FGSCs的干性维持至关重要。通过权重基因共表达网络分析,我们发现FGSCs的干性维持特性及分化潜能可能与其细胞通讯,蛋白运输及RNA代谢有关。我们分析了长链非编码RNA(lnc RNAs)的表达模式,发现632个lnc RNAs具有显著性差异,同时呈现阶段特异性表达模式。应用单细胞PCR及组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)免疫荧光染色技术,我们证实X染色体失活特异转录本(X inactive specific transcript,XIST)在FGSCs中表达,提示其中一条X染色体失活。最后,我们分析了不同发育时期的可变剪切动态变化,发现可变剪切的发生频率在FGSCs高达57.12%,这表明FGSCs中存在更活跃的基因转录过程以维持其干性特征及分化潜能。胚胎干细胞的干性维持机制也是干细胞领域的一个关键科学问题。表观遗传调控虽然可以影响干细胞干性维持和谱系分化等重要发育生物学过程,但我们并不清楚表观遗传信息是如何被传递的。近年越来越多的研究指出组蛋白遗传模式在干细胞非对称分裂(Asymmetriccell division,ACD)过程的干性维持和分化调控中起到不可或缺的作用。基于此,我们研究了小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,m ESCs)在ACD过程中的组蛋白遗传模式,以及调控这种模式的有丝分裂机器。结果显示,在非对称分裂的m ESCs中存在染色体区域上的组蛋白非对称分布,并且这种非对称模式与干细胞ACD紧密相关。如果破坏或去除局部ACD诱导信号,新旧组蛋白Histone 3(H3)和Histone 4(H4)的非对称模式也随之消失;另外,组蛋白局部非对称分布模式只限定于H3和H4,而不存在于Histone H2A,H2B和H3.3。有丝分裂期纺锤体的正确组装对遗传信息的正常分配和传递至关重要,我们进一步检测了非对称分裂过程中的有丝分裂机器,发现这些元件均发生不同程度的非对称事件,因此我们推断这些非对称元件差异性的识别并捕获携带不同组蛋白信息的染色体,从而不同的两套染色体被选择性分配到不同命运的子代细胞中。综上所述,应用微量细胞RNA-Seq和Me DIP-Seq技术,我们研究了小鼠早期雌性生殖细胞各发育阶段的转录组及全基因组甲基化,确定了PI3K-AKT通路对FGSCs干性维持的调控作用,进而明确了FGSCs的分子细胞生物学及表观遗传学特征;同时,我们利用m ESCs的ACD诱导系统,探究了干性维持调控相关的组蛋白遗传模式,为表观遗传信息与干性维持机制研究提供了理论基础。因此,本研究采用两种重要的干细胞,对“干细胞如何维持干性”的关键科学问题进行研究,发现了新的调控通路和表观遗传调控模式,为哺乳动物干细胞的干性维持调控提供了新的研究思路。

ISBN: (纸本)9787548737926