关键词：
石油污染土壤
鼠李糖脂
铜绿假单胞菌
基因工程菌
生物修复
摘要：
石油污染是亟待解决的环境问题之一,生物修复被认为是理想的方法。石油污染物由于水溶性小致使生物可利用性低,一般需投加表面活性剂提高其修复效率。鼠李糖脂作为一种生物表面活性剂,具有无毒、易降解、可增溶疏水性有机物等优点而具有广阔的应用前景。然而,由于鼠李糖脂的生产成本高、产量低等问题而没有被广泛使用。本论文以产鼠李糖脂表面活性剂的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DN1为研究对象,构建高产鼠李糖脂基因工程菌株并对营养参数进行优化,促进其产鼠李糖脂的能力,在此基础上探究鼠李糖脂协同降解菌在修复石油污染土壤的应用潜力。首先利用分子生物学手段将鼠李糖脂合成关键基因rhlAB和rhlC分别转入铜绿假单胞菌DN1,构建基因工程菌株DNAB和DNC;然后对微生物摇瓶生产鼠李糖脂过程中的营养参数进行优化。结果表明:以6种碳源（棕榈油、菜籽油、豆油、甘油、玉米油、橄榄油）为唯一碳源培养时,橄榄油是最佳的碳源;6种氮源（氯化铵、硝酸钠、硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、尿素）为唯一氮源,最佳氮源是硝酸钠。当C/N比为20时,工程菌株DNAB和DNC的鼠李糖脂产量分别达到19.3g/L和22.5g/L,相比DN1的14.2g/L增加到1.35倍和1.58倍。由此可见,增加菌株DN1的rh1AB和rh1C的基因拷贝数并进行营养参数优化,可以提高鼠李糖脂的产量。同时,通过ESI-MS分析得出野生型和工程菌株之间的鼠李糖脂种类和数量差异,发现Rha-Rha-C10和Rha-Rha-C10-C10是工程菌株产生的最优势的鼠李糖脂结构。在此基础上利用鼠李糖脂协同降解菌对石油污染的土壤进行修复,通过检测石油烃的降解效率以及石油污染土壤本源微生物种群多样性的变化,探究投加鼠李糖脂协同降解菌的修复效果。结果表明:35天的修复过程中,相比较未经处理（NA）的石油烃去除率43%,鼠李糖脂协同降解菌修复（BMR）对石油烃的去除效果最好,可达到81%,只施加降解菌修复（BM）对土壤中石油烃的去除率为63%,而只添加鼠李糖脂修复（BR）没有明显提高石油烃的降解率（39%）。多样性分析表明,与未经处理（NA）的土壤微生物多样性相比,只添加鼠李糖脂（BR）和只采用降解菌的修复（BM）提高了土壤微生物群落的丰富度,鼠李糖脂协同外源降解菌的修复（BMR）不仅可以提高土壤群落的丰富度,而且提升了土壤群落的均匀度。属水平上发生极大变化,未经处理的（NA）土壤的优势属有诺卡氏菌属（Nocardioides）和戈登式菌属（Gordonia）,仅施加鼠李糖脂修复（BR）和只添加降解菌修复（BM）出现新的优势属为假单胞菌属（Pseudomonas）,而诺卡氏菌属（Nocardioides）丰度下降;鼠李糖脂协同降解菌修复（BMR）的土壤中出现更多新的石油烃降解优势属,如分枝杆菌属（Mycobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacte）、根瘤菌属（Rhizobiaceae）、空洞菌属（Cavicella）和黄假单胞菌（Pseudoxanthomonas）等,这些石油烃降解优势属的增加显著提高降解菌对土壤中石油烃的去除效果,使得土壤中石油烃降解率可达到81%。此外石油烃降解相关酶丰度的变化结果表明了鼠李糖脂提高了与碳氢化合物降解和转运蛋白有关的酶,增强了降解细菌向修复部位的转运并促进生物降解碳氢化合物。由此可见,鼠李糖脂协同降解菌能有效去除石油污染土壤中的石油烃,并使土壤微生物群落结构发生明显变化,使得易降解石油烃的微生物更富集,在石油污染土壤修复方面具有应用潜力。
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