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关键词： Food science   Agriculture   Sociology   Sub Saharan Africa studies  

摘要： This dissertation seeks to address specific questions: the extent to which SD informs proponents of GE benefits, how farmers’ practices are included in GE proponents’ arguments, and the applicability of the claim that the EU pressures the developing world, and Morocco in particular, to reject GE technology. This dissertation seeks to contribute to both academic and policy discussion on GE crops within the context of African food security. While one is considered globally embraced and the other globally controversial, sustainable development (SD) and agricultural genetic engineering (GE) technology are both examined in this dissertation. The dissertation engages with how proponents of genetic engineering (GE) technology argue for its capacity to benefit sustainable development (SD) in the context of African food security. Three sources of information constitute the basis of analysis and discussion. First, meta-analysis and systematic review of peer-reviewed articles and policy studies which argue for SD benefits gained through GE technology within the context of African food security. Second, taking Morocco as a case study, this dissertation uses both interviews and policy analysis to understand how sustainable development informs policy and academic discussion on GE technology. Third, discussions and observations in national and international conferences have been key to build connections between the examined studies and the networks of their authors. The opportunity to interact with these authors has been tremendously beneficial, both to learn about the policy significance of the examined studies, and to understand the research and policy networks of the authors. Arguments supporting SD benefits of GE technology are examined in four stages. In the first stage, I apply the reviewed theoretical and methodological approaches to examine the studies which argue for SD benefits of GE crops. This stage helps identify the major trends of the reviewed studies. In the second

关键词： PAX6   PI3K/AKT   胚胎干细胞   增殖  

摘要： 目的:探讨PAX6对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的生物学特性的影响及其潜在作用机制。方法:分别用过表达PAX6慢病毒重组质粒载体p-CDH-CMV-MCS-EF1-CopGFR-T2A-Puro和干扰载体pSICOR-shPAX6对mESCs进行感染,对感染后的细胞进行PAX6、GFP免疫荧光染色鉴定;感染效率采用Western blot进行验证;采用CCK8法检测PAX6对mESCs增殖能力的影响;流式细胞仪检测PAX6对mESCs周期的影响;于条件培养的第7天在显微镜下观察各组mESCs的形态变化;Western blot检测角膜缘干细胞分化标志蛋白K5、K14,PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-P70S6K、P70S6K、GLUT1的表达;葡萄糖生化试剂盒和ATP检测试剂盒分别被用来检测mESCs葡萄糖和ATP含量的变化。结果:慢病毒重组质粒载体感染mESCs后,免疫荧光染色鉴定结果显示PAX6过表达组mESCs可见PAX6表达,对照组、过表达空载体组与PAX6干扰组未见PAX6表达。Western blot结果显示PAX6过表达组可见PAX6蛋白表达,对照组,过表达空载体组与PAX6干扰组未见PAX6蛋白表达。与对照组相比,相同时间节点下,PAX6过表达组能够抑制mESCs的增殖,而PAX6干扰组能够促进mESCs的增殖,随着时间的延长,PAX6干扰组促进mESCs增殖的效果更加明显。PAX6过表达组的mESCs细胞周期G1期出现阻滞。光镜下观察各组mESCs在第7天的细胞形态变化,结果显示,四组细胞均呈圆形或椭圆形,边界清晰,与对照组相比,PAX6干扰组细胞较为松散,而PAX6过表达组mESCs则排列紧密,呈集落状生长,呈现出向角膜缘干细胞样细胞过渡的形态。与对照组相比,PAX6过表达组蛋白K5、K14表达量明显升高。与对照组相比,PAX6过表达组、PAX6过表达+BKM120组和BKM120组的p-PI3K,p-AKT,p-P70S6K,GLUT1蛋白表达量显著降低(P<0.05),mESCs内ATP和葡萄糖含量出现不同程度的减少(P<0.05)。结论:PAX6通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性,减少mESCs的ATP及葡萄糖含量,从而抑制mESCs的增殖;PAX6可诱导mESCs向LSCs分化,并促进角膜分化标志蛋白K5、K14的表达。

关键词： 大肠杆菌   核黄素   sRNA   嘌呤合成途径   代谢工程  

摘要： 本文以*** DR01为出发菌株,考察了从5-磷酸核糖到核黄素/FMN合成途径中的相关基因修饰对核黄素合成的影响,确定了效果显著的基因修饰靶标,并构建得到一系列核黄素产量显著提升的工程菌株。首先,基于中等拷贝数质粒载体（Col E1复制子）分别构建了嘌呤合成途径中两个关键基因prs和purF,以及从IMP到GTP合成途径中的四个基因guaA、guaB、ndk和gmk的表达质粒以强化其表达水平;基于sRNA技术分别构建了purA、guaC、ribF基因的sRNA表达质粒以下调其表达水平。将构建的质粒导入DR01菌株（其核黄素产量为473.5mg/L）并进行摇瓶发酵,各个基因修饰结果如下:rib F表达受到抑制的菌株DR11S的核黄素产量达到1173.4mg/L,比出发菌株DR01提高了147.8%,得率为112.8mg/g葡萄糖;prs过表达的菌株DR03的核黄素产量达到898.7mg/L,提高了89.8%,得率达到88.7mg/g葡萄糖;过表达pur F的菌株DR04的核黄素产量达到762.1mg/L,提高了61%,得率为75mg/g葡萄糖;过表达gua A的菌株DR05的核黄素产量达到748.7mg/L,提高了58.1%,得率为74.9mg/g葡萄糖,该菌株经过初始接种量优化后,核黄素产量进一步提升至991.6mg/L,得率为94.4mg/g葡萄糖;pur A表达受到抑制的菌株DR09的核黄素产量达到704mg/L,提高了48.7%,得率达到70.9mg/g葡萄糖,另外,过表达基因gua B,ndk分别能够使核黄素产量提高24.2%和30.3%,效果也比较显著。随后,对效果较好的基因修饰进行了不同的双基因修饰的组合,但同单基因修饰相比,核黄素的产量均没有得到进一步的提升,反而有不同程度的下降。我们发现采用中等拷贝数质粒进行多基因表达时会显著增加菌株的代谢负担和质粒丢失率,因此,考察了稳定性更好的低拷贝质粒（p SC101复制子）来表达基因prs,purF和guaA的效果,相应菌株的核黄素产量分别为616.4mg/L,620.5mg/L和725.6mg/L,比出发菌株提高了30.2%,31.1%和53.2%,该结果再次证明了这三个基因表达对提高核黄素合成的效果显著,虽然其产量比采用中等拷贝数质粒有所下降,但极大地降低了菌株的代谢负担,并且在单位时间内的核黄素产量均有所提升,表明可以基于该质粒进行多基因修饰的组装。本研究不仅得到核黄素产量和得率大幅度提升的工程菌株,还确定了对核黄素合成有重要影响的几个基因修饰靶标,为后续的多基因修饰组合和表达模块组装奠定了基础。

关键词： 人类基因组计划   基因组测序  

摘要： 在中国科学家的努力之下,中国科学院遗传研究所人类基因组中心于1999年7月7日在国际人类基因组组织成功完成注册,同年9月,国际协作组接受了中国的注册申请,并分配了中国科学家需要承担的测序工作。中国成为该计划的第6个参与国,也是唯一一个发展中国家,负责测定全部

关键词： 人胚胎干细胞   类器官   肺分化   移植   肺损伤   细胞治疗  

摘要： 人胚胎干细胞(hESCs)定向肺细胞分化己由传统的2维单层细胞分化逐渐转变为3维立体环境下的类器官分化。hESCs源的肺类器官含肺近端气管及远端肺泡的多种细胞类型如:纤毛细胞,goblet细胞,basal细胞,club细胞,未成熟的I型肺泡细胞(PDPN+/SOX9+)和Ⅱ型样的肺泡细胞(SPC+/SOX9+)。已有的肺类器官分化平台成本高周期长,本课题围绕hESCs源肺类器官分化展开,建立经济的分化平台,探讨其在肺发育及细胞治疗方面的应用。第一章用6个细胞因子或小分子化合物建立经济的hESCs源肺类器官分化平台,qRT-PCR监测分化过程中肺系基因如:NKX2.1，P63,SOX2，SOX9,MUC5AC，CC10,SPC及SPB等的表达,结果显示肺干细胞基因(NKX2.1,P63,SOX2,SOX9)在分化过程中上调,至晚期下调,而肺终末细胞基因(MUC5AC，CC10,SPC，SPB)在分化过程中逐渐上调。免疫荧光染色检测到相应标志物的表达,透射电镜观察到II型肺泡细胞特异的细胞器板层小体及纤毛的“9+2”微管结构,表明成功建立经济型的肺类器官分化平台。第二章应用肺类器官分化平台模拟肺发育,将体外分化至不同时间的肺类器官(D21,D31及D41)移植至NSG小鼠肾包膜下。D21肺类器官移植14天仍呈肺干细胞状态(NKX2.1+，P63+，SOX9+，AQP5-，SPC-),移植100-120天分化出人肺泡祖细胞(BP细胞,PDPN+/SPC+/SOX9+)。D41肺类器官移植100-120天分化为成熟样的I型肺泡细胞(PDPN+;SPB-/AQP5+/SOX9-),移植物含间质、血管及神经,呈器官样的状态,表明肺类器官分化平台可以研究肺发育。第三章应用肺类器官细胞治疗肺损伤模型动物,探讨供体细胞能否修复模型NSG小鼠肺固有结构和功能。移植5周后Pool及CD47high组的供体细胞存活且呈连续的假复层上皮样分布于模型小鼠肺近端支气管,分化为多种假复层上皮细胞,如纤毛细胞(acetylated tubulin+)及club细胞(CC10+)等。移植6周,小鼠肺功能如气道阻力(Penh)及50%潮气量呼气速度(EF50)等得到缓解(*P<0.05)。移植16周未见成瘤,细胞仍呈假复层柱状上皮样排布,分化为多种假复层上皮细胞。CD47high细胞分化为纤毛细胞及形成的假复层上皮的细胞高度更高(*P<0.05),转录组的数据表明其高表达上皮,肺祖细胞,近端气管及胚胎肺早期发育的相关基因,提示CD47high细胞为一群肺系特化的细胞且治疗效果更佳。本研究得出以下结论:1.建立仅用6个细胞因子或小分子化合物的经济型hESCs源肺类器官分化平台;2.首次分化得到人肺BP细胞(PDPN+/SPC+/SOX9+)及成熟样的Ⅰ型肺泡细胞(PDPN+;SPB-/AQP5+/SOX9-),移植物含类似肺的间质、血管及神经,呈器官样的状态;3.肺类器官细胞能在肺损伤模型动物肺内存活,呈连续的假复层上皮样分布,分化为多种假复层上皮细胞,能缓解模型小鼠肺功能。

关键词： 嗅觉及味觉传感技术   植入式微电极   嗅觉与味觉受体   基因工程技术   细胞阻抗传感器   细胞电位传感器   毒性检测  

摘要： 动物的嗅觉系统是一个及其巧妙的化学感受器,它通过嗅上皮与气味分子的结合,将外界的气味刺激通过嗅球传递到大脑嗅觉皮层,这种响应和传递过程具有较高的灵敏度和特异性。对于在体气味分子的检测目前主要是膜片钳技术和光学成像技术。膜片钳技术对操作技术要求较高,而且对记录大量神经元群体信号有一定的局限性,光学成像技术精确度相对较低,而且背景噪音较大。本实验室首次提出了在体嗅觉生物电子鼻系统,主要是基于大鼠自身的嗅觉系统对气味分子的分析与识别功能,使用多通道电极可以同时记录到多个嗅觉系统相关神经元对气味分子的响应信号,通过多种算法实现对神经信号的解码与识别。离体仿生嗅觉与味觉传感器主要是由作为敏感元件的生物活性材料以及作为二级换能器的物理化学探测器组成,第一部分主要以嗅觉/味觉感受细胞,组织以及细胞膜上具有特异性识别功能的受体蛋白为主,主要特异性的识别目标分子,第二部分是作为二级换能器的物理化学探测器,能把目标检测物与敏感元件产生的响应转换为易于处理和分析的物理化学信号。因此此种类型的传感器就具有了生物自身感觉系统所具备的灵敏度高、检测限低、选择性好等优点。本课题的主要目标就是利用基因工程技术来提高仿生嗅觉味觉传感器的特异性和功能集成性。本论文的主要研究内容以及创新性工作如下:1,本文主要研究离体仿生嗅觉与味觉以及在体及生物电子鼻与电子舌两方面内容。分析了嗅觉与味觉系统的结构,细胞的分化以嗅觉与味觉信息的传递通路。在此基础上提出了在体嗅觉生物电子鼻系统的初步设计方案,分析了长时程连续及短时程间断气体刺激二种模式情况嗅觉的响应信号,发现了短时程多次给气以及长时程两种给气方式的不同对于在体植入生物电子鼻实现高灵敏度响应有重要的影响,为后续实验的操作提供理论依据。2.本文详细分析了嗅球内部僧帽细胞与不同神经元之间存在的两种突触连接方式以及僧帽细胞的兴奋性与抑制性两种响应模式。表明僧帽细胞与具有特异性嗅觉受体的嗅感觉神经元的连接,因此对气味分子的响应具有一定的特异性,通过本文的设计的在体生物电子鼻实验分析,证实了记录到嗅觉僧帽细胞的锋电位信号的发放频率增加和降低两种响应模式,对不同的气味分子的响应都有一定的特异性。3,本文设计了一种基于转基因小鼠和脑机接口技术的在体嗅觉生物电子鼻系统,可以克服在体植入定位不准确的缺点,利用转基因小鼠的荧光表达实现了在体生物电子鼻的定点植入,可以提高气味检测的特异性和重复性。通过采用集成微电极阵列实时记录清醒转基因小鼠（M72-IRES-tauGFP）的嗅感觉神经元对不同气味的胞外电位的信号记录,实验结果表明转基因小鼠在检测和识别特定的爆炸物气味方面具有较高的特异性和重复性。4,本文首次提出了在人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y）转染嗅觉受体的的方法,设计了同时具有嗅觉与味觉受体的细胞传感器,实现了气味与苦味的同时检测。利用基因工程技术使细胞同时具有气味和苦味受体,设计了微电极阵列传感器和细胞阻抗传感器,分别检测了气味与苦味对G蛋白偶联受体激活引起的细胞电信号和形态阻抗变化。同时,该细胞传感器也具有对高浓度物质对细胞毒性作用的检测功能,在此基础上,进一步可发展出新型的具有检测气味、苦味和毒性物质的多功能细胞传感器。

关键词： 转基因作物   三螺旋DNA分子信标   苏云金芽孢杆菌   灵敏检测  

摘要： 当今世界,科技发展日新月异,科技的进步带动现代生物技术的大发展,其中转基因技术又被称之为人类历史上具有飞跃性进步的第二次“绿色革命”。转基因技术就是在作物原有基因的基础上引入外源基因,改造其遗传物质,使其营养价值、生物性状更好的满足人类的需要。利用转基因技术把苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)转入到小麦体内,目的主要是增加小麦的抗虫性,其中苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素基因是小麦获得抗虫性能的最主要原因。但是转基因技术也存在一定的生物安全性问题,所以世界各国不断加强对转基因作物的监管力度与检测手段的研发。本论文应用标记荧光猝灭基团(BHQ-1)的单链DNA(triplex-forming oligonucleotides TFO)和两端同时标记荧光基团(FAM-6)的单链DNA(Single DNA S-DNA)构建三螺旋DNA分子信标,然后目标DNA单链(Target DNA T-DNA)和三螺旋DNA分子信标接触,导致三螺旋结构发生改变,从而引起荧光信号强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测。主要内容如下所示:弱酸性环境下自组装三螺旋分子信标用于转基因作物中的目标基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)灵敏检测;最近几年,三螺旋分子信标被广泛用于转基因作物的灵敏检测,其中包括T·A?T和C·G?C(?是Watson-Crick氢键,·是Hoogsteen氢键)等三螺旋结构在内的分子信标是最为常用的。当三螺旋分子信标形成时,含有嘧啶链(胸腺嘧啶T和胞嘧啶C的)的单链DNA(triplex-forming oligonucleotides,TFO)需要在弱酸性环境下首先质子化后才能和双链DNA的嘌呤链(A和G)结合形成稳定的三螺旋分子信标,其中含有胞嘧啶C的DNA单链(TFO)质子化后,带正电的胞嘧啶C与带负电的DNA双链由于静电作用,能够起到稳定三螺旋分子信标的作用。目标DNA单链加入后可以破坏三螺旋信标的结构,导致荧光强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测,检测下限达到1 pM。中性环境下自组装三螺旋分子信标用于转基因作物目标基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)灵敏检测;为了扩展三螺旋分子信标的应用范围,在本论文中人为加入Ag用来增加三螺旋分子信标在中性环境下的稳定性。Ag不仅能够特异性识别C·G?C的三螺旋结构,而且还可以把C·G?C中的H置换成AgC·G?C新的三螺旋结构,这样Ag的加入就极大的增加三螺旋分子信标的应用范围。目标DNA单链加入后可以破坏三螺旋信标的结构,导致荧光强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测,检测下限达到0.1 pM。

关键词： DNA复制   转录   染色质空间结构   胚胎干细胞   体细胞  

摘要： 真核生物细胞周期是一个复杂而又高度有序的过程。包括细胞的生长、遗传物质的复制,以及将复制产生的染色体分离到其子细胞等过程。DNA复制是该过程的核心事件。细胞分化是单一细胞系经过复杂生命活动产生一系列结构功能有明显差异细胞系的过程。在分化过程中基因的选择性表达需要特异性的转录程序,而DNA的复制时序与基因的转录调控存在密切联系。细胞在分化过程中通过改变DNA复制时序使得分化后细胞的生物功能顺利实现,这一动态变化可能与染色质的序列、表观特征以及结构密切相关。为了验证这一假设,我们利用染色体构像捕获(Hi-C)等实验技术得到的高通量测序数据,根据胚胎干细胞与体细胞间复制时序的差异将基因组分为4类:在5类细胞中复制时序保守的早复制域,称为CE;5类细胞中复制时序保守的晚复制域,称为CL;在干细胞中晚复制而在4类体细胞中早复制的区域,称为LtoE;在干细胞中早复制而在4类体细胞中晚复制的区域,称为EtoL。我们从染色质的序列特征、表观特征和染色质结构特征三方面分析在分化中复制时序改变和保守区域的染色质特性。首先在染色质序列特征层面上,保守的复制域表现出与其复制时序相对应的染色质特征:早复制域是基因密度、GC含量和转座子密度较高的活跃区域,晚复制域则与之相反。复制时序发生变化的区域基因密度、GC含量和转座子密度都介于早晚复制域之间。然后在染色质表观层面上,早复制域是富集有H3K4me3等活跃组蛋白修饰信号的常染色质区域,晚复制域则与之相反。在干细胞中复制时序发生变化的两类区域(EtoL和LtoE)的染色质开放程度相当,H3K4me3和H3K9me3的修饰信号强度也无明显差异。但在分化后表现出与复制时序相对应的表观特征。最后在染色质结构模块层面上,基因组中早复制的活跃染色质所在的TAD较小且层次较高,而晚复制的染色质位于的TAD较大且层次较低。对于两类复制时序变化区域,其各自表现出分化后体细胞中复制时序对应的结构特征,即EtoL的复制域在干细胞中约有一半以上已经位于B Compartment,且多数处于较大的TAD中。而LtoE则与之相反,在干细胞中多数位于A Compartment,且处于小的TAD中。两者各自与同类染色质的交互要强于与其他染色质区域。在转录水平上,LtoE的基因表达量上调且其功能与分化细胞特异性对应,这类基因表现出与保守的早复制基因相似的染色质状态以及染色质结构。我们的分析表明在细胞分化中不同复制域表现出不同的调控机制,保守的复制域中DNA复制展现出时间与空间的协调性,而对于在分化前后复制时序发生改变的区域,DNA复制时序与染色质特征的相关性较低,其在干细胞中表现出特殊的结构特征。

关键词： 体细胞核移植   转录组测序   全基因组甲基化测序   组蛋白甲基化   猪  

摘要： 体细胞克隆又称体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT),是家畜优良种质高效扩繁和育种新材料创制的重要手段,在家畜遗传改良上具有重要的应用价值。在猪育种中,利用SCNT技术可以将优秀种公猪个体进行复制扩繁,生产出与供体同样优秀的克隆个体。除此之外,SCNT与转基因或基因编辑技术相结合,可以创制具有优势性状的猪育种新材料。然而,目前猪SCNT效率依然低下,主要原因是体细胞表观遗传重编程不完全,从而导致胚胎发育过程中关键基因异常表达。本研究拟揭示猪克隆胚胎早期发育异常的分子机理,寻找导致猪克隆胚胎早期发育被阻滞的关键基因,探索提高猪克隆效率的新方法。本研究采用单细胞转录组测序技术,构建了猪克隆与体内受精胚胎在7个连续发育阶段(卵母细胞、1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚期)的基因表达图谱,发现猪胚胎基因组激活主要发生在2-细胞至8-细胞阶段;鉴定到多个导致猪克隆胚胎发育异常的候选基因,其中TET1、DRAP1是影响猪体外成熟卵母细胞发育潜能的关键基因,KLF17、OLIG3、ZFP37、ZFP42是影响克隆猪4-细胞胚胎基因组激活的关键基因;通过比较猪克隆和体内受精胚胎的H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3相关组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶基因表达变化模式,发现KDM4A、KDM4D和KDM5B在4-细胞克隆胚胎中异常低表达,KMT2A、SUV39H2在8-细胞克隆胚胎中异常高表达,这些基因表达异常可能是导致猪克隆胚胎的组蛋白修饰异常的重要原因。本研究进一步采用单细胞全基因组甲基化测序技术,构建了猪4-细胞和8-细胞的克隆与体内受精胚胎的单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。通过比较4-细胞期的克隆与体内受精胚胎的甲基化模式,鉴定到7738个差异甲基化区域,其中6403个为高甲基化区域,1335个为低甲基化区域,表明猪4-细胞克隆胚胎中不仅有大量异常的高甲基化区域,而且还有很多异常低甲基化区域;8-细胞期的克隆与体内受精胚胎之间共鉴定出24791个DMRs,其中24014个为高甲基化区域,777个为低甲基化区域,表明猪8-细胞克隆胚胎的DNA甲基化异常主要是存在大量异常高甲基化区域;KEGG通路分析发现4-细胞和8-细胞的克隆与体内受精胚胎的差异甲基化基因主要富集在NF-κB信号通路和氧化磷酸化信号通路中,在细胞分化、增殖和凋亡过程中发挥重要作用。最后,本研究在1-细胞克隆胚胎中过表达KDM4A/KDM5B/KDM6B/USP21/USP29等基因,探索抑制组蛋白甲基化或泛素化水平对猪克隆胚胎发育效率的影响。结果发现同时过表达KDM4A和KDM5B极显著提高囊胚率和囊胚内总细胞数;单独过表达KDM4A、KDM5B或USP29仅极显著提高囊胚内总细胞数,对囊胚率无显著影响;单独过表达USP21、KDM6B对囊胚率和囊胚内总细胞数均无显著影响。利用转录组测序分析发现过表达KDM4A、KDM5B或同时过表达KDM4A和KDM5B均矫正了部分在对照组克隆胚胎中异常的表观遗传修饰相关的功能基因表达,这些基因显著富集在组蛋白赖氨酸代谢通路中。通过免疫荧光染色分析发现过表达KDM4A显著降低2-细胞、4-细胞和8-细胞的克隆胚胎的H3K9me3荧光信号,过表达KDM5B显著降低2-细胞和4-细胞的克隆胚胎的H3K4me3荧光信号,同时过表达KDM4A和KDM5B引起H3K9me3和H3K4me3荧光信号均显著降低。通过联合注射体外合成的KDM4A mRNA和KDM5B mRNA至1-细胞胚胎的方法,使克隆猪的出生效率提高了1.96倍。本研究通过比较猪早期克隆和体内受精胚胎的转录组和DNA甲基化图谱,解析了猪克隆胚胎早期发育的异常模式;通过在猪克隆胚胎中过表达组蛋白去甲基化酶基因KDM4A和KDM5B,显著提高了猪体细胞克隆效率。本研究为进一步理解猪克隆胚胎发育异常提供了重要的理论基础,为提高猪体细胞克隆效率提供了新的思路。

关键词： 帕金森病   人胚胎干细胞   神经祖细胞   多巴胺能神经元   定向诱导   Matrigel   laminin-111  

摘要： 研究目的:通过观察采用“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案调控人胚胎干细胞向中脑黑质多巴胺能神经元分化的可行性及效果,以便建立一种使人胚胎干细胞特异性向黑质多巴胺能神经元分化,而且效率高,培养成本相对较低,适合批量生产,可以满足临床移植和药物筛选、离体模型研究等需要的分化方案。方法:1、“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案诱导人胚胎干细胞分化1)第一阶段为人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能神经祖细胞。使用人胚胎干细胞H9和HN4,分别在基质胶和人重组层粘连蛋白-111包被的培养板上采用单层贴壁培养法,定向诱导分化16天。基础神经培养基为N2、B27培养基。加入因子为10μM Y-27632、10μM SB431542、100ng/m L头蛋白。为促进其“腹侧化”及“尾侧化”,培养基中再加入300ng/m L Shh-C24II和0.7μM CHIR99021。在分化第9天,加入100ng/m L成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)。在分化第11天,加入20 ng/m L脑源性神经营养因子(BDNF)、0.2m M L-抗坏血酸(AA)、100ng/m L FGF8b,促进中脑多巴胺能神经祖细胞的定型和区域化。2)第二阶段为中脑多巴胺能神经祖细胞的分化成熟,在分化第16天,加入20ng/m L BDNF、0.2m M AA、10ng/m L胶质细胞源性神经营养因子、500μM环化腺核苷一磷酸、1μMγ-分泌酶抑制剂,在上述培养条件下继续培养至42天,保证其分化为成熟的多巴胺能神经元。2、不同培养阶段细胞样本检测1)采用倒置相差显微镜检测细胞形态学变化;2)细胞免疫荧光检测中脑多巴胺能神经元相关标记物络氨酸羟化酶(TH)、微管相关蛋白2(MAP2)、叉头框转录因子A2(FOXA2)、LIM同源盒转录因子1(LMX1)、Orthodenticle同源框2(OTX2)、G蛋白激活内流钾通道蛋白2(GIRK2)、钙结合蛋白1(Calbindin1)等蛋白表达;3)实时荧光定量PCR(q PCR)检测TH、FOXA2、LMX1、A9(黑质致密部)多巴胺能神经元标记物GIRK2、A10(腹侧被盖区)多巴胺能神经元标记Calbindin1、Bar H同源框1(BARHL1)等相关基因表达;4)蛋白免疫印迹检测TH、FOXA2、LMX1、GIRK2等相关蛋白表达。结果:1、相同定向诱导条件下,在基质胶包被的培养板上的贴壁细胞数量、存活量、细胞产量较人重组层粘连蛋白-111上的数量多。2、本实验整个过程在基质胶包被的培养板上进行,细胞形态从典型干细胞形态-铺路石样逐渐分化为典型成簇多巴胺能神经元形态-梭形或多角形。3、细胞免疫荧光结果显示,在分化第16天,可见大量FOXA2+/LMX1+/OTX2+的腹侧中脑祖细胞,约占总细胞35%。在分化第42天,可见大量GIRK2+/TH+、FOXA2+/LMX1+、TH+/MAP2+、GIRK2+/LMX1+等细胞。4、qPCR结果显示:与胚胎干细胞相比,在分化第16天,细胞样本中可见FOXA2、LMX1、丘脑底核(STN)神经元标记物BARHL1、TH高表达(P<0.05);GIRK2、Calbindin1表达轻度升高(P<0.05)。与第16天相比,分化第42天细胞样本中可见FOXA2、LMX1、BARHL1表达较16天有所下降(P<0.05),但GIRK2、Calbindin1和TH明显升高(P<0.05)。5、蛋白免疫印迹检测结果显示:分化第42天,中脑多巴胺能神经元标记TH、FOXA2、LMX1均有表达,GIRK2表达明显升高。6、一定范围内调控CHIR99021浓度结果显示,随着CHIR99021浓度的不断增加,FOXA2阳性细胞数不断增加,而对LMX1+/OTX2+细胞数影响不大,在0.8μM时阳性细胞数最高。结论:1、基质胶作为包被剂可用于干细胞定向诱导分化,其促细胞粘附和细胞存活效果优于人重组层粘连蛋白-111的效果,并具有一定的经济价值。2、采用“腹侧化”及“尾侧化”模式的分化方案,可以将人胚胎干细胞分化为大量A9多巴胺能神经元,并且在形态学改变、蛋白水平、基因水平上证实其中脑多巴胺能神经元特征,证实本方案是有效可行的。3、“尾侧化”诱导因子CHIR99021浓度与腹侧中脑祖细胞阳性率密切相关,一定范围内随CHIR99021浓度增加而增加。4、本研究方案所获得的神经元中主要为A9多巴胺能神经元,但仍包括少量的丘脑底核神经元和A10多巴胺能神经元,说明本方案仍然不十分完美,有进一步优化的可能性。