关键词:
胚胎干细胞
分化
内皮细胞
造血细胞
血管内皮干祖细胞
造血干祖细胞
摘要:
研究背景:在血管发生和重塑的过程中,血管内皮细胞(endothelial cell,EC)起源于血液血管母细胞(hemangioblast,HA)。但由于缺乏对这一发育过程诸多细节的深入了解,因而成熟的血管内皮在体外扩增十分困难,极大地限制了它的功能研究和临床应用。近年来,多项研究表明哺乳动物成体血管内皮中存在一群具有特定分子表型的“血管内皮干细胞(vascular endothelial stem cell,VESC)”,表达Kit(也称CD117)、Procr(也称EPCR、CD201)等分子,能在体外形成稳定克隆并产生数千万的子代内皮细胞。不仅如此,VESC还具有分化为原代内皮细胞和周细胞的双向潜能,可以在体内产生功能性血管,这为组织工程化血管和临床治疗提供了新的研究方向。造血细胞(hematopoietic cell,HC)的起源与血管内皮密不可分。目前的主流观点认为,造血细胞是由中胚层来源、功能特化的生血内皮(hematopoietic endothelium,HE)通过内皮-造血转化(endothelial to hematopoietic cell transition,EHT)分化演变而来,以产生原始造血和定向造血两大主要形式出现于胚胎早期的多个位点和时间节点,具有明显的时空特异性。小鼠胚胎期的造血细胞表达内皮细胞标志CD31、CD144等,来自外周血CD34的造血细胞可以通过体外培养分化为内皮细胞,这些研究也间接证实了造血细胞与内皮细胞有着共同的发育起源。胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是一类能够分化成机体几乎所有细胞类型的全能干细胞,增殖能力强,是组织工程化研究理想的种子细胞。近年来多项研究表明,在干细胞因子(stem cell factor,SCF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等细胞因子的诱导下,ESC在体外能被诱导分化为内皮干祖细胞(endothelial stem and progenitor cell,ESPC),进而分化成内皮细胞、血管壁细胞(周细胞和血管平滑肌)并进一步向动、静脉内皮特化;或者分化为造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC),进而向髓系祖细胞(myeloid progenitor)、巨核-红系祖细胞(megakaryocyte–erythrocyte progenitor,MEP)等及其下游血细胞分化。这些发现为ESC的体外诱导编辑研究奠定了理论基础,然而因诱导手段局限、调控网络不清晰、微环境缺失等原因,ESC体外定向内皮细胞和造血细胞的分化体系仍不十分成熟。研究目的:本研究利用胚胎干细胞的发育全能性和诱导可塑性,通过各种细胞因子和条件控制,定向诱导其分别向内皮细胞和造血细胞分化,构建完整的体外定向分化体系。通过流式检测、免疫组化等各种手段验证诱导后2种细胞的表面分子特征,探索诱导过程中是否存在“干祖细胞”的中间态及其表面分子特征,探讨内皮和造血发育的相关性,为优化稳定、成熟的体外诱导分化体系,进而进行大规模组织工程化应用研究提供实验基础。研究方法:根据胚胎期内皮、造血细胞的起源规律,本研究在无血清的StemPro培养体系中,使用能够诱导干细胞向中胚层分化的BMP4(bone morphogenetic protein 4,骨形态发生蛋白4)、Activin A(激活素-A),以及能够诱导内皮细胞增殖、迁移的FGF-Basic(fibroblast growth factor basic,碱性成纤维细胞生长因子)和VEGF这4种因子,诱导小鼠胚胎干细胞系R1/E形成拟胚体(embryoid body,EB),模拟中胚层发育过程,再用SCF、VEGF和SCF、FLt3L(FLt-3 ligand)、IL-3分别定向诱导EB向EC和HC分化,建立胚胎干细胞体外定向血管内皮和造血细胞的分化系统。研究结果:经过四因子体系诱导分化4天后,ESC成功被诱导为大量形态饱满、克隆边界清楚的EB;继续向内皮和造血定向分化6天后,成功诱导出多个内皮管状结构和造血集落。通过流式检测分析,CD31的内皮细胞比例为1.35±0.05%,进一步分析CD31CD144CD45群体,发现其中有3.0±0.2%的细胞表型为KitCD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的ESPC;CD45的造血细胞比例为35.0±0.5%,其中有0.35±0.05%的细胞表型为KitCD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的HSPC。这两群细胞数量非常有