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关键词： 海参i-型溶菌酶   发酵   酶学性质   分子动力学  

摘要： 溶菌酶,又称N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶,是一种无害、无毒,不会残留在体内的天然蛋白质。其广泛分布于不同生物体中,是一种能水解微生物细胞壁黏多糖的碱性水解酶。2007年,本实验室首次分离和鉴定了海参i-型溶菌酶基因,并已在原核细胞和真核细胞中高效表达其目的蛋白。该研究以本实验室已构建的能高效表达的海参i-型溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌HS3-1为发酵出发菌株,运用发酵罐对该工程菌进行发酵生产。发酵液经过一系列分离纯化后得到海参i-型溶菌酶产品。利用高效液相色谱和MALDI-TOF质谱技术对海参i-型溶菌酶产品进行分析测定,通过利用分子动力学模拟的方法对该酶热稳定性进一步研究。研究结果如下:(1)5 L发酵罐初始为3 L BSM基础盐培养基,发酵过程控制条件为温度30℃,pH6.0,搅拌转速400 r/min,溶解氧DO 30%;发酵过程分为三个阶段,即细胞生长阶段、甘油流加阶段和甲醇诱导产物分泌阶段。发酵结束后,分析该发酵液的溶菌酶产量为58mg/L。最后生产的海参i-型溶菌酶产品,其酶活力为1246 U/mg。高效液相色谱分析结果显示,该溶菌酶产品与蛋清溶菌酶标准品的出峰时间相同,而且无其他杂峰。MALDI-TOF质谱分析结果显示,该海参i-型溶菌酶的分子量为14708.7 Da,与其氨基酸组成的理论计算值相符合,这说明该产品为海参i-型溶菌酶。(2)利用生物信息学方法,对海参i-型溶菌酶蛋白进行分析。通过一级结构分析确定了,海参i-型溶菌酶的氨基酸种类、数量及占比;二级结构预测分析可推断,该溶菌酶蛋白中α-螺旋,β-折叠,β-转角及无规则卷曲的比例及位置。通过三级结构预测可推断该溶菌酶活性中心及活性位点在亚基结构中所处的位置。(3)在酶学性质研究方面,确定海参i-型溶菌酶的最适温度为35℃,在65-80℃较高温度下有较好的热稳定性;最适pH为6.5,pH在5.0-8.0之间稳定性较好。通过分子动力学模拟,发现该溶菌酶的三级结构存在“螺旋-环-螺旋”(HLH),推测该酶的抗菌活性与此结构有关,这个结果与国外学者Zavalova等对水蛭溶菌酶单个螺旋肽形成的HLH构象具有活性的研究结果相符合。进一步分析比较确定该溶菌酶两个活性位点(Glu 19和Asp 31)分别位于“H2-L3-H3”构象中的2个螺旋区域上。“螺旋-环-螺旋”构象在高温下使其仍具有很强的抗菌活性,这表明该酶具有良好的热稳定性,与不同温度下抑菌试验结果相符。这个研究为进一步探讨海参i-型溶菌酶的分子作用机理奠定良好的理论基础,该酶的热稳定性优势对食品工业及动物饲料加工业非常有利,所以它具有很大的应用价值。

关键词： 胚胎干细胞   自我更新   分化   PTPN2   STAT3  

摘要： 在小鼠胚胎干细胞中添加细胞白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)能够触发STAT3蛋白上第705位的酪氨酸的磷酸化,此位点的磷酸化可以激活STAT3,促使STAT3进入到细胞核内,从而与它靶基因结合并激活它们的表达,最终维持小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells mESCs)的自我更新状态;此外,很多研究者们也都发现将STAT3及其靶基因过表达后,在添加LIF,CHIR99021和PD0325901的条件下,能够将分离自着床后的小鼠上胚层干细胞(Epiblast stem cells,EpiSCs)诱导重编程回到mESCs状态。STAT3主要在经典通路Janus途径中发挥作用,所以STAT3蛋白第705位的酪氨酸的磷酸化是主要通过Janus激酶途径来实现的。虽然目前关于STAT3基因在mESCs中的功能虽然有很多报道,但与其相互作用的蛋白的却未鉴定出来。过表达STAT3可以替代LIF的功能,从而维持mESCs在未分化状态,我们的研究发现:在过表达基因STAT3的细胞系中上调PTPN2(protein tyrosine phosphatase non-receptor type2)基因能够诱导mESCs分化。而PTPN2先前报道与STAT3蛋白可能存在相互作用,所以我们推测PTPN2引起的mESCs分化可能是与STAT3有关系。为了确定STAT3与PTPN2在蛋白质水平上是否存在着某种相互作用,从而导致mESCs发生分化,我们在体内和体外进行了以下三个方面的研究:首先,为了探究STAT3与PTPN2是否存在蛋白间的相互作用,基于蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)技术,我们构建了分别携带HA和FLAG标签的STAT3和PTPN2过表达载体,并导入mESCs,Co-IP结果显示:外源性的STAT3与PTPN2蛋白在蛋白质水平存在相互作用。接着我们利用内源性的STAT3和PTPN2特异性的抗体进行了Co-IP实验,进一步证实了内源性的STAT3和PTPN2在蛋白水平也确实存的相互结合。这一实验结果证实了我们先前的猜想,确定了二者在蛋白水平的关系。接着,为了明确PTPN2是否可以削弱LIF/STAT3信号通路维持mESCs自我更新的能力,我们在mESCs中过表达了PTPN2,结果显示mESCs发生了分化。蛋白质印迹法检测干细胞自我更新标志基因Esrrb、Klf4和Nanog三个蛋白的含量,结果显示这三个蛋白的表达量降低了。紧接着我们又通过免疫荧光和实时定量qPCR等技术,发现多能性基因的表达在PTPN2存在的情况下的确降低了,而分化相关基因T和Cdx2表达上调。mESCs自我更新主要与STAT3的磷酸化有关,其中705位的酪氨酸又充当着非常重要的角色,而PTPN2是一个去磷酸化蛋白,于是我们检测了 STAT3705位酪氨酸的磷酸化水平,结果显示:PTPN2能够降低STAT3705位磷酸化水平。此外我们还发现在LIF的刺激下与PTPN2蛋白结合的磷酸化的STAT3蛋白含量增多了。同时,LIF能够刺激PTPN2从细胞质进入细胞核内。这些结果说明PTPN2蛋白能够与磷酸化的STAT3结合,从而使其去磷酸化,最终阻碍STAT3与自我更新相关基因的启动子结合,致使这些基因不能够被有效诱导表达,最终导致mESCs分化。综上,PTPN2抑制STAT3的活性主要是通过降低STAT3的705位酪氨酸残基去磷酸化,从而导致mESCs的分化。接下来,我们做了反向实验,即利用RNA干扰技术将PTPN2的表达量降低,观察其是否依然影响干细胞的自我更新,结果显示:PTPN2表达量降低能够延缓mESCs分化。为了确定这一结果,我们进一步利用CRISPR/CAS9系统在mESCs中敲除了PTPN2基因,观察到的结果与RNA干扰结果一致。这些实验结果表明:PTPN2的存在抑制了小鼠胚胎干细胞的自我更新能力。因为STAT3过表达还能够将EpiSCs重编程回到ESCs状态,因此最后我们检测了PTPN2是否会影响STAT3介导的EpiSCs重编程。我们在过表达STAT3的EpiSCs中的细胞株中敲低PTPN2的转录本,结果显示STAT3过表达的EpiSCs里产生了很多mESCs克隆,表明降低PTPN2的活性可以提高STAT3重编程EpiSCs的能力。为了反向确认这个研究结果,我们又在过表达STAT3的EpiSCs中同时过表达PTPN2基因,发现mESCs克隆的生成数量减少了,所以上调PTPN2会抑制STAT3活性,从而导致后者重编程EpiSCs的能力降低。综上,我们通过一系列实验证明了PTPN2和STAT3在mESCs存在蛋白质相互作用,前者通过抑制STAT3磷酸化

关键词： 尿酸氧化酶   大肠杆菌   毕赤酵母   分泌型表达   分子伴侣  

摘要： 尿酸氧化酶(Urate Oxidase,EC 1.***.3.3)可以催化降解尿酸生成溶解度为尿酸十几倍的尿囊素,是嘌呤代谢过程的重要酶。由于生物进化过程中人体内的尿酸氧化酶基因突变,导致尿酸氧化酶失去活性,因此人体的尿酸含量一直较高,而过高的尿酸会引起痛风等一系列疾病。作为一种可以快速降低尿酸含量的酶,尿酸氧化酶在医学方面有着重大应用潜力。但是由于产量低,纯化较为复杂,其高额的成本使得在国内没有大规模推广应用,因此构建一株有高产尿酸氧化酶的基因工程菌株是非常有意义的。本文选用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主,过表达来源于黄曲霉的尿酸氧化酶的基因(uox),并对培养条件、密码子进行优化提高尿酸氧化酶产量,此外通过表达分子伴侣蛋白、转运因子、折叠因子和转录因子等方式进一步提高尿酸氧化酶产量。本论文主要工作如下:(1)在大肠杆菌BL21(DE3)中导入了来源于黄曲霉尿酸氧化酶基因(uox),构建了产尿酸氧化酶的基因工程菌株***,尿酸氧化酶产量为2.09 mg/L。对尿酸氧化酶基因进行密码子优化,尿酸氧化酶的产量提高到2.66 mg/L。进一步地,对该重组菌株发酵过程中发酵时间、诱导剂添加量、诱导温度等条件进行优化,在发酵11 h后得到4.03 mg/L的尿酸氧化酶,经镍柱纯化后的尿酸氧化酶酶活为8.11 U/mg。为了进一步促进尿酸氧化酶表达,在菌株***中分别导入了分子伴侣tig、dnaK-dnaj-GrpE、GroES-GroEL促进其翻译后折叠,产量分别提高至6.07 mg/L、6.66 mg/L、4.82 mg/L,而导入了分子伴侣tig-GroES-GroEL 的菌株产量有所下降,为3.15 mg/L。最后对发酵条件进行正交实验优化,在最优发酵条件下产量为8.77 mg/L,可溶性目的蛋白占总蛋白的62%。(2)以毕赤酵母GS115为宿主导入尿酸氧化酶基因uox,筛选高拷贝的菌株最终得到***-11和***-16两株菌株,发酵6天后发酵液酶活分别为0.746 U/mL和0.793 U/mL,纯化后的酶活为9.32 U/mg和9.41 U/mg,酶产量分别为80.04 mg/L和84.12 mg/L。通过验证拷贝数,得到了在筛选范围内拷贝数和酶表达量的粗略关系。(3)从***-11菌株出发,从转运、折叠、转录三方面调控,提高酶表达量。在导入了折叠因子Sec53后产量没有明显提升。折叠方面通过表达PDI、Kar2p、CNE1折叠因子,发酵6天后发酵液中的酶表达量分别提高表至92.4 mg/L、96.1 mg/L和87.3 mg/L,酶表达量分别提高了 18.4%、22.8%和11.9%。转录方面通过表达HAC1转录因子提高酶表达量至100.3 mg/L,酶表达量高了 28.6%,构建了有较高产量的尿酸氧化酶分泌型表达菌株。最后,通过正交试验优化,对表达了 PDI折叠因子的菌株进行发酵条件优化,最终酶表达量达到了 104.5 mg/L,提高了13.1%。

关键词： 层状双氢氧化物   鬼臼毒素   5-氟尿嘧啶   胚胎干细胞  

摘要： 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)因具备自我更新能力和分化成完整个体的潜能而备受关注，现已广泛应用于疾病机制的探究、药物的筛选及细胞缺损性疾病的治疗。胚胎发育过程十分敏感，极易受到体内外环境特别是药物分子的影响。处在孕期的癌症患者在接受传统的手术切除、放疗或化疗时会对胚胎产生较大的毒副作用，但是根据患者的病情，治疗往往不能延迟到分娩后。因此，迫切需要构建一种新型给药系统，既能抑制癌细胞生长又能对胚胎发育过程有较好的保护作用。　　纳米材料广泛应用于生物医药领域，不仅能作为药物和基因的载体，增强其靶向性和治疗效果，还能够调控干细胞的命运。层状双氢氧化物(layered double hydroxide，LDH)具有合成简单、易于修饰、比表面积大、生物相容性好及稳定性高等优良特性。鬼臼毒素(Podophyllotoxin，PPT)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)是两种广谱性抗癌药物，本论文主要以LDH为纳米载体，分别搭载PPT和5-FU形成两种纳米复合物LDH-PPT和LDH-5-FU，利用小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)评价两者对小鼠胚胎发育过程的影响，主要研究工作及结果如下：　　(1)制备LDH-PPT和LDH-5-FU两种纳米复合物，通过TEM、Zeta电位、XRD及缓释等实验手段对材料的物化性质进行表征。　　(2)利用MTT法、流式细胞术(FACS)、细胞免疫荧光染色和Westernblot检测材料对细胞存活率、凋亡、周期及吞噬等方面的影响。结果表明LDH-PPT与mESCs之间的生物相容性良好，而LDH-5-FU对mESCs的毒性较大。　　(3)通过碱性磷酸酶染色(AP染色)、细胞免疫荧光染色和荧光定量PCR等实验手段评价两种纳米复合物对mESCs自我更新和分化潜能的影响。与对照组相比，LDH-PPT能够维持去LIF条件下mESCs的自我更新能力，且对拟胚体形成过程中三胚层的分化没有显著影响;LDH-5-FU则下调了mESCs多能基因的表达，同时破坏了mESCs的分化潜能。　　(4)构建孕鼠模型，在动物水平上进一步评估LDH-PPT和LDH-5-FU对小鼠胚胎发育过程的影响。结果表明，LDH-PPT组与对照组相比没有显著差异，LDH-5-FU组则抑制了胚胎发育过程，检测结果与体外结果一致。

关键词： Biomedical engineering   Health sciences  

摘要： Human Embryonic stem cells (hESCs) have self-renewal capacity and can differentiate into all cell types in the human body. It has been extensively reported that specific signaling pathway modulators can induce hESC differentiation, but it is unclear how cellular metabolism can affect cell fate determination. It is also unknown how metabolism interacts with signal transduction during differentiation. In this thesis, we use hESCs to address the two questions raised above. We first focused on the effect of metabolism and related cell signaling on mesoderm differentiation under bone morphogenetic protein 4 (BMP4) induction in hESCs. hESCs are highly reliant on aerobic glycolysis for energy sources during maintenance. Pyruvate is a critical metabolite. We found that pyruvate upregulated oxygen consumption rate (OCR) and metabolites levels of citric acid cycle (TCA cycle). Surprisingly, pyruvate highly promoted early mesoderm differentiation under BMP4 induction. Thus, we found that dichloroacetate (DCA), which activates the TCA cycle, also promoted early mesoderm differentiation. While inhibiting glycolysis and oxidative phosphorylation by 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) mediated suppression of mesoderm differentiation and altered cell fate to extra-embryonic differentiation under BMP4 induction. Furthermore, we found that pyruvate promoted 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activity and inhibited the mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway. We then examined extracellular-signal-regulated kinase 5 (ERK5) signaling regulation of cell fate determination in hESCs. Extracellular-signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) is known to be downstream of basic fibroblast growth factor (FGF2) and essential for the maintenance of hESC pluripotency. ERK5 is another critical mitogen-activated protein kinase (MAP kinases) in ESCs, but its role in hESC fate determination is not well studied. We found that ERK5 was critical for pluripotency maintenance. Inhibition of E

关键词： 二恶英   环境暴露   发育毒理学   胚胎干细胞  

摘要： 环境污染物是人类健康的一大威胁，很多环境污染物被证明具有发育毒性，其中二恶英是一种公认的致畸物，对包括心血管、骨骼、肝脏、牙齿、生殖系统等多种器官与组织的发育都具有毒性作用。一些新型污染物的发育毒性也逐渐被发现。传统的发育毒理学研究通常借用动物模型，例如斑马鱼、非洲爪蟾、鸡胚与小鼠，或者使用具有一定分化能力的癌细胞。但由于种属差异和癌细胞的组织特殊性与分化能力局限性，这些方法并不是对人类健康最好的参照。近年来，胚胎干细胞技术飞速发展，在基础生物学和再生医学研究中发挥了重要的作用，也为发育毒理学研究提供了理想的工具。与此同时，新的分子生物学技术如CRISPR-Cas9基因编辑，高通量测序等也为毒性机理的研究提供了强大的辅助。　　本研究基于人胚胎干细胞技术和一系列细胞生物学与分子生物学技术构建了基于人胚胎干细胞技术的发育毒理学研究平台，即利用人胚胎干细胞体外分化的过程模拟特定器官或组织在环境暴露下的发育过程，确定污染物的发育毒性和敏感阶段，再结合信号通路研究、组学技术等对毒性机理进行探索。　　我们对二恶英的心肌发育毒性研究进行了系统和细致的研究，弥补了二恶英对人类心肌发育毒性实验研究的空白。在这一研究中，我们首先通过对发育过程的全程暴露证实了2nM二恶英（2，3，7，8-TCDD）对人胚胎干细胞的体外心肌发育具有毒性作用，导致心肌、离子通道、房室结等组织标志物表达量降低，心肌细胞形态异常。接着，我们通过分发育阶段的暴露实验找到了心肌发育对二恶英毒性最敏感的发育阶段为发育早期的胚胎干细胞阶段和中胚层发育阶段。之后，我们通过芳香烃受体AhR的拮抗和CRISPR-Cas9敲除，对AhR信号通路在毒性介导中的作用进行了研究，证实了二恶英对心肌发育的毒性是通过AhR信号通路介导的。最后，我们借助染色体组免疫沉淀测序、转录组测序，和生物信息学分析手段，发现AhR可以直接结合并调控一系列中胚层关键性基因，从而影响后续的发育过程。　　根据我们在二恶英心肌发育毒性研究中的一些新发现，例如AhR信号通路在人们熟知的毒性介导作用以外，可能在发育中具有复杂的调控作用，我们对AhR信号通路与胚胎干细胞全能性的关系进行了探索，发现AhR信号通路对胚层分化与干细胞的DNA甲基化都会造成显著影响，表明AhR信号通路对人类胚胎干细胞全能性可能存在调控作用。我们也进一步对类二恶英类物质，如近年来受到关注的咔唑类污染物，进行了发育毒性研究。我们发现，具有最强的类二恶英效应的2，3，6，7-氯代咔唑暴露对经典二恶英毒性通路的激活量较小，但却会对中胚层发育造成较强的抑制。　　综上，本研究将最新的生物技术应用到环境领域，建立了一套新的发育毒理学研究方法，对热点的环境问题进行了研究，得到了有价值的数据，证实了该研究方法在环境毒理学研究方面的能力，并通过方法和研究对象的拓展证实了胚胎干细胞在毒理乃至基础生物学研究中的潜力。

关键词： 人胚胎干细胞   胰岛素分泌细胞   Hi-Lnc70   miR-375  

摘要： 人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)来源于囊胚内细胞团,可以长期维持自我更新,并具有分化形成各种组织细胞的潜能。hESCs在特定条件下可分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs),用于移植治疗Ⅰ型糖尿病,解决临床治疗器官来源不足的问题。MiR-375是胰腺发育和成熟过程中必不可少的转录调控因子,在胰岛β细胞和非β细胞中均有表达,能够提高胰岛素转录水平,促进胰岛β细胞增殖。Hi-Lnc70是在胰岛β细胞发育过程中特异性高表达的lncRNA,影响β细胞形成和生理功能。因此,研究miR-375和Hi-Lnc70在hESCs向IPCs分化过程中的作用,对于提高hESCs向IPCs分化的效率,获得单一表达Insulin的成熟胰岛β细胞具有重要意义。本实验所使用的hESCs向IPCs分化方案包括定形内胚层(Stage I)、原肠(Stage II)、内分泌前体(Stage III)和胰腺内分泌细胞(Stage IV)四个阶段。通过在分化的不同阶段对胰腺发育相关基因和Hi-Lnc70和miR-375的检测,发现在向定形内胚层分化阶段的培养液中添加25 ng/mL wnt3a的方案,能维持细胞良好的生长状态,同时高表达胰腺发育成熟相关基因。同时根据已经发表的人Hi-Lnc70的抑制序列,构建Hi-Lnc70的RNA干扰载体。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的Hi-Lnc70抑制质粒转染,发现瞬时抑制Hi-Lnc70可提高Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表达水平,促进PDX1蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素的合成。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 mimic转染,发现瞬时过表达miR-375,可提高Pdx1、Insulin表达水平并促进PDX1蛋白和胰岛素合成,同时降低Glucagon和Somatostatin表达水平,减少胰高血糖素和生长激素抑制素的合成,进而降低细胞多激素共表达程度。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 inhibitoror转染,发现瞬时抑制miR-375,可降低Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表达水平,减少PDX1蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素的合成。本研究证明在hESCs向IPCs分化过程中抑制Hi-Lnc70和过表达miR-375可提高胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平。提高分化过程中细胞miR-375水平可以降低分化末期细胞多激素共表达程度,促进β细胞成熟和胰岛素合成。抑制miR-375则降低胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平,为深入研究非编码RNA在胰岛发育中的作用提供了新的思路。

关键词： 阿霉素   基因工程   合成生物学   抗癌  

摘要： 阿霉素是一种抗瘤谱极广的抗癌药物,有着较强的心脏毒性,现已提出多种适合方案提高靶向性,减少对正常组织的毒害,被广泛应用于临床治疗癌症。然而在制备方面目前广泛采用的是产率低、成本高、周期长的半化学方法。为了更高效低成本的生产阿霉素,生物合成思路受到广泛地关注。本文主要借助前人对相关基因序列的研究报告,浅析提取纯化相关基因并构建II型聚酮合酶的多基因载体的基因工程方面操作思路。

关键词： 胚胎干细胞   外泌体   衰老   血管再生   骨质疏松  

摘要： 研究背景与目的:衰老和抗衰老一直以来都是研究的关注热点。衰老时机体生物学功能进行性降低,是老年性骨质疏松等衰老相关性疾病的主要危险因素;衰老机体组织损伤后的修复能力也明显受到抑制。研究发现,衰老细胞(senescent cells)在组织器官中的大量堆积是机体衰老发生、发展的主要原因;靶向衰老细胞的治疗是一种防治衰老相关性疾病、促进衰老机体组织损伤后修复的有效措施。干细胞移植具有明显的抗衰老作用,其中胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)因其无限增殖、多向分化潜能和内源性抵抗衰老的特性,有望成为治疗衰老及衰老相关疾病最有前景的候选细胞之一;外泌体(exosomes,exos),作为一种细胞分泌的生物纳米囊泡,是干细胞发挥生物学功能的主要媒介。干细胞来源外泌体已被证实具有促进组织再生等生物学功能,且无成瘤风险、免疫反应低。目前,尚无有关胚胎干细胞来源外泌体(ESC-Exos)治疗衰老及衰老相关疾病的研究报道。本课题通过采用衰老小鼠皮肤压力性溃疡模型和早衰小鼠老年性骨质疏松模型,探究ESC-Exos促进衰老组织创面修复、防治老年性骨质疏松的作用及相关机制。研究内容和方法:1、构建D-galactose诱导衰老小鼠的皮肤溃疡模型,观察ESC-Exos对衰老小鼠皮肤创面的治疗作用,评估ESC-Exos改善创面内皮细胞衰老、促进血管新生的作用;体外实验探究ESC-Exos改善D-galactose诱导HUVECs衰老模型的抗衰老作用及相关分子机制;2、采用SAMP8早衰小鼠作为老年性骨质疏松的动物模型,在体实验中通过micro CT、骨组织学染色等方法观察ESC-Exos的抗骨质疏松作用;观察不同月龄小鼠BMSCs衰老指标及干性基因的动态变化及ESC-Exos在体治疗后对BMSCs衰老表型和干性基因表达的影响;体外实验通过采用ESC-Exos处理衰老BMSCs,并通过调控Oct4干性基因的表达,明确ESC-Exos改善BMSCs衰老及成骨分化的作用机制。研究结果:1、ESC-Exos通过改善内皮细胞衰老促进衰老小鼠皮肤压力性溃疡的愈合:1)创面大体观、HE和Masson染色结果显示ESC-Exos可以促进衰老小鼠皮肤溃疡的愈合;2)micro CT微血管造影、CD31/α-SMA双染、CD31/P16双染结果证实ESCExos可以促进衰老创面血管新生并改善局部内皮细胞衰老;3)体外实验通过检测不同实验组HUVECs衰老指标、成管能力等指标,证实ESC-Exos可以改善D-galactose诱导的HUVECs衰老,并恢复HUVECs的成管能力,且ESC-Exos改善HUVECs衰老依赖于Nrf2的激活;4)体外实验证实ESC-Exos通过转运mi R-200a,下调Keap1的表达,激活Nrf2,改善衰老;2、ESC-Exos改善骨髓间充质干细胞衰老治疗SAMP8小鼠骨质疏松:1)SAMP8小鼠BMSCs随着小鼠月龄增长,衰老指标表达增加、成骨能力减弱、干性基因表达下降;2)DIR-标记ESC-Exos体内示踪结果显示:外泌体可以分布至骨组织、脾脏等全身多脏器部位;3)micro CT检测、骨组织染色等结果证实ESC-Exos治疗可以明显改善SAMP8小鼠的骨质疏松;4)提取ESC-Exos治疗后SAMP8小鼠BMSCs,通过检测相关指标,证实ESC-Exos可以改善BMSCs衰老、促进成骨分化并上调Oct4的表达;5)体外实验通过干预BMSCs Oct4基因的表达,进一步证实ESC-Exos通过上调Oct4表达、改善BMSCs衰老、促进成骨分化的作用机制。结论:1、胚胎干细胞来源外泌体具有显著的抗衰老作用;2、ESC-Exos通过改善内皮细胞衰老,促进血管新生,加速衰老小鼠皮肤压力性溃疡的愈合;3、ESC-Exos通过上调衰老骨髓间充质干细胞Oct4干性基因表达,改善骨髓间充质干细胞衰老,治疗SAMP8小鼠骨质疏松;4、ESC-Exos有望成为缓解衰老相关疾病的一种新型非细胞治疗技术。

关键词： 猪胚胎干细胞   转录因子   内外源基因   诱导分化  

摘要： 研究背景:Naive状态的胚胎干细胞一直被研究者们认为是真正的胚胎干细胞,然而迄今为止,有蹄类大动物的naive胚胎干细胞始终未能成功建系。最新研究表明,利用携带转录因子的慢病毒载体转染猪的囊胚内细胞团,然后将内细胞团接种于含2i(CHIR99021和PD0325901)的LIF培养液中,可以获得猪类naive胚胎干细胞,然而这样获得的猪类naive胚胎干细胞由于来源于可能携带不同拷贝外源转录因子的不同的卵裂球,而不具有均一性。本实验室此前将经典的鼠源多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc(mOSKM)表达载体通过核转染技术转入猪胎儿成纤维细胞(PEF),再通过体细胞克隆技术获得胚胎,并将其内细胞团接种于含3i(CHIR99021,PD0325901,SB431542)的LIF培养液中,成功建立了猪naive-like胚胎干细胞系,但尚未对所建细胞系的内外源转录因子的表达进行较为系统的研究。目前关于猪多潜能干细胞定向分化为神经细胞鲜有报道,猪多潜能干细胞体外诱导神经细胞的分化缺少相关文献支持,因而尚无确切的猪胚胎干细胞定向分化诱导为神经细胞的方法。此外,猪类胚胎干细胞体外诱导分化为中胚层的方法尚无确定的标准,关于人和鼠胚胎干细胞向中胚层谱系类肾细胞分化的研究方法主要有特定诱导因子定向诱导分化、肾细胞共培养诱导胚胎干细胞分化和经拟胚体途径定向分化等策略。本研究利用本实验室所建立的猪naive-like胚胎干细胞系,在对其干细胞特性进行进一步鉴定和验证的基础上,研究了外源转录因子对内源Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc启动表达的影响及猪naive-like胚胎干细胞体外定向分化的能力,为获得主要内源转录因子全面启动的猪胚胎干细胞以及猪多能干细胞体外定向分化方法的建立提供参考。研究目的:鉴定猪naive-like多能干细胞内外源多能基因的表达情况;研究猪naive-like胚胎干细胞向外胚层谱系神经前体细胞和中胚层谱系肾前体细胞分化的能力。研究方法:对已建立的猪naive-like胚胎干细胞系进行多能因子免疫荧光染色,并通过Q-PCR和免疫荧光染色鉴定细胞系特征;所建立的1、4号细胞系经去除DOX培养后,提取细胞系总RNA,反转录为cDNA,设计Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc引物进行RT-PCR后切胶回收,转化涂板挑克隆后送测序,通过对比内外源克隆占比了解细胞系在去除DOX培养后内外源基因的表达变化程度;利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经前体细胞,通过RT-PCR和Q-PCR对其进行神经特异性基因表达鉴定,同时检测分化后的细胞是否已经丧失多能性,通过Western Blot和细胞免疫荧光检测神经标志物Nf-l、βIII-Tubulin的表达水平;利用小分子BMP4、Activin A、CHIR99021、FGF9、Herparin和RA,采用三步法,获得肾前体细胞,通过RT-PCR和Q-PCR对其进行肾特异性基因表达鉴定,并通过Western Blot和免疫荧光检测肾细胞标志物WT-1的表达量。研究结果:对猪naive-like胚胎干细胞系进行多能因子免疫荧光染色,结果显示Oct4、Sox2在细胞中基因高表达,通过Q-PCR证明naive-like状态的细胞与primed状态相比Xist基因表达要低,且在雌性细胞系中,通过细胞免疫荧光发现primed状态的有巴氏小体存在,而naive-like状态的几乎没有巴氏小体存在,证明获得的naive-like ESCs更趋近于naive状态;去除DOX培养1号和4号猪naive-like胚胎干细胞系,通过TA克隆测序发现1号细胞系在去除DOX之前内源OSKM四个转录因子均有所表达,内源表达量分别占总表达量的3.2%、35.0%、9.4%和9.5%,去除DOX后,内源Sox2和c-Myc的表达分别提高至78.3%和21.7%,而内源Oct4和c-Myc未见提高。4号细胞系在DOX存在的情况下,只有内源Sox2有所启动表达,占比为10.0%,在去除DOX之后,内源Sox2的表达最高达到100%,而内源Oct4、Klf4和c-Myc均未启动表达。通过小分子诱导分化所得到的神经前体细胞具有明显的神经细胞结构特征,RT-PCR显示分化后的神经前体细胞表达多种神经细胞特异性基因,Q-PCR结果显示分化后多能因子的表达显著降低,神经特异性基因表达显著升高。免疫荧光染色结果和Western Blot显示细胞表达神经标志物βIII-Tubulin和Nf-l。利用小分子先将猪naive-like胚胎干细胞诱导至中间中胚层,再通过不同的小分子组合将中间中胚层细胞诱导为肾前体细胞,RT-PCR和Q-PCR鉴定结果表明分化细