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关键词： 炎症性肠病   人孤雌胚胎干细胞   诱导分化   限定性内胚层   肠上皮干细胞  

摘要： 背景:炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组肠道炎症疾病,病程迁延反复,严重影响了患者的生活质量。IBD的发病机制还没有彻底研究清楚,目前认为由多因素之间相互作用造成的,主要包括环境、感染、遗传、免疫等因素。IBD是当今临床治疗的一个重大医学难题,目前仍然缺乏有效的治疗措施。随着再生医学的兴起,干细胞疗法起着越来越重要的作用。人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)在分化能力上和胚胎干细胞类似,具有分化的全能性,且避免了伦理道德的争议,在IBD的治疗中有着很大的潜力。本实验研究的是人孤雌胚胎干细胞向肠上皮干细胞(intestinal epithelial stem cells,IESCs)分化的过程。目的:对hPESCs体外定向诱导分化为IESCs的可行性进行初步探索,为IBD患者提供一条更加切实可行的治疗手段。方法:1)建立hPESCs/MEF、hPESCs/hFF、hPESCs/3T3-L1三种体外培养体系,通过形态学观察和碱性磷酸酶法检测hPESCs能否稳定生长并保持未分化状态。2)使用诱导因子Activin A诱导hPESCs向限定性内胚层(definitive endoderm,DE)分化。通过检测Sox17、Gsc和E-Cad的表达来判断诱导细胞是否转化为DE。3)使用表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导DE向IESCs分化。通过检测Musashi1和Hes1的表达来判断诱导DE细胞是否转化为IESCs。结果:1)hPESCs在hPESCs/MEF、hPESCs/hFF、hPESCs/3T3-L1三种培养体系中生长状态良好。在经过超过60代的体外培养之后,仍能保持未分化的状态。2)DE标记物Sox17、Gsc和E-Cad在诱导组的表达显著高于对照组,在第4d的表达量达到峰值。3)IESCs标记物Musashi1和Hes1在诱导组的表达量显著高对照组,在第5d的表达量达到了峰值。结论:1)hPESCs/MEF、hPESCs/hFF、hPESCs/3T3-L1三种培养体系可有效扩增hPESCs并维持其未分化状态。2)Activin A可成功诱导hPESCs分化DE。3)EGF可成功诱导DE分化为IESCs。4)经分阶段诱导法,成功将hPESCs向IESCs发生分化。

关键词： 基因治疗   动物医学   应用   治疗作用   基因工程   细胞  

摘要： 借助基因治疗方法,能够将发挥治疗作用的基因或是借助相应的操作将其导进靶细胞,从而可以对基因所存在的缺陷予以纠正,其所发挥的作用是有目共睹的.第一例成功的基因治疗案例发生于 1990 年,这使得基因工程治疗从理想变为现实,而且现阶段的基因治疗受到的关注程度在不断提高.

关键词： 视黄酸   胚胎干细胞   心肌分化   心肌成熟  

摘要： 心血管疾病严重威胁着人类健康,其死亡率已跃居疾病死亡原因的首位。因此,亟需找到有效的治疗方式。胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有无限增殖、多向分化潜能等特征,因此在再生医学领域具有巨大的潜力。利用胚胎干细胞诱导的心肌细胞,可应用于疾病模型诊断、药物筛选和心肌修复,作为潜在的高效细胞治疗手段,其具有非常广阔的应用前景。然而,利用人胚胎干细胞诱导产生的心肌细胞(Human embryonic stem cell derived cardiomyocytes,hESC-CMs),还存在心肌分化效率低、亚型不均一以及心肌细胞成熟度低等问题。视黄酸(Retinoic acid,RA)信号通路在心脏发育过程中具有多重作用。前期数据结果表明,与视黄酸合成相关的基因Stra6在老鼠发育的中胚层特异性表达。在此基础上,我们首先采用人的心肌细胞定向分化系统,研究显示STRA6在中胚层和跳动后均高表达,表明其在中胚层和心肌成熟过程中可能发挥重要作用。因此,本课题系统的研究了视黄酸在心肌分化和成熟过程中的作用,为干细胞的临床转化应用提供了新的方法。我们通过在心肌分化过程中的不同时间段进行RA处理,系统地研究了RA通路在心肌分化和成熟过程中的作用。利用实时荧光定量PCR发现,视黄酸在第2-4天处理能显著的促进侧板中胚层的分化,进而促进下游谱系心肌细胞的特异性基因TNNT2,NKX2.5和MYH6的表达。流式细胞术结果表明,视黄酸处理后的心肌细胞比例显著提高;同时,心房肌标志分子MYL7和SLN明显增加,表明RA主要促进心房肌细胞的分化。为了研究RA对心肌细胞成熟的作用,我们通过代谢筛选的方法对定向分化的心肌细胞,进行了纯化,然后在不同时间段添加视黄酸。结果表明,与心肌细胞结构性成熟有关的基因表达显著上调。我们通过免疫荧光、膜片钳和能量代谢的实验方法分别从结构、电生理和代谢这三个方面揭示视黄酸处理能诱导心肌成熟。实验结果表明,视黄酸在心肌跳动后的第15-20天处理显著的增加细胞面积、肌小节的长度、多核率和线粒体拷贝数。在电生理水平上,膜片钳结果表明视黄酸处理后的心肌细胞的APD50、APD90明显提高。更重要地,视黄酸处理后的心肌细胞的糖酵解能力下降,线粒体氧化磷酸化水平增加,同时能更加有效的利用脂肪酸和丙酮酸作为能量来源。上述研究结果表明,在心肌分化的早期时间窗(第2-4天)进行视黄酸处理,能够促进侧板中胚层的分化,进而提高心肌细胞的分化效率;在心肌跳动之后的第15-20天进行视黄酸处理,能有效的促进心肌细胞的结构、电生理和代谢成熟。视黄酸在心肌分化过程中的作用为心肌细胞的分化效率和心肌质量的提高提供了新的思路。

ISBN: (数字)9786158122290 ISBN: (纸本)9786158122283

摘要： The Bioethics of the "Crazy Ape" collects a wide range of bioethical topics. Bioethical questions are eternal by nature, although our technologized times transform old issues in forms never before experienced. Just like the famous scientist Albert Szent-Gyorgyi believed in his time, we also believe that all the contributing authors recognised their moral responsibility in adding new approaches to the continuum of each debate. Although this responsibility has became increasingly complex, we must avoid to become barriers of the scientific development. Bioethics as an applied field of philosophy should always try to establish a framework for a sustainable world: in daily clinical practice, in cases of human experiments, and (not least) in the natural environment.

关键词： 案例教学法   传统教学法   课程教学  

摘要： 以科研案例推动基因工程课程教学可提高学生的参与热情、积极性和思考能力,有利于学生对知识点的掌握及综合能力的,从而提高了课程的教学质量。

关键词： 科学史   驱动   生物学   课堂活动  

摘要： 生物学的发展实质是科学史的发展。以生物学经典研究过程与发现成果为材料开展课堂活动,符合学生认知发展规律,有利于学生生物学概念的形成。笔者在"工具酶的发现和基因工程的诞生"这一节的教学活动设计中,以科学史作为驱动,开展小组讨论、模型构建等课堂活动,激发学生的学习兴趣,发展学生生物学核心素养。

关键词： R6-feeder   E1.5-derived sES   E3.5-derived ES   ESCs   多能性  

摘要： 小鼠ES细胞是生物医学研究中不可或缺的工具,为了更高效、拿到更好的干细胞系,研究者一直在不断尝试利用不同的培养体系,建立比囊胚更早期的胚胎干细胞系。目前已有研究从桑椹胚甚至最早从4-cell时期建立胚胎干细胞系,并且可以表达更强的全能性。但是目前没有任何关于2-cell时期ES细胞系建立的报道。Xist基因已经被证实为XCI的关键调控因子,Xist基因的高表达与X染色体失活呈正相关。研究表明利用结合于Xist第一内含子区的抑制性Tale-dTF R6显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)向iPSC的诱导效率以及SCNT的效率和多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达,基于这些优良特性,猜想R6-feeder是否可以建立比4-cell时期更早且全能性更高的ES细胞系。本研究利用Xist Tale抑制性转录因子R6转染MEF制成R6-MEF细胞系,筛选出高表达多能基因的R6-MEF细胞系,运用EDU test和Trypan Blue的双重验证,寻找将R6-MEF制成R6-feeder的最适MMC浓度,之后成功制备R6-feeder。以传统STO-feeder为对照,在R6-feeder上用2i/LIF培养液建立高效率的E3.5-derived ES干细胞并进行初步多能性鉴定,之后成功建立E1.5-derived干细胞系并进行初步多能性鉴定,最后对E1.5-derived干细胞系进行扩展多能性鉴定。此外,首次成功建立了E1.5-derived细胞系,并从分子水平、蛋白水平和发育潜能等方面检测所获得细胞系的多能性。1.利用R6-feeder建立E3.5-derived和E1.5-derived的胚胎干细胞系通过筛选将R6-MEF细胞系制成R6-feeder。在R6-feeder上建立E3.5-derived和E1.5-derived细胞系,通过观察其细胞形态学变化、检测细胞生长、染色体核型、免疫荧光、实时荧光定量PCR和体内畸胎瘤分化能力等一系列实验结果,发现利用R6-feeder建立的E1.5-derived胚胎干细胞系(2-cell全胚胎细胞系简称为E1.5-derived ES,2-cell单卵裂球胚胎细胞系简称为E1.5-derived sES)细胞系除具有传统ESCs(STO-feeder建立)的基本特性外,在多能性鉴定方面还具有略优于传统小鼠ESCs的特征。2.获得细胞系的多能性检测与传统STO-feeder建立的ESCs相比,R6-feeder建立的E3.5-derived和E1.5-derived细胞系在一些方面显示出基本的特性:干细胞系克隆形态都呈典型的干细胞形态;碱性磷酸酶染色都呈强阳性;细胞染色体数目未发生异常;多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Klf4的表达水平相似;与传统的STO-feeder建立的ESCs相比,E1.5-derived ES细胞系增殖速度更快;E1.5-derived ES细胞系分化基因c-Myc、Sox17、Sox17的表达低于ESCs;E1.5-derived sES细胞系特异性高表达2-cell基因Tcstv1、Tcstv3。3.获得细胞系的发育潜能检测畸胎瘤实验结果显示,E1.5-derived sES细胞具备分化形成三胚层组织的能力;通过制备嵌合体,证明E1.5-derived sES细胞系到囊胚时能贡献ICM和TE部分。更重要的是与ESCs和EPSC细胞系相比,E1.5-derived sES细胞对E6.5嵌合体的胚胎外胚层、胚外外胚层、外胎盘锥和原始内胚层都有贡献。综上所述,与传统STO-feeder建立的ESCs和8-cell胚胎来源的EPSC细胞系相比,本实验新型R6-feeder高效建立E3.5-derived细胞系,且首次成功建立E1.5-derived ES和sES细胞系。在基因表达水平和发育潜能等方面,E1.5-derived ES和sES细胞系具有高发育潜能,是一种比4-cell更早的ES细胞系。但是关于R6-feeder建立早期胚胎干细胞的机理仍需进一步研究。

关键词： 基底   性能   胚胎干细胞   影响  

摘要： 胚胎干细胞(ESCs)是具有多能性、可以实现自我更新的细胞。细胞外基质的性质对干细胞命运的影响受到越来越多的关注。基底材料的弹性及曲率对胚胎干细胞体外培养有很大影响。DNA甲基化是一个调节基因的表达的主要机制。探究胚胎干细胞体外培养影响因素多用到甲叉双丙烯酰胺凝胶和聚二甲基硅氧烷(PDMS)两种材料做基底。用甲叉双丙烯酰胺凝胶制得不同弹性的基底材料,培养胚胎干细胞发现,软基底能够使胚胎干细胞的DNA甲基化水平维持在一个较低的水平,与此相反,硬基底则使其显著提高。这可能与细胞微丝骨架和粘附有关。探究PDMS表面曲率的改变能够影响小鼠胚胎干细胞的多能性维持的影响,制作了不同曲率的培养基质培养小鼠胚胎干细胞,观察细胞的生物学形态,并通过免疫荧光和碱性磷酸酶染色,检测胚胎干细胞的多能性。发现与平面基底相比,凹面基底和凸面基底均会对胚胎干细胞的多能性维持有积极影响,能够有助于维持多能性,但凹面基底效果更好。这对胚胎干细胞的研究和临床应用有重要意义。

关键词： 自噬   SNARE蛋白   胚胎干细胞   多能性  

摘要： 细胞自噬是真核生物体内一种高度保守的代谢途径,在降解长寿命蛋白质、清除受损细胞器、维持细胞内环境稳态方面起着至关重要的作用。细胞自噬大致可以分为以下三种:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬,本文主要介绍的为巨自噬。细胞自噬的过程包括:自噬体的形成、自噬体的成熟和内容物降解、溶酶体的再生。其中,在自噬体成熟阶段有众多蛋白的参与,本课题主要围绕SNARE蛋白中的Snap29、Stx17、Vamp8展开研究。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)因其具有发育上的多能性及较强的自我更新能力,受到了越来越多的关注。ESCs多能性维持受到多种转录因子的调控,其中以Oct4、Nanog、Sox2为主要代表。Oct4、Nanog、Sox2的缺失都会破坏ESCs的稳定性。关于ESCs中的自噬,目前已有研究报道参与自噬体形成的关键因子Atg3、ULK1等在小鼠ESCs多能性的维持中发挥着重要的作用,但是,自噬特异性SNARE蛋白对ESCs的作用还不曾有报道,自噬调节ESCs多能性的具体机制仍有待研究。那么,ESCs多能性基因的表达是否会受到细胞SNARE蛋白的影响?针对这一问题,我们对自噬性SNARE蛋白在ESCs多能性基因表达维持中的作用进行了初步探究。为此,我们进行了如下操作:首先,设计并合成Vamp8、Stx17和Snap29的siRNA引物,通过转染的方式使siRNA进入小鼠ESCs,对ESCs中特定基因产生敲低表达的效果,在确定SNARE中特定基因被敲低后再研究对小鼠ESCs中关键多能基因表达的影响;其次,通过CRISPR/Cas9对小鼠ESCs中的Vamp8、Stx17、Snap29基因进行敲除。试验前期,我们进行sgRNA的设计与合成、将sgRNA与含Cas基因的载体进行连接、通过慢病毒包装的方式使其进入ESCs,利用生物体内部的修复机制,实现对特定基因的敲除;最后,我们在得到稳定敲除的细胞系后研究其对ESCs多能性基因的表达、细胞周期和细胞凋亡产生的影响。在此过程中,主要应用实时荧光定量 PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、免疫印迹(western blot,WB)和流式细胞术进行试验。本研究的试验结果显示:(1)设计合成的siRNA可以对Snap29、Stx17和Vamp8产生降低其表达的效果,但是上述三种SNARE表达量降低后,多能性基因Oct4、Nanog和Sox2的表达并没有发生明显变化;(2)在利用CRISPR/Cas9技术分别敲除Snap29、Stx17、Vamp8的过程中,经过大量克隆挑选试验,最终只拿到了稳定敲除Snap29的小鼠ESCs细胞系;(3)利用敲除Snap29的稳定细胞系对小鼠ESCs多能性基因表达、细胞周期及细胞凋亡进行研究,从目前的结果显示,Snap29的敲除没有显著改变小鼠ESCs中Oct4、Nanog、Sox2多能基因的表达,此外敲除Snap29后小鼠ESCs的细胞周期和细胞凋亡也没有出现明显变化。综上:我们通过siRNA干扰Vamp8、Stx17及Snap29后发现小鼠ESCs中关键多能基因的表达并未受到显著影响;通过CRISPR/Cas9敲除Snap29后也不显著影响ESCs中关键多能基因的表达;敲除Snap29的小鼠ESCs的细胞周期和细胞凋亡也没有发生明显变化。但SNARE蛋白对于ESCs多能性的影响,尤其是对其发育潜能的调控,还有待深入研究。

关键词： 全氟辛烷磺酸   胚胎干细胞   心肌分化   自噬   线粒体  

摘要： 研究背景:全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate,PFOS)是一种八碳全氟有机化合物,在环境中分布极广,能通过生物富集的作用在生物体内累积并引起各类组织毒性。由于PFOS能够通过胎盘屏障,因此也具有发育毒性。研究表明斑马鱼胚胎发育期暴露PFOS可引起心率改变、孵化率下降。大鼠在胚胎发育期暴露PFOS会引起心脏发育损伤。目前关于PFOS的心脏发育毒性研究仍处于初始阶段,其引起的心肌发育毒性作用机制亟需在代表性强的模型中进一步阐明。胚胎干(embryonic stem,ES)细胞在体外能定向诱导分化为心肌细胞,该模型能够用于研究药物及环境毒物可能具有的心肌发育毒性。课题组前期利用该模型论证了 PFOS对小鼠ES细胞定向分化心肌细胞具有抑制作用,心肌发育毒性等级为二级,其毒性作用主要与引起线粒体功能损伤相关。同时透射电镜观察发现,PFOS会引起ES细胞衍生心肌细胞(embryonic stem cell-derived cardiomyocytes,ESC-CMs)线粒体内嵴肿胀,且细胞内自噬体增加。研究表明,自噬与哺乳动物胚胎发育及分化密切相关。线粒体依赖的能量通路是启动ES细胞定向心肌分化的关键调控者,而自噬参与线粒体功能的维持,但自噬与PFOS所致心肌发育毒性及线粒体损伤作用之间的关系尚不明确。基于课题组前期的研究结果,本研究拟进一步探索PFOS对心肌分化过程中自噬体形成和自噬降解通路的影响,着重探讨自噬-溶酶体通路在PFOS致心肌细胞线粒体损伤中的作用,为深入揭示PFOS致心肌发育毒性的机制提供实验依据。同时有利于将EST体系作为一种研究药物和环境毒物发育毒性的动物替代实验方法推广应用。研究目的:探索PFOS抑制自噬-溶酶体通路致小鼠ES细胞衍生心肌细胞损伤的机制,为深入揭示PFOS对心肌发育毒性作用敏感靶标提供实验依据。研究方法和结果:1 PFOS抑制小鼠ES细胞分化心肌细胞并引起自噬体增加通过“悬滴-贴壁”培养方法建立小鼠ES细胞体外分化心肌细胞模型,分化全程给予40 μM PFOS处理。发现PFOS在40 μM浓度下显著降低ES细胞定向心肌细胞分化率,肌小节结构蛋白α-Actinin表达较溶剂对照组也显著减少。透射电镜结果显示,溶剂对照组ES细胞分化而来的细胞线粒体轮廓清晰、内嵴结构完整,而PFOS处理组细胞中线粒体轮廓不清晰、内嵴发生肿胀甚至出现空泡,同时细胞中自噬体明显增加。PFOS处理组ESC-CMs线粒体膜电位下降,ATP产量较溶剂对照组也显著降低。2 PFOS引起心肌分化过程中自噬流抑制Western-blot结果显示,ES细胞分化心肌细胞过程中自噬起始复合物蛋白Beclin 1和自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达水平持续上调。PFOS处理对Beclin 1表达水平无影响,但显著增加LC3-Ⅱ的水平,且引起自噬性降解底物p62蛋白水平升高,依赖自噬进行降解的高分子量泛素化结合蛋白水平也显著增加。加入氯喹阻断自噬流后再对LC3转换进行检测,发现PFOS引起的LC3-Ⅱ增加是由于LC3-Ⅱ降解减少所致。利用RFP-GFP-LC3融合蛋白在共聚焦显微镜下对自噬流进行观测,发现PFOS引起心肌细胞内自噬降解抑制。提示ES细胞心肌分化过程中自噬活性增强,PFOS致ES细胞定向心肌分化过程中自噬流抑制。3 PFOS引起ESC-CMs线粒体自噬降解受阻以及线粒体生物生成减少Western-blot结果显示,PFOS处理引起线粒体自噬相关蛋白Parkin向线粒体定位增加。免疫荧光结果显示,PFOS引起心肌细胞中LC3和p62在线粒体外膜上累积。PFOS处理组中线粒体生物发生的主导协调因子PGC-1α和线粒体膜蛋白Tomm20表达较溶剂对照组均显著下降。利用免疫荧光方法对Tomm20表达及分布进行检测,发现PFOS处理组中Tomm20含量较对照组显著减少。提示PFOS抑制线粒体自噬降解,同时引起心肌分化过程中线粒体生成减少。4 PFOS干预自噬-溶酶体通路抑制自噬流从而影响心肌分化和线粒体功能利用RFP-LC3融合蛋白标记自噬体,LysoTracker染料标记溶酶体,在激光共聚焦显微镜下观察自噬体与溶酶体的融合,发现PFOS处理组自噬体与溶酶体的融合受阻。Western-blot结果显示PFOS处理组中溶酶体膜蛋白Lamp1较对照组无差异,但可引起Lamp2a表达减少,组织蛋白酶Cathepsin D成熟体形式水平显著下降。PFOS处理组中溶酶体酸性显著下降。免疫荧光结果显示,PFOS处理组没有出现Cathepsin D泄露出溶酶体,即PFOS没有引起溶酶体膜通透化。PP242能够诱导溶酶体的生成并改善溶酶体功能。加入PP242与PFOS共处理后,发现溶酶体酸性提高,自噬降解通畅,线粒体膜电位以及细胞内ATP