教学课程资源库 更多>>

关键词： 体细胞核移植   转录组测序   全基因组甲基化测序   组蛋白甲基化   猪  

摘要： 体细胞克隆又称体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT),是家畜优良种质高效扩繁和育种新材料创制的重要手段,在家畜遗传改良上具有重要的应用价值。在猪育种中,利用SCNT技术可以将优秀种公猪个体进行复制扩繁,生产出与供体同样优秀的克隆个体。除此之外,SCNT与转基因或基因编辑技术相结合,可以创制具有优势性状的猪育种新材料。然而,目前猪SCNT效率依然低下,主要原因是体细胞表观遗传重编程不完全,从而导致胚胎发育过程中关键基因异常表达。本研究拟揭示猪克隆胚胎早期发育异常的分子机理,寻找导致猪克隆胚胎早期发育被阻滞的关键基因,探索提高猪克隆效率的新方法。本研究采用单细胞转录组测序技术,构建了猪克隆与体内受精胚胎在7个连续发育阶段(卵母细胞、1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚期)的基因表达图谱,发现猪胚胎基因组激活主要发生在2-细胞至8-细胞阶段;鉴定到多个导致猪克隆胚胎发育异常的候选基因,其中TET1、DRAP1是影响猪体外成熟卵母细胞发育潜能的关键基因,KLF17、OLIG3、ZFP37、ZFP42是影响克隆猪4-细胞胚胎基因组激活的关键基因;通过比较猪克隆和体内受精胚胎的H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3相关组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶基因表达变化模式,发现KDM4A、KDM4D和KDM5B在4-细胞克隆胚胎中异常低表达,KMT2A、SUV39H2在8-细胞克隆胚胎中异常高表达,这些基因表达异常可能是导致猪克隆胚胎的组蛋白修饰异常的重要原因。本研究进一步采用单细胞全基因组甲基化测序技术,构建了猪4-细胞和8-细胞的克隆与体内受精胚胎的单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。通过比较4-细胞期的克隆与体内受精胚胎的甲基化模式,鉴定到7738个差异甲基化区域,其中6403个为高甲基化区域,1335个为低甲基化区域,表明猪4-细胞克隆胚胎中不仅有大量异常的高甲基化区域,而且还有很多异常低甲基化区域;8-细胞期的克隆与体内受精胚胎之间共鉴定出24791个DMRs,其中24014个为高甲基化区域,777个为低甲基化区域,表明猪8-细胞克隆胚胎的DNA甲基化异常主要是存在大量异常高甲基化区域;KEGG通路分析发现4-细胞和8-细胞的克隆与体内受精胚胎的差异甲基化基因主要富集在NF-κB信号通路和氧化磷酸化信号通路中,在细胞分化、增殖和凋亡过程中发挥重要作用。最后,本研究在1-细胞克隆胚胎中过表达KDM4A/KDM5B/KDM6B/USP21/USP29等基因,探索抑制组蛋白甲基化或泛素化水平对猪克隆胚胎发育效率的影响。结果发现同时过表达KDM4A和KDM5B极显著提高囊胚率和囊胚内总细胞数;单独过表达KDM4A、KDM5B或USP29仅极显著提高囊胚内总细胞数,对囊胚率无显著影响;单独过表达USP21、KDM6B对囊胚率和囊胚内总细胞数均无显著影响。利用转录组测序分析发现过表达KDM4A、KDM5B或同时过表达KDM4A和KDM5B均矫正了部分在对照组克隆胚胎中异常的表观遗传修饰相关的功能基因表达,这些基因显著富集在组蛋白赖氨酸代谢通路中。通过免疫荧光染色分析发现过表达KDM4A显著降低2-细胞、4-细胞和8-细胞的克隆胚胎的H3K9me3荧光信号,过表达KDM5B显著降低2-细胞和4-细胞的克隆胚胎的H3K4me3荧光信号,同时过表达KDM4A和KDM5B引起H3K9me3和H3K4me3荧光信号均显著降低。通过联合注射体外合成的KDM4A mRNA和KDM5B mRNA至1-细胞胚胎的方法,使克隆猪的出生效率提高了1.96倍。本研究通过比较猪早期克隆和体内受精胚胎的转录组和DNA甲基化图谱,解析了猪克隆胚胎早期发育的异常模式;通过在猪克隆胚胎中过表达组蛋白去甲基化酶基因KDM4A和KDM5B,显著提高了猪体细胞克隆效率。本研究为进一步理解猪克隆胚胎发育异常提供了重要的理论基础,为提高猪体细胞克隆效率提供了新的思路。

关键词： 胚胎干细胞   分化   胰岛素分泌细胞   miR-328   TGF-β2  

摘要： 目的:构建小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic stem cells,mESCs)体外诱导分化胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs)模型,筛选miR-328作为重要差异表达miRNA的负向调控作用,验证miR-328抑制TGF-β2表达的分子机制及过表达miR-328对胰岛素分泌细胞控制糖尿病小鼠血糖水平的影响,为糖尿病干细胞治疗提供新的表观遗传学调控靶点。方法:(1)构建mESCs体外分化IPCs诱导模型,光镜观察分化各阶段细胞形态,免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测细胞Insulin及C-peptide表达,流式细胞技术(Flow cytometer,FCM)检测Insulin+细胞比例,实时定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测胰岛功能基因表达;(2)构建Agomir miR-328,转染多系前体细胞(Multilineage progenitor cells,MPCs),qRT-PCR检测 miR-328 过表达水平,培养至 21 天 qRT-PCR、FCM、酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunoserbent Assay,ELISA)及IF分别对比实验组、对照组胰岛相关基因表达、Insulin+细胞比例、葡萄糖刺激下胰岛素释放水平及细胞Insulin、Nkx6.1蛋白表达;(3)Agomir miR-328转染MPCs,测序筛选表达差异的mRNA,GO与KEGG分析差异基因的基因功能、富集通路,挑选表达下调基因,qRT-PCR验证mRNA水平;(4)构建siRNA TGF-β2及LVTGF-β2,生信分析预测miR-328与TGF-β2结合位点,双荧光素酶报告系统验证miR-328与TGF-β2 3'-UTR结合关系,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测拮抗实验及回复实验TGF-β2蛋白水平,验证TGF-β2为miR-328下游靶基因;(5)siRNA TGF-β2转染MPCs,WB检测实验组与对照组TGF-β2蛋白表达差异,qRT-PCR检测胰岛发育早期关键基因mRNA表达差异,IF验证细胞内Pdx1蛋白表达差异;(6)经脾动脉持续灌注制备大鼠胰腺脱细胞支架,光镜观察胰腺脱细胞支架形态学改变,扫描电镜检测脱细胞支架超微结构,DNA含量、GAG含量检测脱细胞支架细胞残余与胶原保留情况,IF对比天然胰腺与脱细胞支架Collagen Ⅰ、Fibronectin、Laminin及Collagen Ⅱ蛋白含量;(7)链脲霉素(Streptozocin,STZ)构建1型糖尿病小鼠模型,大鼠胰腺脱细胞支架种植miR-328过表达及对照组IPCs,小鼠背部皮下移植监测过表达组、对照组及正常小鼠空腹尾静脉血糖,IF对比两组细胞Insulin、Somatostatin、Glucagon蛋白表达情况。结果:(1)诱导分化各阶段细胞具有不同光镜形态,分化末期约48.2%的细胞表达Insulin,IPCs与ESCs在胰岛相关功能基因表达上存在显著差别,IPCs共表达Insulin 与 C-peptide;(2)MPCs 转染 Agomir miR-328 培养至 21 天,miR-328 过表达后细胞胰岛相关功能基因及关键转录因子表示下调,Insulin+细胞由43.8%降低至18.3%,胰岛素释放量显著低于对照组、对不同浓度葡萄糖刺激反应无差异,Insulin+/Nkx6.1+细胞比例显著少于对照组;(3)测序结果显示AgmoirmiR-328转染MPCs后18个基因表达下降,65个基因上调,GO分析显示差异基因参与Cell Process、Metabolic Process、Single-organism Process 与 Developmental Process 等生物学过程,KEGG分析显示差异基因参与MAPK、TGF-β等干细胞分化相关通路,qRT-PCR证实干细胞分化相关基因TGF-β2、UNCX、Cphx2等表达变化与测序结果一致;(4)生信分析预测及双荧光素酶报告系统证实miR-328与TGF-β2 3'-UTR存在结合位点,WB证实过表达TGF-β2能够回复miR-328对其的抑制作用,敲降miR-328能够拮抗siRNA对TGF-β2表达的干扰;(5)siRNA TGF-β2转染MPCs,胰腺发育关键转录因子Pdx1蛋白水平下调,Pdx1+细胞生成显著减少,胰岛分化早期关键转录因子mRNA表达下调;(6)大鼠胰腺经脱细胞灌注后透明化,支架保留较完整超微网状结构,DNA定量、GAG含量证实支架符合脱细胞标准且保留较完整胶原,支架保留大部分Collagen Ⅰ、Fibr

关键词： 胚胎发育   胚胎干细胞   逆转录病毒   蒙大拿州立大学   滋养外胚层   原始生殖细胞   帕金森症   细胞命运  

摘要： 雷妮·雷霍·佩拉数十年来致力于研究胚胎发育的时机对健康和疾病的影响。"你知道还有什么比精子和卵子结合后形成一个人更有意思的事情吗?"在2018年7月举行的发育生物学学会年会上,干细胞生物学家雷妮·雷霍·佩拉(Renee Reijo Pera)向数百名科学家发表主题演讲时问道。过去几十年,她主要负责研究与生殖细胞出现相关的

关键词： DNA纳米球   MGISEQ-2000   宏基因组测序  

摘要： 随着人群结构的变化和抗生素的滥用、新发病原体的出现以及耐药细菌的增加,感染性疾病对人类健康的影响日益扩大。根据2019年WHO公布的全球十大健康威胁中,和感染密切相关的疾病占据了60%,包括流感、细菌耐药、埃博拉病毒、登革热、HIV等。然而目前在病原微生物检测领域中仍存在众多无法被准确诊断的危重感染,例如:15%-25%肺炎病例的病因不明确,20%的临床发热病例的病原因不明确。在复杂微生物感染检测方面,以全血和脑脊液样本为例,传统方法对血培养样本的阳性检出率为8-12%,脑脊液样本的阳性率检出率仅为8-10%。传统病原微生物检查包括形态学和血清学两方面,这些检测技术在病原微生物检测领域发挥了重要作用,但同时也存在一些不足,如病原体分离难度大、培养周期长、区分度不高、检测对象仅局限于特定已知的病原体,不能发现新的病原微生物等。而基于病原微生物核酸序列分析的宏基因组测序(Metagenomics Next generation Sequencing,mNGS)不仅可以极大简化检测流程,缩短检测时间,尤其针对传统方法难以鉴定的或新型病原体检测方面具有重大的意义。本研究通过DNA纳米球测序技术建立一套基于国产MGISEQ-2000测序平台的mNGS病原微生物检测流程,通过实验设计完善了样本预处理、DNA提取、文库构建环节的关键技术难点:1)使用0.5mm玻璃珠破壁结合超声打断将部分真菌检测灵敏度提高了10倍;2)使用10μm滤膜结合DNase降低人源背景核酸,提高2倍微生物序列检出;3)调整dNTP和接头使用量提高微起始量样本的一次检测成功率;4)提高测序数据量有助于发现微量病原体,提高检测灵敏度。最后分别采用细菌、真菌标准菌株和病毒阳性血清对照品进行流程灵敏度、重复性和特异性进行验证,并与临床结果比较验证该检测流程的检测准确性。

关键词： 视网膜色素上皮细胞   胚胎干细胞   定向分化   生物安全性  

摘要： 视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium，RPE)在维持视觉功能、支持光感受器功能方面具有极其重要的作用。该细胞在生理结构上位于神经视网膜和脉络膜血管层之间，它的功能紊乱、退化和损失直接影响着相邻的细胞和组织，与年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)和视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa，RP)的发生密切相关。迄今为止，这些眼底疾病在临床上无法得到有效的治疗。随着干细胞的临床研究进展，细胞疗法成为继手术、医疗器械之后的第三类治疗手段，也为一些临床上缺乏常规治疗手段的疾病提供了治疗可能。人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)是具有自我更新能力和多向分化能力的细胞，体外可以无限扩增且在一定条件下可以分化为多种功能细胞类型，近年来也被认为是细胞治疗的最佳种子细胞。2012年就有临床研究结果表明，人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞(Human Embryonic Stem Cell-derived Retinal Pigment Epithelium,hESC-RPE)治疗AMD时，安全且对视力的恢复具有一定的作用。　　但是，之前报道的在进行hESC-RPE的分化或者培养过程中，或者是在hESC-RPE的源头hESCs制备时，往往使用了动物源性成分，这为hESC-RPE的临床应用带来了潜在的污染风险，为大规模制备hESC-RPE带来了高昂的培养成本及批次不稳定的可能。所以，在完全无动物源性成分、Cell Therapy System(CTS)级别的体系下获得hESC-RPE是临床发展的趋势。　　本研究中，我们采用本实验室前期建立的临床级别的人胚胎干细胞系（Q-CTS-hESC-2），该细胞所有的制备均在完全无异源的条件下进行，细胞安全性和质量通过了中国食品药品检定研究院复核。利用这种细胞，我们采用CTS试剂进行hESC-RPE的分化，成功获得hESC-RPE，并对其进行完整的鉴定:细胞形态为多边形，超微结构观察具有黑色素颗粒和微绒毛结构;细胞表达PAX6、ZO-1、BEST1等标记蛋白;通过流式细胞术检测发现细胞不表达OCT4，且99％以上的细胞表达OTX2、MITF、RPE65等RPE的marker;通过对吞噬能力和分泌PEDF能力的测定，发现分化获得的hESC-RPE具有这些能力;通过免疫缺陷小鼠体内注射形成畸胎瘤的实验，证明了分化来源的RPE无成瘤性;同时对分化的源头人胚胎干细胞和分化获得的hESC-RPE细胞进行了染色体数目变异(Chromosome Number Variation，CNV)检测，未检测到细胞染色体拷贝数的改变，也未检测到染色体大片段的缺失或增加，说明我们所使用的分化体系不但能在生物安全性方面更加有保证之外也能很好地维持细胞的染色体稳定性。为了满足临床应用的需求，更好地符合《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》的要求，本研究对制备好的细胞制剂的稳定性做了研究，保证制备好的hESC-RPE在长期冻存后、一定条件的运输过程中、相应注射针头注射后的稳定性。　　同时，为了更好稳定地实现hESC-RPE相关细胞制剂的规模化、商品化生产，也为了通过解析培养体系来更加清楚地研究RPE的生长机制，抛却B27、KOSR而建立成分明确的hESC-RPE培养液显得尤为重要。我们参考现有的B27成分，对此做了分析和优化，经过筛选获得了成分明确的培养体系XCDM，该体系能保证无异源成分的同时也保证了成分的明确，且在该体系下培养的hESC-RPE细胞状态良好，且能长时间地维持细胞形态和特性。从细胞形态、超微结构、染色体核型、相关标记蛋白的表达等方面均符合RPE的特征。

关键词： 医学   生物技术   基因工程  

摘要： 众所周知,生物技术还被称作生物工程,其实在20世纪70年代产生的一种兼具先进性与综合性的应用型的工程。生物技术把医学以及生物学理论基础但是工作框架,把现代化的科学技术当作实践工具,促使人们能够生产出可以实现某种目的或者所需药品。自从生物技术出现之后,给人们生活带来很大便利,同时也给人类生活带来巨大影响,还对不少领域产生深远影响,特别是对医学领域产生了深远影响。当前,在医学领域之中,生物技术有着全面并且广泛的运用,其能够对人体疾病加以治疗,进而达到与人体生长实际需要相适应的平衡状态。本文在对几种生物技术加以介绍的基础上,对医学领域生物技术的具体应用加以探究,以期对生物技术进行深入了解。

关键词： 牛奶过敏   Bos d 5   表位   特异性脱敏治疗   基因工程   生物信息学  

摘要： 目的:食物过敏是常见的过敏反应,特异性脱敏治疗是从过敏性疾病的病因入手,改变过敏原进入体内后的反应进程而进行的治疗手段。随着抗原表位认识的深入,分子诊断和生物技术手段的发展,特异性脱敏治疗已进入耐受原精细化阶段。牛奶是常见的食物过敏原,Bos d 5是其重要的过敏组分。本课题以牛奶过敏组分Bos d 5为研究对象,分析其抗原表位,经设计构建和生物预测,得到最终的耐受原分子B5M氨基酸序列,利用原核系统表达得到B5M纯化蛋白分子。经过敏原性和免疫原性分析,初步证明其过敏原性降低,免疫原性保留,可作为牛奶过敏单组份脱敏治疗的备选疫苗分子,并为食物过敏特异性脱敏治疗提供新思路和新方法。方法:1.耐受原分子B5M的设计构建由文献和NCBI网站查得Bos d 5氨基酸序列和关键表位,以破坏其构象表位同时保留T细胞表位为原则,设计得到备选耐受原分子B5M的若干氨基酸序列,利用生物信息学在线预测网站和预测软件进行亲水性,二级结构和抗原性分析,优选出最优耐受原分子B5M氨基酸序列。2.耐受原分子B5M的制备根据得到的B5M氨基酸序列,我们进行基因合成,质粒构建,利用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达,经包涵体处理和亲和纯化后,最终得到B5M蛋白。3.耐受原分子B5M的生物活性分析B5M的过敏原性分析是利用斑点印迹实验(Dot-blot)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分析制备得到的耐受原B5M与血清中游离的Bos d 5特异性IgE的结合能力;同时利用血清致敏嗜碱性粒细胞激活试验(IgE-BAT)验证B5M与嗜碱性粒细胞表面受体上特异性IgE的结合能力。B5M的免疫原性分析是利用B5M和重组Bos d 5分别免疫家兔得抗血清。ELISA抑制实验验证耐受原分子B5M抗血清抑制过敏原Bos d 5与血清中游离特异性IgE结合的能力。BAT抑制实验验证B5M抗血清抑制过敏原Bos d 5与细胞表面受体上特异性IgE结合的能力。T细胞增殖试验验证B5M是否保留了野生型过敏原的T细胞表位。利用MTT法进行此部分实验。结果:1.耐受原分子B5M设计构建对Bos d 5进行表位分析,设计构建得到若干备选蛋白分子,经生物信息学预测其亲水性,抗原性及二级结构变化,筛选得到耐受原B5M的氨基酸序列。2.耐受原分子B5M的制备经原核表达和亲和纯化,得到B5M蛋白分子,其分子量约为52 kDa。圆二色谱分析证明B5M二级结构与过敏原Bos d 5相比发生明显变化,并且二硫键消失。3.耐受原分子B5M生物活性分析B5M过敏原性分析:Dot-blot实验证明耐受原分子B5M与过敏患者血清中游离特异性IgE的结合能力下降,10例血清均未显色;ELISA结果证明B5M与20例牛奶过敏患者血清中游离特异性IgE的结合能力下降到67.84%-45.48%之间,平均值为58.22%。IgE-BAT实验证明不同浓度的耐受原B5M(0.001-10 ng/ml)与分别用4例牛奶过敏患者血清提前致敏的嗜碱性粒细胞表面受体上的特异性IgE的结合引起嗜碱性粒细胞激活指数与不同浓度的重组Bos d 5的刺激指数相比,明显下降(p<0.05)。本部分实验证明耐受原分子B5M过敏原性较Bos d 5降低。B5M免疫原性分析:重组Bos d 5和耐受原分子B5M免疫家兔得到相应的抗血清。ELISA抑制实验证明耐受原分子B5M家兔抗血清可抑制过敏患者血清游离特异性IgE与过敏原Bos d 5的结合,结果证明耐受原分子B5M抗血清抑制血清特异性IgE与过敏原结合的抑制率在51.53%-75.43%之间,重组Bos d 5抑制率在42.24%-66.67%之间,二者间没有统计学差异。BAT抑制实验证明耐受原分子B5M和重组Bos d 5家兔抗血清均可抑制嗜碱性粒细胞表面受体上的IgE与过敏原Bos d 5的结合。B5M T细胞表位完整性分析:MTT实验证明与重组Bos d 5相比,耐受原B5M保留了原过敏原的T细胞表位,为体内保护性抗体的产生提供了前提条件。结论:本课题以牛奶过敏原Bos d 5为研究对象,设计构建耐受原分子B5M进行牛奶单组分特异性脱敏治疗的研究。经设计构建,生物信息预测得到B5M的氨基酸序列。经表达纯化得到耐受原蛋白分子。经生物活性分析,证明B5M过敏原性降低,免疫原性保留。故B5M可作为牛奶过敏单组分特异性脱敏治疗的候选分子,为食物过敏特异性脱敏治疗提供理论支持。

关键词： 铁蛋白   纳米笼   药物递送   二甲双胍   骨关节炎  

摘要： 目的:用于治疗骨关节炎(OA)的关节内(IA)药物递送受到药物渗透软骨不足和在关节中保留时间过短的限制,很大程度上是因为载体过大和在酸性环境中的特异性靶向性差。本课题提出了一种仿生方法来开发智能生物响应铁蛋白纳米笼,其由内载二甲双胍(Met)和表面暴露的软骨靶向肽组成。研究了工程化铁蛋白纳米笼通过靶向软骨在炎症环境释放药物治疗骨关节炎,为克服IA药物递送和OA靶向治疗的这些关键问题提供新的可能。方法:第一部分:首先构建CT/Fn纳米载体,再对蛋白进行提取与纯化。对其相关的表征进行考察:采用SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白亚基分子量进行验证;透射电镜拍照,观察CT-Fn纳米笼的形态以及分布;通过Zetasizer分析仪考察载体平均直径与电位;紫外分光光度计进行全波长扫描观察紫外吸收变化;根据铁蛋白的自组装性质进行载药,HPLC对载药系统的载药量进行测定;最后透析袋法模拟体内环境进行体外释放相关实验。第二部分:首先采用IL-1β处理小鼠软骨细胞作为体外OA模型,通过CCK8检测载体的毒性,接着纳米笼用cy5.5标记以跟踪其细胞摄取,并且通过免疫荧光测定检测CT-Fn的靶标,Ⅱ型胶原的分布。随后采用CCK-8,FDA/PI染色对细胞活力进行检测;PCR,免疫荧光检测相关炎症基因的表达。第三部分:通过小动物成像系统观察cy5.5标记的纳米笼在小鼠关节内的滞留时间,HPLC检测关节软骨及关节液中的药物浓度。采用关节腔内注射木瓜蛋白酶诱导小鼠关节炎模型,模型建立成功后关节腔注射CT-Fn/Met载药系统,并设置相关对照组。在第2周和第6周对小鼠关节进行取材和收样。将小鼠膝关节股骨和胫骨拍照和大体评分,用多聚甲醛固定后对样品包埋切片,HE染色,番红固绿染色和免疫组化染色观察关节修复情况。结果:第一部分:我们成功将软骨靶向肽(WRYGRL)连接至铁蛋白各个亚基表面且CT-Fn为均匀分布的球形纳米笼。CT-Fn纳米笼中直径约20nm,Zeta电位为-25.65±2.13 mV,载药量为20.46%。体外释放实验中,CT-Fn/Met在酸性环境(pH=6.0)中的药物释放量显著高于中性环境(pH=7.4)。第二部分:体外细胞毒性试验结果表明,CT-Fn处理的软骨细胞浓度在25～100μg/mL之间几乎没有毒性作用。与Fn/Met相比,软骨细胞对CT-Fn/Met显示更高的细胞摄取并定位于细胞外基质中的Ⅱ型胶原。在体外炎症研究中,我们发现CT-Fn/Met可明显抑制IL-1β诱导的炎症反应,增强软骨细胞活力,降低炎症相关因子MMP-1,MMP-13和IL-6的表达,以及增加Col-Ⅱ的表达。第三部分:在小鼠的关节炎模型中,CT-Fn/Met可在关节腔内停留长达3周的时间而没有修饰的Fn/Met的停留时间为2周。同时,注射CT-Fn/Met的小鼠关节OARSI评分显着增加和炎症因子表达下降。结论:我们通过基因工程技术对铁蛋白表面修饰软骨靶向肽,并包载具有抗炎作用的二甲双胍(Met),构建pH响应及软骨靶向肽修饰的靶向药物传递系统(CT-Fn/Met)。通过Il-1β诱导的软骨细胞及木瓜蛋白酶诱导的OA动物模型,CT-Fn/Met对OA的治疗作用得到验证。同时CT-Fn/Met具有良好生物相容性并能特异性结合软骨的Ⅱ型胶原,可通过延长保留时间有效减少关节中的滑膜炎症。它适用于炎症中与OA相关的酸性微环境。我们的研究结果证明了 CT-Fn/Met在OA治疗中潜在的可能性。

关键词： 人类胚胎干细胞   专利授权   审查标准   伦理争议   利益平衡  

摘要： 人类胚胎干细胞因其生物学特性，在再生医学领域应用前景广阔。但是由于提取人类胚胎干细胞不可避免要使用甚至是破坏人类胚胎，这一过程被认为是对人的商业化利用甚至是对人类生命的损害，违背伦理道德，所以人类胚胎干细胞本身及相关的发明创造不能被授予专利权。这一问题引起了国内外的广泛争议，尤其是“人类胚胎”的伦理地位问题。中国人类胚胎干细胞技术已经进入国际领先水平，人类胚胎干细胞技术的不断深入使得发明人对于获得专利保护的需求愈加迫切，但中国《专利法》对人类胚胎干细胞专利授权审查标准比较严格，不符合中国现在的科技发展现状。本文试图通过对人类胚胎发育问题的介绍，从人类胚胎干细胞专利授权的伦理障碍入手，借鉴国外人类胚胎干细胞研究水平较高的国家的专利授权标准，从生命伦理和知识产权伦理两个角度对这一问题进行分析，以寻求人类胚胎干细胞专利授权伦理障碍的突破，为中国放宽专利伦理审查提供可行性依据。　　第一章引言部分，主要介绍了中国干细胞研究的科研进展及人口健康领域的国情以及人类胚胎干细胞专利授权对中国的意义，对美国、欧洲和中国学者对人类胚胎干细胞专利授权问题的研究现状的焦点进行了总结，并且介绍了本文的所用到的研究方法。　　第二章首先对生物技术发明可专利的主题的作了概括介绍，然后从生物学角度说明了人类胚胎发育过程以及人类胚胎干细胞的提取过程中涉及的争议问题，引出人类胚胎干细胞发明专利授权所面临的主要障碍为伦理障碍。　　第三章从日本人城户常雄的一项有关人类胚胎干细胞发明专利申请案在不同国家的不同授权结果说起，对比了美国、欧洲、日本和中国对于人类胚胎干细胞研究行为的法律和政策规制，通过总结分析中国相在具体的专利审查案件授权标准可以看出中国相较于其他国家来说标准较为严格。　　第四章首先对生物技术发明专利涉及的伦理问题进行分析，包括生命伦理和知识产权伦理。然后从宏观角度，探讨了专利法中伦理审查的必要性以及发明创造是否违背伦理道德或者社会公德的判断方法，接着又从微观角度定位了人类胚胎和人胚胎干细胞及衍生物的伦理地位，分析了人类胚胎的工业和商业目的应用的道德风险问题和平衡专利制度中专利权人和社会公众利益冲突的知识产权伦理问题。　　第五章是结合中国现在的人口健康领域面临的问题及人类胚胎干细胞研究在中国的进展情况，提出了中国人类胚胎干细胞专利授权的必要性，并从中国传统社会价值观念、现有法律制度框架和中国现在的专利授权状况论证了中国人类胚胎干细胞发明专利授权的可行性，并提出了完善中国人类胚胎干细胞专利制度的建议。　　第六章对人类胚胎干细胞相关发明专利保护问题的进行总结，并根据最新的《专利审查指南》征求意见稿提出了完善人类胚胎干细胞专利授权相关法律规定的展望。

关键词： Cellular biology   Developmental biology  

摘要： The sinoatrial node of the mouse embryo arises from the wall of the right atrium near the border of the sinus venosus. Early in development this region expresses the transcription factor Tbx5. Because of this, Tbx5 is thought to sit at the apex of a transcriptional cascade leading to sinoatrial node (SAN) differentiation. To test this we produced a mouse embryonic stem cell line B1 (pTripZ-mTbx5; αMHC::GFP) that conditionally overexpresses Tbx5, to determine if this would lead to enhanced SAN differentiation. We found that ES cells overexpressing Tbx5 showed enhanced overall cardiac differentiation and that cardiac cells showed increased beat rates as compared control embryos. Despite this, key genes associated with SAN differentiation including HCN4 and Shox2 increased in cells overexpressing Tbx5, while the percent of HCN4 or Shox2 positive myocytes did not alter. Faster beating cells showed a decreased expression of the chamber specific marker Cx43 and increased expression of Tbx3 and Tbx18. These data suggest that Tbx5 overexpression is not sufficient for SAN differentiation, although it does activate part of the transcriptional cascade that directs early steps in the SAN. Together these data suggest that Tbx5 cannot activate SAN differentiation alone but instead must synergize with other factors.