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关键词： 鲎血G因子   大肠埃氏菌   昆虫细胞SF9   基因工程   真菌感染  

摘要： 【目的】　　用基因工程技术，在大肠埃氏菌及昆虫细胞SF9中表达重组鲎血G因子，为研制早期深部真菌感染检测试剂奠定基础。　　【方法】　　对鲎G因子基因序列分析后，根据大肠杆菌偏好性进行优化，将G因子α亚基cDNA和β亚基cDNA装载到原核表达载体pET32a-sumo上，分别构建pET32a-sumo/factorG-α和pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒。构建并检测序列正确后，转入感受态***21(DE3)中，IPTG进行诱导表达。使用超声破碎菌体，SDS-PAGE测定蛋白质分子量。尿素变性后用透析袋梯度透析复性。然后经Ni-NTA亲和层析，用SUMO蛋白酶切割融合伴侣，纯化后得到重组目的蛋白factorG-α和factorG-β。等摩尔质量重组后得到复合物G。使用荧光底物Boc-Glu-(OBzl)-Gly-Arg-MCA检测复合物的活性。　　去除鲎G因子两个亚基本身信号肽编码序列，添加昆虫信号肽编码序列，将两个亚基基因序列优化后，载入到昆虫Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，分别构建pFastBacl/G-α和pFastBacl/G-β1质粒，合成并检测序列正确，转化到***10Bac感受态，小量抽取质粒后PCR鉴定。将重组Bacmid转染SF9细胞，进行重组杆状病毒扩增。使用病毒感染SF9细胞，收集培养基上清和细胞裂解物，经WesternBlot检测目的蛋白。表达产物经Ni-NTA亲和层析进行纯化。　　【结果】　　成功构建pET32a-sumo/factorG-α和pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒，基因测序结果与目的序列一致。在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量约为103kDa和63kDa的目的蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化，用SUMO蛋白酶切割融合伴侣得到大小约为74kDa重组目的蛋白factorG-α和大小约为34kDa重组目的蛋白factorG-β。通过等摩尔融合得到复合物G，使用荧光底物检测复合物具有酶活性。　　成功构建pFastBacl/G-α和pFastBacl/G-β1昆虫表达质粒，PCR和酶切鉴定为阳性，基因测序结果与目的序列一致。WesternBlot显示，在SF9细胞培养基中成功表达出相对分子质量约为74kDa的目的蛋白G-α，在SF9细胞中检测到相对分子质量约35kDa的目的蛋白G-β1。经Ni-NTA亲和层析，纯化后得到重组目的蛋白G-α，未能纯化获得目的蛋白G-β1。　　【结论】　　大肠杆菌表达系统成功表达了鲎血G因子的亚基α和亚基β，为进一步探讨鲎血G因子的生物学功能以及为新型真菌感染检测试剂盒开发奠定基础。

关键词： Red/ET重组   基因簇   基因合成   天然产物   基因工程  

摘要： 微生物是天然产物的重要来源,随着合成生物学的快速发展和基因组测序技术的进步,越来越多的微生物基因组测序工作已完成,人们在这些微生物基因组发现了大量的微生物次级代谢产物生物合成基因簇尚未被开发和研究,但是很多微生物很难进行遗传操作或者在实验室内无法培养。将基因簇转入遗传背景清晰、易操作的宿主菌进行异源表达是开发生物合成资源的一种重要手段。但是微生物次级代谢产物基因簇一般大于20 kb,很难通过PCR的方式获得。获得基因簇的传统方法是构建基因组文库,但是周期长、操作复杂,不能满足高通量克隆基因簇的要求。符军等于2012年根据RecE和RecT蛋白能高效介导线性DNA分子之间发生同源重组的特性,开发了能够将目的DNA片段从基因组直接捕获至载体上的直接克隆技术。目前RecET直接克隆技术已被广泛应用于次级代谢产物基因簇的异源表达研究。次级代谢产物在异源表达时经常需要对表达载体进行修饰以添加基因转移元件、插入正调控基因、敲除负调控基因等。基于酶切和连接的传统DNA重组方法由于受到酶切位点和DNA分子大小的限制,难以完成这些遗传修饰。张友明等于1998年利用大肠杆菌Redαβ蛋白能够高效介导线性DNA分子和环状DNA分子之间发生同源重组的特性,建立了不受DNA分子大小和限制性酶切位点制约的DNA重组工程技术(Recombineering)。该技术能够精确、高效地对质粒、黏粒和细菌人工染色体等DNA分子进行基因插入、基因敲除、点突变和模块替换等操作,尤其适合天然产物基因簇的遗传改造。本研究将RecET DNA直接克隆系统和Redαβ DNA修饰系统整合到一个大肠杆菌宿主中,并通过克隆载体和DNA转移元件的标准化,建立了生物合成途径高通量直接克隆、修饰和异源表达的技术平台。在该技术平台中,我们针对不同大小基因簇和不同DNA序列特点构建了便于操作的直接克隆载体,同时将接合转移和转座元件、位点特异性重组元件、广宿主多拷贝复制子两侧的序列进行了标准化,使其都能通过Redαβ重组快速插入上述所有克隆载体中,使一个载体可以适用于细菌接合转移,转座和位点特异性重组等不同遗传操作手段,便于快速的进行异源表达研究。该技术平台实现了生物合成途径克隆、转移和异源表达的无缝对接,只需要一周就能完成生物合成途径的克隆及基因转移元件的插入,大大简化了DNA克隆、修饰、转移和异源表达的流程。利用该技术平台,我们对波赛链霉菌ATCC 27952、刺糖多孢菌NRRL18395和阿维链霉菌DSM 46492基因组中的次级代谢产物基因簇进行了克隆和异源表达研究。土壤和海洋宏基因组中的次级代谢产物基因簇由于浓度低而很难通过直接克隆获得,从头合成是克隆宏基因组中基因簇的有效方法,但是该方法对DNA组装效率的要求较高。本研究通过结合寡核苷酸体外退火和RecET介导的线性DNA分子间的同源重组建立了头合成基因簇的方法。该方法的策略是:(1)首先将10个两端带有20 nt互补配对序列的60 nt寡核苷酸组装成420 bp的双链DNA片段;(2)把10个两端带有40 bp同源序列的420 bp片段组装成4020 bp的中等长度DNA片段;(3)把两端带有40 bp同源序列的4020 bp片段组装成最终目的基因簇。我们利用该方法从头合成了在海鞘共生蓝细菌中发现的非核糖体多肽patellamide A的12.7 kb基因簇,并在大肠杆菌中进行了异源表达研究。本论文构建的基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达技术平台为微生物基因组的开发利用提供了便利。

关键词： 基因工程多肽   杂化纳米胶   光热治疗   近红外荧光成像   光声成像  

摘要： 无机纳米材料因具有独特的光学、电学、磁学等性质而被广泛应用于生物医学领域。其中,量子点,尤其是硫化银量子点因独特的近红外二区荧光、不含重金属元素等特点而广泛用于生物成像和癌症治疗。但是,硫化银量子点的应用仍然面临着一些问题,如荧光量子产率低、合成工艺繁琐、在酸性条件下稳定性差等。基因工程多肽是通过基因工程的方法合成的根据不同的需求而调节其序列的多肽,这种生物相容性较好的生物材料可以特异性地与硫化银量子点相互作用,改善其荧光属性和稳定性,也可以作为生物模板介导硫化银量子点的水相合成。基于此,本论文主要研究基于基因工程多肽和硫化银量子点、银纳米颗粒的纳米探针的制备及其在生物成像及肿瘤治疗和伤口愈合中的应用。论文主要的工作包括:(1)设计和合成了一种新型的硫化银量子点和多肽杂化的多功能纳米探针用于肿瘤的双模式成像和光热治疗。基因工程多肽可以通过分别形成五聚体的结构域P和形成四聚体的结构域A的自组装成纳米胶。油溶性的硫化银量子点通过超声的方法被包裹进PC10ARGD纳米胶中的疏水性区域从而构建了Ag2S QDs@PC10ARGD杂化纳米胶,这种方法可以最大程度的保留硫化银量子点的荧光量子产率。实验结果表明硫化银量子点均匀分散在PC10ARGD多肽纳米胶内,该杂化纳米胶具有良好的稳定性和生物相容性。靶向RGD三肽通过识别高表达αvβ3整合素受体的细胞介导细胞对杂化纳米胶的特异性摄取。体内和体外实验结果表明该杂化纳米胶可以作为诊疗一体化探针用于近红外二区荧光成像、光声成像和肿瘤的光热治疗。(2)直接水相合成了一种基因工程多肽稳定的硫化银量子点用于肿瘤的双模式成像和光热治疗。通过基因工程的方法在多肽RGDPC10A的碳端和氮端分别引进三个含巯基的半胱氨酸构建多肽cys RGDPC10Acyscys,该多肽可用作模板在水溶液中一步合成硫化银量子点。基因工程多肽稳定的硫化银量子点的特性显著提高,如具有高的胶体稳定性、抗光漂白能力和高的荧光量子产率。基因工程多肽稳定的硫化银量子点可用于体内荧光成像和光声成像的双模式成像,同时因其具有较高的光热转换效率和较好的光热稳定性,可用于肿瘤的光热治疗。(3)利用种子生长法合成了一种基因工程多肽稳定的核壳型硫化银量子点用于极酸条件下的p H荧光响应和成像。基因工程多肽cys RGDPC10Acyscys稳定的硫化银量子点作为种子在加入盐酸后继续生长形成核壳型硫化银量子点。核壳型硫化银量子点的荧光发射峰在1200纳米左右,且荧光强度显著增强。实验结果表明核壳型硫化银量子点在酸性条件下具有较好的p H荧光响应,随着p H的降低荧光逐渐增强。核壳型硫化银量子点的荧光强度与p H具有较好的线性关系,而且其具有优良的p H可逆性,核壳型硫化银量子点适合监测p H的改变。由于酸性条件下带正电荷的硫化银量子点表面的多肽与带负电荷的革兰氏阴性细菌有强烈的静电相互作用,且近红外二区荧光可以有效避免生物自发荧光的干扰,所以核壳型硫化银量子点非常适合酸性条件下革兰氏阴性细菌的成像。(4)一步原位合成了一种基于银纳米颗粒和多肽的杂化纳米胶用于伤口的抗菌和治疗。我们以银离子为原料,I-2959为光引发剂,采用365 nm UV光照在PC10ARGD纳米胶内原位合成了银纳米颗粒。通过改变多肽和硝酸银的浓度可以分别调节多肽纳米胶和银纳米颗粒的尺寸。体外实验表明银纳米颗粒-多肽杂化纳米胶对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌都有良好的抗菌效果。细胞实验证明银纳米颗粒-多肽杂化纳米胶具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性。体内实验表明银纳米颗粒-多肽杂化纳米胶具有抗菌和促进伤口愈合的能力。总之,本论文主要解决了硫化银量子点面临的一些问题,包括:通过基因工程多肽自组装形成的纳米胶包裹油溶性的硫化银量子点获得高量子产率的多肽-硫化银量子点杂化纳米探针;通过改变基因工程多肽中半胱氨酸的含量调节水相合成硫化银量子点的荧光和稳定性;通过种子介导的生长方法合成了在酸性条件下荧光增强的硫化银量子点。另外,我们通过原位紫外光照的方法合成了银-多肽杂化纳米胶,该方法为合成多肽-硫化银杂化纳米胶提供了理论基础。

关键词： Classification   Detection   Human embryonic stem cells   Machine learning   Segmentation   Video bioinformatic  

摘要： Human Embryonic Stem Cell (hESC) have a great potential for regenerative medicine to provide treatments for Parkinson’s disease, Huntington’s disease, Type 1 diabetes mellitus, etc. Consequently, hESC are often used as a model in the biological assay to study the effects of chemical agents on the human body. Video analysis plays an important role for biological assays in the field of prenatal toxicology and stem cell differentiation. This thesis introduces machine learning techniques for detection, segmentation and classification for hESC analysis. For the detection, a bio-driven algorithm was used to detect cell regions in hESC images. Cell region detection is essential in stem cell focused analysis. It can prevent background information from contaminating the analysis and put more emphasis on processing the cell region. For the segmentation part, a bio-inspired method was proposed for bleb extraction and analysis over time. Bleb formation is a strong health indicator of the stem cell undergoing chemical reactions. Therefore, it is significant to biologist to analyze the formation process over time. For the classification, a deep learning structure was built with both labeled and unlabeled hESC data to classify the six common classes in stem cell images. The six classes are: 1). cell clusters, 2). debris, 3). unattached cells, 4). attached cells, 5). dynamically blebbing cells, and 6). apoptotically blebbing cells. Various results are provided on real video datasets collected using a phase contrast microscope and a Nikon Bio-station.

关键词： 桧状青霉   转录因子   基因工程   β-葡萄糖苷酶  

摘要： 资源化利用丰富的木质纤维素是解决我国能源、环境等各种问题以及农业产业链延伸的重要支撑。纤维素酶系的重要组成部分β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，可以将纤维寡糖，纤维二糖水解为葡萄糖单糖，增强纤维素水解酶系的水解活力，同时还具备将葡萄糖通过转糖基作用，转化为槐糖等纤维素酶高效诱导物的作用。里氏木霉是目前商业纤维素酶的主要生产者，但其较低的β-葡萄糖苷酶活性限制了水解木质纤维素的能力。　　本课题组在前期工作中筛选到高产纤维素酶的桧状青霉（Penicillium piceum）9-3菌株，分析表明该菌株的β-葡萄糖苷酶Km值达到已报道β-葡萄糖苷酶最低值。另外，通过等离子诱变技术获得了β-葡萄糖苷酶活性提高了4倍的突变株H16。　　本论文利用野生型桧状青霉9-3以及突变型H16，对β-葡萄糖苷酶转录调控机制进行研究，结果如下:　　(1)9-3菌株基因组注释。对已经组装好的野生株9-3基因组进行了功能注释，包括KOG，GO，KEGG，Pfam，Swiss-prot，InterPro，CAZy注释，同时预测基因组共含有340个分泌蛋白基因。　　(2)H16菌株重测序与分析。基于9-3菌株的基因组序列，利用Illumina HiSeq2500测序平台，对H16菌株测序，整个基因组中，共有1497个位点发生SNPs突变，690个位点发生基因片段的插入或缺失。对突变位点进行注释及聚类分析，发现G信号传导途径，MAPK信号转导途径，短链脱氢酶/还原酶等氧化还原酶，糖转运蛋白，转录因子的某些基因存在着无义突变，错义突变等变异，从而影响了β-葡萄糖苷酶的活性。　　(3)9-3菌株与H16菌株比较基因组测序与分析。采用Illumima高通量测序技术对突变株H16和野生株9-3在非诱导条件及微晶纤维素诱导6小时条件下进行转录组测序。结果表明:在未诱导条件下，H16菌株与9-3菌株相比，共有453个基因发生显著差异表达;在微晶纤维素酶诱导6小时条件下，H16菌株与9-3菌株相比，共有538个基因发生显著差异表达，其中β-葡萄糖苷酶基因Cel3A和Cel3B发生了显著上调。另外，对显著差异表达的基因进行富集，结果显示，差异表达基因主要富集在水解酶活性，氧化还原酶活性等GO条目以及淀粉蔗糖代谢途径，聚糖降解代谢途径等，与β-葡萄糖苷酶活性提升相关。本文还通过比对KEGG PATHWAY构建了纤维素的代谢通路。　　(4)β-葡萄糖苷酶转录调控因子的预测与过表达实验。利用真菌转录因子数据库FTFD预测桧状青霉中共有148个基因编码真菌转录因子，在JASPAR转录因子数据库中寻找转录因子结合位点的Motif，利用R包TFBStools对转录因子在β-葡萄糖苷酶启动区的结合进行预测。结合转录因子差异表达数据，以及与纤维素酶的位置关系，预测了24个可能调控β-葡萄糖苷酶的转录因子。对24个转录因子做过表达实验，初步鉴定PENG_01797和PENG_02567为调控β-葡萄糖苷酶的负向转录因子，且二者均具有C2H2类型的锌指蛋白结构。推测H16突变株β-葡萄糖苷酶活性的提高有可能是由于突变作用，使两个负控转录因子表达量下调，部分解除了对β-葡萄糖苷酶的抑制作用。　　影响丝状真菌生产β-葡萄糖苷酶的因素很多，其中菌种选育是最关键的因素之一，通过基因工程育种是有效提β-葡萄糖苷酶重要技术手段。因此，深入解析桧状青霉β-葡萄糖苷酶转录调控机制，有利于高活性β-葡萄糖苷酶产纤维素酶菌种的工程育种，为木质纤维素的产业化利用奠定基础。

关键词： 植物研究   基因工程  

摘要： 《植物研究》1959年创刊,是由东北林业大学主办,科学出版社出版的植物学专业刊物,是国内外公开发行的学术期刊。2006年变更为双月刊,后成为以植物分类、基因工程、植被生态、数量遗传学等为核心的多学科综合性学术期刊。其刊载内容为植物新种、分子生物学、基因工程、植物细胞学、植物化学、植物遗传学、植物生理学、群落生态学等基础理论研究方面具有创新性或较高学术水平的原始性论文。现为中文核心期刊、中国科技核心期刊、RCCSE

关键词： 胚胎干细胞   拟胚体   成釉细胞无血清条件培养液  

摘要： 目的探讨胚胎干细胞经过拟胚体的形成与直接诱导分化是否影响胚胎干细胞的特性。方法观察不同培养方法经过相同的诱导条件后胚胎干细胞形态学的变化,进行基因表达及免疫表型的检测。结果从形态学来看,经过拟胚体的培养后诱导分化和直接诱导分化后都有鹅卵石样的细胞生成,PCR结果显示:两组细胞在同一诱导条件下均能表达牙上皮相关基因,且经过拟胚体培养后的诱导组表达更强。细胞表型的变化与PCR结果相一致。结论经过拟胚体的培养方法诱导效率高于直接培养后的诱导分化。

关键词： 基因工程技术   农业   畜牧业   医学  

摘要： 基因工程技术在产生之初就得到了各个国家的高度重视与大力扶持,这不仅因为基因工程技术是生物科学中的前沿技术,而且也因为基因工程技术在推动社会各个领域的发展方面都能够发挥出重要的作用。本文从学生的视角,在阅读基因工程技术相关文献的基础上,对基因工程技术在农业、畜牧业、医学以及环境保护、能源开发中的应用价值做出了分析与论述。

关键词： 欧洲鳗鲡   嗜水气单胞菌   鳗鲡爱德华氏菌   创伤弧菌   外膜蛋白   免疫原性   免疫保护效果  

摘要： 研究表明,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗鲡爱德华氏菌(Edwardsiella anguillarum)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是鳗鲡养殖中常见的病原菌。为研制基因工程亚单位疫苗,本研究在获得嗜水气单胞菌孔蛋白Ⅱ(OmpⅡ)、鳗鲡爱德华氏菌外膜蛋白A(OmpA)和创伤弧菌外膜蛋白U(OmpU)等3个均具有良好免疫原性的外膜蛋白基因的基础上,分别构建3个表达载体以表达嗜水气单胞菌单联外膜蛋白(rOmpⅡ)、嗜水气单胞菌与鳗鲡爱德华氏菌二联外膜蛋白(rOmpⅡ-A)以及这3种菌的三联外膜蛋白(rOmpⅡ-U-A)。本研究包含3个目的:二联和三联表达产物免疫后是否影响其抵抗单个病原菌(嗜水气单胞菌)感染的能力;单联和二联表达产物免疫后对3种病原菌感染是否产生交叉保护效果;表达的三联外膜蛋白是否能同时抵抗3种病原菌的感染。研究方法与主要结果如下:(1)在分析3个外膜蛋白基因表达产物免疫原性的基础上,由构建的单、二和三联等3种外膜蛋白表达载体进行基因工程表达。3个表达产物经镍柱纯化和梯度尿素复性后获得3个融合表达产物:嗜水气单胞菌孔蛋白(rOmpⅡ,58 kDa)、嗜水气单胞菌与鳗鲡爱德华氏菌二联外膜蛋白(rOmpⅡ-A,56 kDa)和嗜水气单胞菌、创伤弧菌与鳗鲡爱德华氏菌三联外膜蛋白(rOmpⅡ-U-A,62 kDa)。(2)将400尾无过往病史的欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)平均分成5组,分别腹腔注射PBS(PBS组)、PBS和弗氏不完全佐剂等量混合液(PBS+F,佐剂组)、0.5 mg/mL的rOmp-Ⅱ与弗氏不完全佐剂等量混合物(rOmpⅡ+F,单联组)、0.5 mg/mL的rOmpⅡ-A与弗氏不完全佐剂等量混合物(rOmpⅡ-A+F,二联组)和0.5 mg/mL的rOmpⅡ-U-A与弗氏不完全佐剂等量混合物(rOmpⅡ-U-A+F,三联组),每尾注射0.2 mL。于免疫后的0.5 h、12h、24 h、48 h和96 h采集鳗鲡肝脏、脾脏、肾脏和肠,从免疫相关基因表达的变化研究基因工程疫苗免疫后对鳗鲡免疫功能的影响;于免疫后第14d、21d、28d和42d采集鳗鲡肝脏、肾脏、粘液、血清和血细胞,从血细胞刺激指数、抗体水平、溶菌酶含量、超氧化物歧化酶含量(SOD)和3种病原菌攻毒感染后的相对免疫保护率等5个方面对3种外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性与免疫保护效果进行探讨。结果表明:免疫后3个外膜蛋白组的mhc2、lysC、sod和igm等基因在特定时间点肝脏、脾脏、肾脏和肠中均出现显著性(p<0.05)升高,但3个外膜蛋白组对肠和肾脏的lysC和igm基因表达的影响不明显;免疫后第28d,外膜蛋白组的血细胞转化水平升高,其中单联组显著(p<0.05)高于其余4组;免疫后第14 d、21 d、28 d和42 d,无论包被的是细菌还是包被外膜蛋白抗原,3个外膜蛋白免疫组的血清和粘液抗体效价均显著(p<0.05)高于PBS组和佐剂组,但外膜蛋白组之间差异不明显;粘液中的溶菌酶含量于免疫后14至42 d逐步升高,而血清溶菌酶含量于免疫后28d达到峰值;3个外膜蛋白组的总超氧化物歧化酶(SOD)含量于4个时间段在肝脏、肾脏、粘液和血清中均显著(p<0.05)上升,其中血清中上升最明显。免疫后第28 d,以嗜水气单胞菌、鳗鲡爱德华氏菌和创伤弧菌分别攻毒感染欧洲鳗鲡,结果表明单联组对这3种病原菌分别产生了 83.33%、55.56%和33.33%的相对免疫保护率,而二联组则对3种病原菌分别产生了 83.33%、55.56%和44.44%的相对免疫保护率,其对嗜水气单胞菌和鳗鲡爱德华氏菌的相对免疫保护效果均显著(p<0.05)高于PBS组;三联组对3种病原菌的免疫保护效果最差,其对3种病原菌仅分别产生了 66.67%、22.22%和44.44%的相对免疫保护率。综合以上结果,本研究发现表达的嗜水气单胞菌单联和该菌与鳗鲡爱德华氏菌的二联外膜蛋白均具有较好的免疫原性,其良好的免疫保护效果源于这些外膜蛋白免疫后有效刺激了鳗鲡的免疫相关基因的表达,并从而提高了血细胞、血清和SOD的抗菌能力,但这种保护能力与溶菌酶和粘液抗体效价的关系不明显。同时,本研究发现单联表达的嗜水气单胞菌外膜蛋白对鳗鲡爱德华氏菌也产生了显著的交叉保护效果。此外,二联表达产物对嗜水气单胞菌的免疫保护效果没有影响,而三联表达产物却在一定程度上降低了其对嗜水气单胞菌的免疫保护效果。