关键词：
表面等离子体共振(SPR)
多重检测
绝对定量
可再生
摘要：
随着全球转基因作物的商业化种植,各国政府及公众对转基因生物安全问题的关注度越来越高,为加强转基因作物的监管,保护消费者的知情权,新型转基因检测技术的开发一直是转基因生物安全工作的研究热点。目前,转基因作物成分检测的经典及标准化方法均为基于核酸的分析方法,如定性PCR、实时荧光定量PCR与数字PCR方法,其优点是各检测实验室可以满足仪器设备等条件,缺点是此类技术需要通过扩增进行信号放大,耗时较长、程序复杂、且均为终点法,反应体系各组分在反应结束后不可重复利用。因此,既快速灵敏、无需标记、又可再生的生物传感芯片日渐引起人们的关注。表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）生物传感器是一种光学传感系统,利用光学角度的变化来实现各种分子的精准检测,它保证传统检测方法的特异性和灵敏度的同时,兼具有实时、无标记、可再生、可绝对定量分析物的优势,因此近年来成为广大科研工作者的研究热点。本文利用SPR传感系统,以花椰菜花叶病毒35S（CaMV35S）启动子、脂肪碱合酶终止子（t-nos）,抗虫基因（cry1A）三种常用转基因元件为研究对象,建立了转基因作物核酸定性检测及绝对定量两种方法,并考察了方法学的特异性、灵敏度、动力学特征等关键参数,研究结果如下:（1）构建了转基因核酸定性检测SPR生物传感器,可同时检测t-nos、CaMV35S、cry1A三个转基因元件,具有良好的特异性和灵敏度。检测灵敏度与芯片表面探针偶联量相关,偶联量越高,检出限（LOD）越低,即越灵敏,但在相同偶联量时,DNA探针中（G+C）%含量越高,且二级结构越简单,检测灵敏度越高,表现为LOD（t-nos）（CaMV35S）=LOD（cry1A）。利用该方法进行多重目标检测时,发现元件单独测试的灵敏度与其同其他元件组合时的灵敏度存在差异,说明混合物中的其他成分也是影响检测灵敏度的因素。基于cry1A的序列保守性较差,本研究为此设计了简并探针,实现了含cry1A的多物种检测,三种目标DNA分析物与探针的亲和力（kD）分别为kD（水稻）=2.32×10-9 M、kD（玉米）=3.10×10-9 M、kD（大豆）=4.17×10-9 M,表明该简并探针的亲和力可满足方法学要求,因此,可用于转cry1A抗虫作物的检测。（2）开发了无标定量（Calibration Free Concentration Analysis,CFCA）方法,在无需标准品的情况下,实现了t-nos样品的浓度测定,该方法的日内精度为1.61%2.10%,日间精度为1.78%,重复性和再现性良好。通过动力学分析,明确了t-nos target与t-nos probe相互作用的结合速率常数ka≥5×10～4 M-1s-1且平衡常数kD≤10-6 M,说明t-nos分析物符合CFCA实验的前提条件。偶联量在1400～2000 RU时,CFCA浓度测定的质控参数QCratio值大于0.2,且不同稀释倍数条件下测得的浓度结果的相对标准偏差（RSD）均低于5%,说明该方法的浓度分析结果准确可靠。利用标准曲线法与CFCA法对同一样品进行了浓度分析,对两种方法的测量结果进行了单因素方差分析,结果表明,两种方法的浓度测定结果在α=0.05水平上无显著差异,进一步说明了CFCA方法的可行性。本文搭建的SPR生物传感器,可实现多种转基因DNA分析物的定性及定量检测,具有特异性好、灵敏度高、可绝对定量、传感芯片可稳定再生等优点,因此,可实现DNA分析物的高通量及大规模检测。
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