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关键词： 基因工程   农业发展   克隆  

摘要： 基因工程是社会科技发展的产物,对社会农业、医学、环境等多个方面都起到了重要的作用,也带来了不少问题。我们应正确地看待基因工程的影响,避免不利影响的出现,让其更好地服务于人类的生活。

关键词： miR-184   胚胎干细胞   干细胞分化  

摘要： 胚胎干细胞(Embryonicstemcells，ES细胞)是一类从晚期囊胚的内细胞团中分离得到的细胞。由于ES细胞具有高度自我更新能力和多向分化潜能，为研究胚胎早期发育提供了新模型，并且对于转化再生医学和心脏疾病细胞治疗具有重大意义。近年来，表观遗传调控被认为是胚胎早期发育和细胞命运决定的重要调控因素。MicroRNAs(miRNAs)作为一类长度为20个核苷酸左右的非编码RNA，主要在转录后调控基因表达，作用广泛。WNT3作为WNT家族中重要的蛋白，在ES细胞分化中发挥重要作用，但对于WNT3的调控仍需进一步研究。　　为了进一步完善对ES细胞向心肌中胚层分化和心肌细胞形成过程中重要调控认识，并为后期分化形成更高质量的心肌细胞和心脏疾病治疗做准备，我们从中筛选得到与Wnt3表达负相关的miR-184并对其作用和机制进行了探讨。我们研究发现，在ES细胞向心肌中胚层分化过程中，miR-184的表达水平降低，而在心肌中胚层向心肌细胞分化过程中表达升高，表明miR-184在ES细胞向心肌中胚层和心肌细胞分化过程中可能具有重要作用。为研究miR-184的功能，我们首先在ES细胞中过表达miR-184，发现其对ES细胞多能性状态并无明显影响。于是，我们在ES细胞向心肌中胚层分化过程中过表达miR-184，检测心肌中胚层相关转录因子的mRNA水平和蛋白水平的表达情况。实验结果表明过表达miR-184会抑制ES细胞向心肌中胚层分化，并且在进一步的分化过程中我们发现心肌细胞的形成同样受到抑制。基于生物信息学预测和机制研究，我们发现miR-184可以直接与Wnt3的3’UTR区结合并抑制Wnt3在分化过程中的表达。同时，在ES细胞中通过shRNA敲降Wnt3的表达，能够模拟单独过表达miR-184产生的抑制ES细胞向心肌中胚层分化的现象。最后，在过表达miR-184的细胞中再外源过表达Wnt3能够挽回单独过表达miR-184导致的心肌中胚层和心肌细胞分化的抑制。　　综上所述，本研究发现miR-184通过直接结合Wnt3的3’UTR区抑制Wnt3的表达，从而调控ES细胞向心肌中胚层及心肌细胞的分化过程。本研究不仅阐明了miR-184内源调控Wnt3的作用机制，而且丰富了ES细胞分化的表观遗传调控网络，为探究ES细胞向心肌中胚层分化及心肌细胞分化提供了新的思路。

关键词： 胚胎干细胞   分化   内皮细胞   造血细胞   血管内皮干祖细胞   造血干祖细胞  

摘要： 研究背景:在血管发生和重塑的过程中,血管内皮细胞(endothelial cell,EC)起源于血液血管母细胞(hemangioblast,HA)。但由于缺乏对这一发育过程诸多细节的深入了解,因而成熟的血管内皮在体外扩增十分困难,极大地限制了它的功能研究和临床应用。近年来,多项研究表明哺乳动物成体血管内皮中存在一群具有特定分子表型的“血管内皮干细胞(vascular endothelial stem cell,VESC)”,表达Kit(也称CD117)、Procr(也称EPCR、CD201)等分子,能在体外形成稳定克隆并产生数千万的子代内皮细胞。不仅如此,VESC还具有分化为原代内皮细胞和周细胞的双向潜能,可以在体内产生功能性血管,这为组织工程化血管和临床治疗提供了新的研究方向。造血细胞(hematopoietic cell,HC)的起源与血管内皮密不可分。目前的主流观点认为,造血细胞是由中胚层来源、功能特化的生血内皮(hematopoietic endothelium,HE)通过内皮-造血转化(endothelial to hematopoietic cell transition,EHT)分化演变而来,以产生原始造血和定向造血两大主要形式出现于胚胎早期的多个位点和时间节点,具有明显的时空特异性。小鼠胚胎期的造血细胞表达内皮细胞标志CD31、CD144等,来自外周血CD34的造血细胞可以通过体外培养分化为内皮细胞,这些研究也间接证实了造血细胞与内皮细胞有着共同的发育起源。胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是一类能够分化成机体几乎所有细胞类型的全能干细胞,增殖能力强,是组织工程化研究理想的种子细胞。近年来多项研究表明,在干细胞因子(stem cell factor,SCF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等细胞因子的诱导下,ESC在体外能被诱导分化为内皮干祖细胞(endothelial stem and progenitor cell,ESPC),进而分化成内皮细胞、血管壁细胞(周细胞和血管平滑肌)并进一步向动、静脉内皮特化;或者分化为造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC),进而向髓系祖细胞(myeloid progenitor)、巨核-红系祖细胞(megakaryocyte–erythrocyte progenitor,MEP)等及其下游血细胞分化。这些发现为ESC的体外诱导编辑研究奠定了理论基础,然而因诱导手段局限、调控网络不清晰、微环境缺失等原因,ESC体外定向内皮细胞和造血细胞的分化体系仍不十分成熟。研究目的:本研究利用胚胎干细胞的发育全能性和诱导可塑性,通过各种细胞因子和条件控制,定向诱导其分别向内皮细胞和造血细胞分化,构建完整的体外定向分化体系。通过流式检测、免疫组化等各种手段验证诱导后2种细胞的表面分子特征,探索诱导过程中是否存在“干祖细胞”的中间态及其表面分子特征,探讨内皮和造血发育的相关性,为优化稳定、成熟的体外诱导分化体系,进而进行大规模组织工程化应用研究提供实验基础。研究方法:根据胚胎期内皮、造血细胞的起源规律,本研究在无血清的StemPro培养体系中,使用能够诱导干细胞向中胚层分化的BMP4(bone morphogenetic protein 4,骨形态发生蛋白4)、Activin A(激活素-A),以及能够诱导内皮细胞增殖、迁移的FGF-Basic(fibroblast growth factor basic,碱性成纤维细胞生长因子)和VEGF这4种因子,诱导小鼠胚胎干细胞系R1/E形成拟胚体(embryoid body,EB),模拟中胚层发育过程,再用SCF、VEGF和SCF、FLt3L(FLt-3 ligand)、IL-3分别定向诱导EB向EC和HC分化,建立胚胎干细胞体外定向血管内皮和造血细胞的分化系统。研究结果:经过四因子体系诱导分化4天后,ESC成功被诱导为大量形态饱满、克隆边界清楚的EB;继续向内皮和造血定向分化6天后,成功诱导出多个内皮管状结构和造血集落。通过流式检测分析,CD31的内皮细胞比例为1.35±0.05%,进一步分析CD31CD144CD45群体,发现其中有3.0±0.2%的细胞表型为KitCD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的ESPC;CD45的造血细胞比例为35.0±0.5%,其中有0.35±0.05%的细胞表型为KitCD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的HSPC。这两群细胞数量非常有

关键词： Y染色体   Y-SNP单倍群   系统进化树   下一代测序   Y-STR  

摘要： 背景和目的人类Y染色体的很大一部分,即非重组Y染色体部分（Non-recombinant Y chromosome NRY）,遵从严格的父系遗传。由于在减数分裂过程中Y染色体该部分没有重新组合,因此可以确定所有人类NRY变体的等级血统顺序并推断它们在系统发育树中血统的顺序和时间。然而在父子遗传信息一代代的传递过程中,Y染色体也在渐渐地积累着一些变化——遗传突变。正是因为遗传突变积累的存在,使得人类父系遗传的体系中,相距越远的两个个体Y染色体差异越大;正是这些遗传突变的积累,形成了Y染色体遗传标记。Y染色体上的遗传标记有很多,主要有微卫星DNA、小卫星DNA、卫星DNA、插入与缺失、单核苷酸多态性五类。目前在法医学研究中以及实际检案中最常用到的是微卫星DNA和单核苷酸多态性,即Y-STR和Y-SNP。并且,随着下一代测序（Next generation sequencing NGS）的快速发展,以及测序成本的降低,未来几年将有大量人类基因组数据可供使用。这些数据可用于优化和提高Y染色体系统发育树的分辨率。但是NGS产生的数据量急剧增加,并且产生的数据格式较为复杂,对法医学实践中需要提取某一位点信息的需求形成严峻挑战。为了有效地分析和阐释Y染色体NGS数据,本实验通过对STRait Razor v3、AMY-tree及Y-leaf三个软件来解析全基因组DNA二代测序结果数据,以比较各软件的效力,能够为从二代测序结果中Y-STR信息和提取高分辨率Y-SNP单倍群提供方法参考,并能为法医物证工作中应用二代测序技术获取Y-DNA遗传标记提供帮助。方法1.采用上海莱枫公司2ml血液基因组DNA提取试剂盒提取一名河南汉族男性外周血基因组DNA。2.以二代测序仪BGISEQ-500对该例样品进行全基因组DNA重测序。3.提取二代测序结果中的Y-STR信息:使用STRait Razor v3软件包。在Windows操作系统上,从https://***/Ahhgust/STRaitRazor页面下载并安装STRait Razor v3软件包。把二代测序结果.fastq文件通过该软件解读出.fastq文件中所包含的Y染色体STR等信息。4.提取二代测序结果中的特异性Y-SNP信息:使用AMY-tree软件;并以之判断该样品在Y单倍群进化树（International Society of Genetic Genealogy,ISOGG,http://***/tree）中的分支归属。从***/eeb/lbeg下载并安装AMY-tree软件在Windows操作系统上。将全基因组DNA重测序结果中的Y染色体突变列表按照AMY-tree软件要求格式修改成输入文件,对软件所需其他支持文件下载并输入,运行程序,得出样本所属ISOGG单倍群分支以及最新潜在Y-SNP等信息。5.提取测序结果中的特异性Y-SNP信息:使用Y-leaf软件;并以之判断该样品在Y单倍群进化树（International Society of Genetic Genealogy,ISOGG）中的分支归属。在https://***/geneticidentification/resources/Yleaf/下载Y-leaf软件,在Linux操作系统上,根据y-leaf软件的README文件进行安装。提前安装好Python、wget、Libcurl、readline、R、samtools等基础支持软件包。然后在郑州大学超算中心上运行yleaf来分析二代测序结果bam或fastq文件,解读其中的Y-SNPs及其单倍群。6.以Yfiler试剂盒对该样品进行检测;对该样品进行M117分型,以验证提取的遗传标记信息。7.以STRAIT Razor v3识别出的Y-STR个数,与Yfiler试剂盒检测出的Y-STR个数相比,求出全基因组测序50×背景下的Y-STR检出率;以AMY-tree识别出Y单倍群进化树SNP个数除以输入该软件的Y-SNPs总数,求其Y-SNP识别率;以Yleaf识别出Y单倍群进化树SNP个数除以输入该软件的Y-SNPs总数,求其Y-SNP识别率。并以卡方检验比较AMY-tree与Yleaf从全基因组数据中提取Y-DNA遗传标记信息的效力。结果1.全基因组重测序得到3429964个SNP,其中98.77%出现在dbSNP数据库里,其中96.98%在千人基因组计划（the 1000 Genomes Project）的数据库中。在全基因组中新发现的SNP共32050个。Y染色体上得到2825个SNP。*** Razor v3软件包的***组件分析的STR位点和性别信

关键词： 环境污染物   神经发育   肝脏发育   毒性效应   胚胎干细胞模型  

摘要： 近几年随着环境科学的发展，环境污染物的健康风险效应成为大众关注的热点话题。与成体不同，在胚胎发育过程中，外界因素的轻微扰动会致使胎儿发育发生变化，严重的可能产生致畸效应。特别是神经系统和肝脏组织，经证实是环境污染物的主要作用靶点。神经系统因其发育时间长、发育过程复杂，因此最易受外界因素干扰;肝脏是人体主要的解毒和代谢器官，往往由于多种化合物的蓄积效应而致使肝脏毒性的发生。鉴于许多化合物可透过胎盘屏障，威胁胚胎发育，因此探究环境污染物对神经系统发育和肝脏发育的干扰效应有助于全面评价污染物的健康风险。鉴于此，本文主要开展以下研究内容:　　(1)探究了普遍存在和广泛使用的两种邻苯二甲酸酯类物质（邻苯二甲酸二乙酯DEP，邻苯二甲酸二丁酯DBP）对早期神经系统发育的影响。结果表明DEP和DBP都可降低小鼠胚胎干细胞的细胞活力，IC50分别为1.0±0.3mM和0.26±0.05mM。但DEP和DBP引起细胞毒性机制不完全相同。DBP可激活细胞内caspase-3/7酶活性、增加细胞膜通透性并引起细胞内ROS累积;而DEP仅引起细胞内ROS累积。急性毒性实验表明相同浓度下DBP比DEP毒性更强。低剂量（即无急性细胞毒性浓度，10μM）的DEP和DBP处理均可干扰早期胚胎发育，影响三胚层相关基因的表达。拟胚体分化实验中，DEP和DBP处理干扰了内胚层（Gata6、Foxa2）、中胚层（T、Hand1）和外胚层（Fgf5、Otx2）标志基因的表达，且对神经外胚层（Pax6、Nestin、Sox、Sox3）的影响最显著。神经前体细胞诱导实验进一步证实了DEP和DBP对早期神经系统发育的干扰效应。以上结果为DEP/DBP暴露影响儿童行为等人群调查结果提供了细胞分子层面证据，并提示我们未来需要更多关注邻苯二甲酸类物质的健康风险。　　(2)除邻苯二甲酸类物质外，卤代阻燃剂也是工业生产中应用极其广泛的一大类物质。本文探究了该类物质对神经系统发育的影响，并揭示五种化合物复合暴露对神经系统发育的影响。转录组测序发现此类化合物影响早期神经发育过程，且可能干扰轴突生长/导向及神经元传递等过程，另外，此类化合物可能通过介导WNT信号通路和AHR信号通路而影响神经系统发育。复合暴露毒性不低于单一化合物暴露，毒性作用更加复杂。BDE-209的毒性作用与BDE-47相似，其潜在的健康风险值得进一步关注;作为TBBPA替代物的TBBPS和TCBPA，在相同剂量浓度下，毒性作用均大于TBBPA，提示该两种化合物的安全性需格外关注。　　(3)利用人胚胎干细胞肝分化模型，探究体外诱导模型对甲状腺激素(THs，T3和T4)暴露的响应。研究发现分化过程中暴露T3和T4会诱导形成功能异常的肝脏细胞，表现为糖原储存能力减弱、脂肪异常累积以及AFP、ALB、HNF4A、APOA1、PPARA、CYP3A4、CYP2C9等功能基因表达水平异常。转录组数据显示T3和T4显著影响了上千个肝细胞发育和肝细胞功能相关的基因，表明该过程对THs处理极其敏感。肝细胞诱导早期，THs处理主要影响肝脏细胞的早期分化信号通路;而肝细胞诱导晚期，THs处理显著影响细胞代谢通路，包括脂肪代谢相关通路、氨基酸代谢相关通路、药物代谢通路、化合物致癌通路、ABC载体通路等。通过PPARA激动剂GFT505处理可一定程度上减弱T3暴露对肝分化的调控作用，如GFT505处理组脂代谢相关基因（PPARA、APOA1、APOA2、PPARR、APOA4、FABP7、APOA3等）的表达水平更接近对照组，表明该通路在THs介导的肝发育毒性中有重要作用，为“解毒”提供了一些思路和科学依据。　　(4)从THs样品转录组数据中筛选与肝发育和功能相关的差异基因，这些基因对T3和T4处理响应敏感，可作为标志基因用于鉴定和筛选THs类似物。共筛选得到69个潜在的标志基因，并已通过两个已知的THs类似物(BDE-47和BDE-209)进行验证。在肝分化过程中暴露10nM、100nM、1μM的BDE-47/BDE-209，分化第19天收样测定这69个基因的表达水平。结果显示，与对照相比，其中25个基因被至少一种BDEs显著干扰，这25个基因与化合物致癌、类固醇合成、P450酶药物代谢等通路相关。有17个基因对BDE-47和BDE-209均显著响应，包括:APOA1、AHR、PROX1、RXRA、CYP2C9、CYP2C8、HNF4A、CYP1A1、CYP3A7、THRA、THRB、PPARA、PROZ、CYP19A1、GNMT、HSD3B1、HPD。另外，该实验结果也证实了BDE-47和BDE-209对肝发育的干扰效应。这些筛选验证的标记基因可用于测定其它未知污染物是否具有肝发育毒性。　　综上所述，本论文利用胚胎干细胞分化模型探究了多种环境

关键词： 寨卡病毒   基孔肯雅病毒   蚊媒   重组腺病毒疫苗   重组痘苗病毒疫苗   复合型佐剂  

摘要： 寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一种经伊蚊传播的蚊媒病毒,该病毒于1947年乌干达地区首次发现,2015年在巴西引发大规模疫情的暴发并迅速扩散至美洲及亚洲的多个国家和地区。感染患者主要表现出神经系统疾病及新生儿小头畸形等症状。2016年2月世界卫生组织宣布寨卡病毒感染为“国际关注的突发公共卫生事件”。基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）于1952年坦桑尼亚地区首次发现,自2004年以来再次在全球范围内暴发疫情,该病毒主要以伊蚊为传播媒介,感染后引起患者发热、关节痛及皮疹等症状。随着全球经济贸易和旅游等的往来,近年来中国相继有输入性ZIKV及CHIKV感染患者,经伊蚊叮咬后具有潜在的暴发流行性。目前尚无有效的疫苗预防ZIKV与CHIKV感染。本研究对2018年云南部分地区蚊媒携带ZIKV及CHIKV流行情况进行检测,并对其遗传进化进行分析。利用人腺病毒5型载体和痘苗病毒天坛株载体构建共表达ZIKV和CHIKV结构蛋白的重组载体病毒候选疫苗,通过免疫小鼠验证重组载体疫苗的免疫原性及保护性。主要研究结果如下:（1）对2018年云南省普洱市及大理自治州等地区蚊媒携带ZIKV及CHIKV情况进行检测,结果显示:所采集的蚊媒样品中未检测到ZIKV;CHIKV阳性率为6.9%,病毒主要由埃及伊蚊和三带喙库蚊携带。遗传进化分析显示CHIKV属于ECSA亚型,与印度株和斯里兰卡株同源性较高,推测CHIKV可能通过斯里兰卡和印度经蚊媒传播至中国云南地区。此外,CHIKV毒株均不存在E1 A226V位点突变,表明所检测到的CHIKV可能不通过白纹伊蚊进行传播。（2）以ZIKV SY012016株prME、E基因及CHIKV 0706a TW株E2、E1及E2-6K-E1基因为基础,构建单独表达ZIKV及CHIKV结构蛋白的重组腺病毒和重组痘苗病毒候选疫苗,进行小鼠免疫试验。结果显示:腺病毒与痘苗病毒载体表达的ZIKV/CHIKV候选疫苗能诱导小鼠产生体液免疫及细胞免疫应答,抑制ZIKV/CHIKV在小鼠脏器内的复制。（3）将ZIKV prME及CHIKV E2-6K-E1基因分别连接到腺病毒与痘苗病毒穿梭质粒,包装共表达ZIKV prME蛋白和CHIKV E2E1蛋白的重组腺病毒rAd-ZIKV-CHIKV和重组痘苗病毒rdVTT-ZIKV-CHIKV候选疫苗,采用腺病毒Prime-痘苗病毒Boost策略免疫小鼠。结果显示:采用Prime-Boost免疫策略能诱导小鼠产生较强的体液免疫与细胞免疫应答。在攻毒ZIKV/CHIKV后,免疫组小鼠脏器及血液中病毒载量比对照组低1～2个数量级。表明采用异源Prime-Boost免疫策略,在降低载体自身免疫的同时,能够增强小鼠体液免疫及细胞免疫应答,抑制小鼠脏器内病毒的复制及病毒血症的发生。（4）以ZJ01佐剂、ZJ02佐剂为基础,分别添加A、B、C、D组份构建第二代复合型疫苗佐剂。将佐剂分别与重组痘苗病毒rdVTT-ZIKV-E和ZIKV E蛋白混匀后免疫小鼠,验证不同佐剂对载体疫苗和亚单位疫苗的免疫增强作用。结果显示:ZJ01佐剂与ZJ02佐剂辅以A组份和D组份的复合型佐剂能促进载体疫苗及亚单位疫苗产生更强的体液免疫及细胞免疫应答。免疫35 dpi时,血清中IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平及特异性抗体水平是不含佐剂组的1.50～3.35倍;中和抗体效价是不含佐剂组的1.75～2.5倍;CD4+T淋巴细胞是不含佐剂组的1.22～1.28倍;CD8+T淋巴细胞是不含佐剂组的1.02～1.09倍。表明含有A和D组份的ZJ01佐剂与ZJ02佐剂能更好增强载体疫苗和亚单位疫苗的免疫效果。综上所述,本研究检测云南部分地区蚊媒携带ZIKV及CHIKV情况,为中国云南ZIKV与CHIKV流行提供一定参考;利用腺病毒、痘苗病毒载体构建共表达ZIKV与CHIKV候选疫苗并采用异源Prime-Boost免疫策略免疫小鼠,在降低疫苗载体自身免疫的同时能够诱导小鼠体液免疫和细胞免疫反应,对攻毒的小鼠提供切实的保护作用;通过对佐剂的研究成功筛选出用于载体疫苗与亚单位疫苗的复合型佐剂,能够显著增强疫苗的免疫效果。本研究为ZIKV、CHIKV基因工程疫苗及复合型佐剂的研究奠定基础。

关键词： 富马酸   基因工程   大肠杆菌   TCA循环   葡萄糖转运途径   辅因子  

摘要： 富马酸是三羧酸循环(TCA)的中间产物,在许多领域具有广泛的应用。目前,富马酸主要以石油基产品为原料化学合成。然而,由于石油资源的不可再生性及化学合成法对环境的污染问题,急需开发一种富马酸生产的替代方法。生物发酵法具有成本低、易操作、环境友好等特点,日益受到人们的关注。近年来,随着基因工程、代谢工程技术的发展,研究者逐渐开始对各类天然产物的发酵及代谢过程进行人工设计和改造,以达到进一步提高发酵产率的目的。富马酸生产的天然菌株为根霉菌,由于其遗传及代谢背景尚不明晰,目前大多数关于富马酸代谢研究的工作多以模式生物大肠杆菌为平台,进行代谢及改造的研究。在实验室前期的工作中,以大肠杆菌JM109为平台,通过敲除富马酸还原酶基因(frdABCD)、富马酸酶基因(fumA、fumB与fumC)、局部转录因子(iclR)以及全局转录因子(arcA),构建了富马酸基因工程菌株Strain ABCDIA。该菌株发酵生产富马酸的产量有了明显的提高。然而,由于工作过程中敲除基因过多,导致菌体生物量下降明显,同时在工作过程中发现某些基因的敲除对富马酸产量的提高没有正面影响。基于上述问题本文的研究工作主要围绕以下几个方面展开:(1)以菌株Strain ABCDIA为基础,构建了半乳糖透性酶(GalP)转运体系,与PTS葡萄糖转运体系相比,菌株StrainABCDIA的富马酸产量提高了约50%。在此基础上,构建了苹果酸脱氢酶基因(mdh)敲除菌株,富马酸产量提高了约16.85%;进一步表达乙酰辅酶A合成酶基因(acs)后,富马酸产量显著提高,较菌株Strain ABCDI4提高了 115.49%。最后,以乙酸为碳源对上述重组菌进行发酵研究,为利用粗乙酸发酵生产富马酸提供了可行性依据。(2)基于前期工作中敲除基因过多,造成生物量严重下降的问题,经分析实验结果发现只有基因fumB、arcA的敲除对富马酸产量有积极影响。因而,对前期工作进行了优化整合,以菌株*** JM109为出发菌株,敲除其fumB、arcA基因。并结合半乳糖透性酶转运体系、共表达苹果酸脱氢酶基因(mdh)与柠檬酸合成酶基因(gltA)、构建乙酸回补途径。最终,将富马酸的产量由原始菌株*** JM109的5 mg/L提高至 77.9 mg/L。(3)研究能量代谢对产富马酸的影响,对胞内辅因子水平进行调节。通过过表达大肠杆菌自身转氢酶基因(sthA)与肺炎链球菌的NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)氧化酶基因(noxE),提高了胞内NAD+/NADH的比值。经发酵实验验证,富马酸的产量分别提高了 93.5%与 19.5%。

关键词： 核心启动子   转录调控元件   胚胎干细胞   体细胞突变  

摘要： 在真核基因组中,基因的表达受多种调控元件包括启动子和增强子的精细调控,尤其是高等生物,这种调控网络更加复杂,细胞发育的多样性与之密不可分,调控网络的失误往往会造成许多疾病和癌症的发生,因此研究启动子和增强子是十分重要的。传统启动子的定义是位于基因5'UTR附近一段几百到上千base pairs的DNA序列,包括100bp左右的核心启动子区域和上游与特异性蛋白结合的区域,随着二代测序的发展和对启动子和增强子的深入研究,科学家们发现人类全基因组70%的区域可以发生转录过程,并且部分活性较强的增强子也能转录出不稳定的较短的RNA产物,称为eRNA。我们把这些存在转录活性的启动子和增强子统称为转录调控元件。 核心启动子是一类具有特定序列特征的DNA片段,包括位于转录起始位点的INR序列和上游25bp左右的TATA box序列,因此我们可以通过DNA序列特征对候选转录起始区域的核心启动子进行识别。FANTOM机构利用CAGE技术对人类和小鼠的组织和细胞进行了全基因组的转录起始位点测序,定义了上百万个转录起始的富集区域。在这里我们使用四种核苷酸在100bp核心启动子区域的分布频率特征,用层次聚类将13万个robust核心启动子分为G0和G1,通过对这两类区域的表观组学修饰和core promoter motifs的差异分析,我们发现G0是一类富集在转录延伸区域上游并且富含T碱基的假阳性转录起始位点,随后我们用GM12878细胞系定义好的可信区域来训练逻辑回归二分类模型,再将该模型应用在上百万个FANTOM定义的转录起始区域,最后去掉了10.3%的假阳性CAGE peaks,得到940061个真实可靠的转录起始区域。为了更加深入地了解不同核心启动子的调控机制,我们用高斯混合模型对它们的CAGE表达量进行建模,得到3组DNA序列差异很大的核心启动子,除了众所周知的富含CpG岛和AT-rich的2类启动子外,我们还发现了新的一类GC-rich,但不富集CpG双核苷酸并且GC倾斜小于0表达量中等的核心启动子,这类核心启动子的发现,拓宽了我们对转录起始区域的了解,对促进转录起始区域调控机制的深入研究有重要的意义。 为了探讨核心启动子元件在细胞发育过程和癌症基因组中发挥的生物学功能和意义,我们分别将目标放在转录调控元件和体细胞突变上。一方面,我们以人和小鼠的胚胎干细胞为模型,研究二者在基因调控上的差异。我们将感兴趣的DNA序列一分为二,采取分段比对的策略,开发了一套跨物种同源映射的工作流程,确保关键位点(染色体开放区域DNase peaks的中点和核心启动子元件的dominant TSS位点)比对到参考基因组上的精准性。我们的研究结果表明,首先,通过人和小鼠全基因组可信转录起始集合的同源比对,明确了核心启动子元件在高等生物中的高度保守性,其次,染色体开放区作为转录起始位点的候选区域,是跨物种同源映射很好的桥梁,最后我们比较人H1hesc和小鼠Ese14的胚胎干细胞的基因表达调控,从转录调控元件的活性的差异的角度出发,通过GO功能分析和转录因子Motif富集分析,解释了二者在始发态(primed)和原始态(na?ve)两种不同胚胎多能性状态的差异。另一方面,我们从ICGA数据库(包括来自TCGA的)中收集了来自56个项目的7367个WXS样本和4988个WGS样本的体细胞突变数据,描述了各类癌症在核心启动子区域的单碱基突变情况,通过核心启动子区域的热点分析(hotspot analysis),筛选出每种肿瘤的候选driver区域。此外,我们还对每种癌症类型在核心启动子元件的突变比例和附近区域的突变分布进行了统计分析,发掘了在核心启动子区域由两种不同的突变机制诱发的突变情况,分别是结直肠癌(COCA)错配修复系统缺失形成在转录起始位点以及下游的高频突变和皮肤癌(MELA)核苷酸切除修复在转录因子结合位点的低效率造成核心启动子上游的高频突变,这些突变规律的发现,为更好地研究肿瘤发生的机制和癌症诊断治疗做出铺垫。 综上所述,本论文以转录起始区域的核心启动子为中心,从DNA序列和表观组学两个方面揭示了转录起始发生的特征,并且通过人与小鼠的胚胎干细胞模型和来自56个项目的癌症体细胞突变数据,从生物角度上说明了全基因组转录起始位点研究的重要性。

关键词： 胚胎干细胞   临床试验   干细胞产业   细胞治疗   临床研究   再生医学   干细胞技术  

摘要： 中国干细胞基础研究与国际同行同时起步,但进入临床研究环节,前期由于管理不够完善,近几年落后于其他发达国家。1月30日,中国整形美容协会《干细胞制剂制备与质检行业标准(试行)》在上海正式发布。这是目前国内干细胞领域首个聚焦干细胞制剂制备与质检的行业标准。该行业标准由中国整形美容协会干细胞研究与应用分会会长、同济大学附属东方医院院长刘中民教授研究团队,在征求近30名干细胞

关键词： 血浆游离DNA   全基因组   DNA甲基化   片段化模式   微量DNA建库  

摘要： 随着液体活检技术的发展,血浆游离DNA成为当前的研究热点之一。血浆游离DNA的全基因组甲基化测序被认为在癌症检测等医学应用拥有巨大潜力,但目前尚缺乏针对该实验流程的实用稳定性评估。文中利用两名志愿者在不同时间采样的血浆游离DNA,在不同实验平台分别进行DNA甲基化的重亚硫酸盐转化前建库(Pre-BS)、转化后建库(Post-BS)和常规DNA建库,获取多因素影响下的测序数据样本。在此基础上,建立了一套血浆游离DNA测序数据分析的质量控制参考流程,综合评估了血液采集提取、游离DNA建库测序过程的实用稳定性,为血浆游离DNA全基因组甲基化测序应用于临床液体活检提供实用性的基础参考。