教学课程资源库 更多>>

关键词： 病毒性胃肠炎   诺如病毒   VLPs   重组植物乳杆菌   免疫   抗原递呈  

摘要： 研究背景:病毒性胃肠炎,又称病毒性腹泻,是一种影响所有年龄段人的常见疾病,每年造成严重的全球性的社会和经济负担,容易造成婴幼儿和老年人严重脱水引发并发症甚至死亡。其主要由轮状病毒、诺如病毒等病毒引起,严重危害大众健康和日常生活。由诺如病毒或轮状病毒感染引起的病毒性胃肠炎每年将造成高额的经济负担,因此各国科研人员努力制造有效的疫苗。针对轮状病毒的预防疫苗已有被批准使用的商品化疫苗,且具有良好的免疫效果。而诺如病毒预防性疫苗还没有被批准使用的商品化疫苗,部分研究处于临床阶段试验。因此本论文针对诺如病毒疫苗进行研究。诺如病毒(Norovirus,NoV)是目前引起全世界急性胃肠炎的主要病原体之一,每年约造成6.99亿人次的感染。NoV为RNA病毒,易变异,环境耐受强,具有极高的传染性,是诱发大规模传染的潜在病原。在2016年冬季GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒开始在亚洲地区出现流行,其具有很强的感染性和复制性特点,说明了该毒株大流行的潜力,已受到人们关注。创新点:1.确定了吉林省部分地区病毒性胃肠炎流行特征。2.成功获得了 GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒病毒样颗粒(VLPs)以及表达GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒VP1蛋白的重组植物乳杆菌***1,免疫后可以刺激小鼠产生细胞及体液免疫应答反应。3.证实了重组植物乳杆菌***1通过TRAF2/NF-κB信号通路的激活,诱导树突细胞(DCs)成熟进行抗原递呈,诱导T细胞向Th1型分化,初步阐述重组植物乳杆菌免疫机理。研究目的:探索吉林省部分地区病毒性胃肠炎的流行特征,为病毒性胃肠炎防控提供数据支撑;构建了 GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒的VLPs是以及重组植物乳杆菌,并对两种基因工程疫苗免疫原性进行了免疫效果评价。并对重组植物乳杆菌***1对DCs的免疫应答机理进行了进一步研究,为诺如病毒新型疫苗的研发和免疫机理研究提供理论支持。研究方法:1.收集吉林省部分地区腹泻患者的样品,利用RT-PCR进行检测,分析吉林省病毒性胃肠炎的感染情况。2.通过杆状病毒表达系统制备GⅡ.P16-GⅡ.2重组型诺如病毒的VLPs,并利用 PCR、Western blot、Indirect immunofluorescence assay(IFA)以及透射电镜观察等检测技术,构建并鉴定诺如病毒VLPs。3.通过PCR、Western blot、IFA、流式细胞检测以及扫描电镜和透射电镜观察等检测技术,构建并鉴定诺如病毒重组植物乳杆菌***1。4.通过Western blot、CFDA-SE染色流式细胞检测以及小动物成像等检测技术,分析了重组植物乳杆菌***1的体内定植增殖情况;并利用Western blot、血常规检测以及HE染色等实验方法,分析了重组植物乳杆菌***1的体内病理损伤情况。5.通过免疫小鼠后特异性IgG检测、IgG分型检测、B淋巴细胞活化、T淋巴细胞活化与增殖、T淋巴细胞亚型检测以及CD8+记忆T淋巴细胞检测等检测手段,分析评价了两种基因工程候选疫苗的免疫原性。6.通过了流式细胞仪检测、细胞因子检测、qPCR、Western blot、IFA以及免疫组化等实验方法,分析了重组植物乳杆菌***1和树突细胞(DCs)之间的相互作用关系以及***1对DCs激活递呈机制通路。研究结果:1.通过RT-PCR检测了吉林省部分地区病毒性胃肠炎患者的临床样本,明确了病毒引起腹泻率为27.62%,其中轮状病毒为主要感染病原,占58.14%。而诺如病毒引起的病毒性胃肠炎占9.30%。***、Western blot、IFA以及电镜观察等结果表明,利用杆状病毒表达系统成功获得了诺如病毒VLPs。***、Western blot、IFA等实验结果表明,重组植物乳杆菌可以表达诺如病毒的VP1蛋白。并通过扫描电镜以及透射电镜观察重组植物乳杆菌的形态,证明了重组植物乳杆菌可以表达的VP1蛋白成功并锚定在重组植物乳杆菌菌体表面。*** blot结果表明,连续传代、诱导时间、人工胃液和人工肠液对重组植物乳杆菌表达诺如病毒VP1蛋白没有影响,证明了 ***1的稳定性;通过流式细胞仪以及小动物成像系统观察CFDA-SE染色的***1体内定植情况,证明了重组植物乳杆菌***1可以定植在体内并增殖;重组植物乳杆菌***1可以体外诱导Caco-2细胞高表达ZO-1、Claudin-1以及Occludin等紧密连接或闭合蛋白,证明***1可以增强细胞对病原的抵抗能力。通过血常规检测、体重/生存观察以及HE染色等实验方法,确证了重组植物如杆菌***1体内的安全性。5.免疫小鼠后,诺如病毒的VLPs以及重组植物乳杆菌可

关键词： ZFP281   AFF3   增强子   基因组印记   胚胎干细胞  

摘要： 基因组印记是一种特殊的表观遗传学调控,以亲本特异性方式影响基因表达。印记基因座内顺式调控元件与表观遗传调控机制和转录因子共同作用,严格以等位基因特异性表达模式调控印记基因的表达。已知,印记控制区(imprinting control regions,ICR)与增强子是两个主要的顺式作用元件来调控印记基因的亲本特异性表达。这些顺式调控元件在印记区域相互作用模式被破坏时,可导致印记基因表达缺陷,其表达紊乱可引发多种人类先天性疾病,例如天使综合征(Angelman Syndromes,AS)、普-威综合征(Prader-Willi Syndromes,PWS)和贝-威综合征(Beckwith–Wiedemann Syndromes,BWS),以及许多癌症。已有报道显示含有P-TEFb的超伸长复合物(Super elongation complex,SEC)和类超伸长复合物(Super elongation complex-like 2/3,SEC-L2和SEC-L3)可参与调控不同的基因表达,在发育和疾病中具有功能特异性。已经证明,AFF3是类超伸长复合物3(SEC-L3)的中心成分,可结合在Dlk1-Dio3印记基因座内的基因间差异甲基化区域(intergenicdifferentially methylated region,IG-DMR)和Meg3增强子处,以调节小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞中该基因簇中的等位基因特异性基因表达。AFF3富集在IGDMR依赖于ZFP57,但是,尚不清楚Meg3增强子处AFF3是如何调控等位基因特异性基因表达模式及其作用的分子机制。Krüppe1样锌指转录因子ZFP281是调控小鼠胚胎干细胞多能性的主要调节因子。我们通过从头基序分析小鼠ES细胞中AFF3富集的增强子区域鉴定了ZFP281的保守识别序列。随后,全基因组分析进一步确定了ZFP281作为关键性因子在许多增强子处与AFF3共定位,并介导了AFF3在染色质的定位,进而共同调控靶基因的表达。在印记控制区,如Dlk1-Dio3印记基因座,ZFP281与AFF3特异性地结合在其增强子上,而非IG-DMR处。随后的功能分析表明:ZFP281可以以等位基因特异性方式调节增强子活性,并募集AFF3到Meg3的上游增强子处,进而通过调控其转录延伸,以确保相关印记基因的单等位基因特异性表达。利用shRNA介导的RNAi将Zfp281敲除时,AFF3在Meg3上游增强子的募集受到影响,Meg3多顺反子的表达下调。因此,我们鉴定出AFF3被募集至增强子的调节子,并揭示AFF3在印记Dlk1-Dio3基因座中Meg3多顺反子转录表达调控的分子机制。我们的结果表明,不同的锌指蛋白,例如ZFP57和ZFP281,可以募集AFF3到不同的调节元件,并以特异位点差异性方式调节AFF3的不同功能。

关键词： 水稻育种   基因工程育种   矮化育种   基因工程技术   田间试验   杂交水稻   绿色革命   粮食安全  

摘要： 水稻是我国主要的粮食作物,水稻的产量将会对我国的粮食安全以及社会经济的发展等产生至关重要的影响.水稻育种的质量将会直接影响到水稻的品质与水稻的产量,例如,矮化育种带来了绿色革命,杂交水稻的开发等,这些都是通过水稻育种所带来的巨大优势.随着水稻育种技术的不断完善,育种的进步变得更加困难,在此背景下,基因工程技术在水稻育种中的应用为人们提供了新的途径,通过基因工程技术,能推动育种的进步,目前,世界范围内进入田间试验的转基因植物已经超过的500种,这些都是基因工程技术所带来的优势,推动了基因工程育种的发展.

关键词： 麦草畏   甲基转移酶   结构解析   催化机制   定向进化   抗除草剂转基因  

摘要： 抗除草剂转基因作物的应用显著提高了杂草控制的效率,创造了巨大的经济价值。目前,具有抗草甘膦性状的转基因作物应用最为广泛。但长期配套施用草甘膦已导致了严重的杂草抗性问题。因此,迫切需要寻找新的靶标除草剂,并开发相应的抗除草剂转基因作物以应对草甘膦抗性杂草。麦草畏是一种安息香酸类除草剂,具有高效、低毒、廉价和杂草抗性产生慢等优点,被认为是理想的转基因靶标除草剂。孟山都公司利用麦草畏脱甲基酶基因dmo研发的抗麦草畏转基因作物已实现商业化,每年推广面积超过2亿亩。相比而言,目前我国在抗除草剂转基因方面的研究还很薄弱,缺乏具有自主知识产权的抗除草剂基因(酶)资源,严重影响了我国抗除草剂转基因育种的研发和应用。本课题组在前期研究中分离到一株麦草畏降解菌Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20,并从中克隆到一个新的麦草畏脱甲基酶基因dmt50,在抗除草剂转基因工程方面具有潜在的应用价值。与单加氧酶DMO不同的是,Dmt50为THF(四氢叶酸)依赖型甲基转移酶。本研究对Dmt50的酶学特性、结构以及催化机制进行了研究,通过定向进化筛选获得了 Dmt50酶活提高的突变体,并对dmt50转基因拟南芥的麦草畏抗性进行了评估。取得的主要研究结果如下:1、麦草畏脱甲基酶Dmt50酶学特性研究使用pET29a(+)表达载体在Escherichia coli BL21(DE3)中外源表达Dmt50,经亲和层析纯化获得了 Dmt50纯酶。酶学实验表明,Dmt50能够在THF(四氢叶酸)存在的情况下,将麦草畏的甲基转移至THF,生成5-methyl-THF(5-甲基四氢叶酸)和无除草活性的产物3,6-DCSA(3,6-二氯水杨酸)。该反应受到产物5-methyl-THF反馈抑制,麦草畏最终转化率约35%。利用Mthfr(亚甲基四氢叶酸还原酶)进一步转化5-methyl-THF,可以解除其对Dmt50的反馈抑制,使麦草畏能够被完全转化。在解除产物抑制的条件下,测得0.1 mg Dmt50催化麦草畏甲基转移反应(300 μL体系)的Vmax=0.041 mM/min、Km=0.247 mM、kcat=6.589 min-1、kcat/Km=26.698 min-1·mM-1。2、麦草畏脱甲基酶Dmt50晶体结构解析与催化机理通过对蛋白结晶条件的筛选和优化,获得了 Dmt50蛋白晶体与Dmt50-5-methyl-THF共结晶,并采用同源建模的方式解析了其三维结构。通过比较两者结构发现,Dmt50 N末端Ile28-Thr39为一段柔性区域,Dmt50在结合5-methyl-THF后,该柔性区域形成了一个α-helix,并将中央空腔一侧封闭,形成催化口袋。麦草畏与Dmt50的分子对接结果显示,该区域参与底物麦草畏的定位并有可能影响底物的进入方式。Dmt50在催化麦草畏甲基转移的过程中,麦草畏首先进入活性中心,THF随后进入;THF与Dmt50结合后,触发Dmt50柔性区域构象变化形成α-helix,将麦草畏锁定在活性中心;Tyr253和His69与麦草畏甲氧基中的氧原子形成氢键,使氧原子质子化,进而使甲基活化;THF N5上的孤对电子对活化后的甲基进行亲核攻击,完成甲基转移,形成 3,6-DCSA 和 5-methyl-THF。3、Dmt50高酶活突变体的筛选利用Dmt50的酶反应产物3,6-DCSA与FeCl3的显色反应,建立了一套Dmt50高酶活突变体的筛选方法。最终,运用定点饱和突变与定向进化,筛选获得了一个酶活提高约15.6%的Dmt50突变体(Mutant)。该突变体包含了大量位点突变,但仅有4个突变位点(F32Y、I43V、M263I、I318L)位于关键区域(Ile28-Thr39柔性区域,活性中心区域,以及叶酸结合区域)中。为了研究这些位点突变对酶活的影响,我们进一步构建了 Dmt50 F32Y-I43V-M263I-I318L 突变体和 Mutant F32Y-I43V-M263I-I318L 回复突变体。酶学实验结果表明,这4个位点的突变对于突变体酶活提高是必要的,但是仅有这4个突变的突变体酶活提高不显著。Dmt50突变体酶活提高的机制可能是由于大量突变位点造成的综合效应降低了 5-methyl-THF的亲和力,从而部分解除产物抑制并最终提高了麦草畏的转化率。4、dmt50基因与mthfr基因共表达提高转基因拟南芥的麦草畏抗性利用dmt50基因构建了dmt50转基因拟南芥,并对其麦草畏抗性进行了评估。平板抗性实验结果表明,1 mg/L麦草畏处理下,转基因拟南芥根发育正常,叶片仅出现轻微卷曲,鲜重显著高于野生型拟南芥(P<0.05);土壤喷药实验结果表明,dmt50转基因拟南芥能够耐受560g/ha(1×常用大田应用浓度

关键词： 基因工程   抗菌肽   毕赤酵母   椭圆小球藻  

摘要： 随着水生生物高密度养殖的普遍发展，水产业面临着各类病害频繁发生的难题，抗生素是防治养殖病害的传统方法，但抗生素会导致生物安全性与环境污染问题。抗菌肽由于其独特的抗菌机理，使细菌不易对其产生耐药性，且因代谢速度快而不会在机体中产生有害残留，被认为是潜在的传统抗生素替代品。由于抗菌肽的人工合成成本较高，又难以直接从生物体内分离获得大批量抗菌肽，采用基因工程技术重组表达抗菌肽是目前较为可行的抗菌肽制备途径。酵母和小球藻具有丰富的蛋白质、脂质、维生素和活性代谢产物，具备多种生物功能，可作为优质的单细胞蛋白源应用于饲料产业。利用基因工程在酵母及小球藻中表达抗菌肽将为抗菌肽在水产生物饵料中的应用提供理论依据和前期基础。　　本研究以烟芽夜蛾的抗菌肽Heliomicin的突变基因序列HeM基因为目标基因，以毕赤酵母（Pichiapastoris）和椭圆小球藻（Chlorellaellipsoidea）为转化材料，建立了抗菌肽的两种表达系统。将HeM基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体，转入毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115中，建立了抗菌肽毕赤酵母表达系统。同时构建了HeM抗菌肽的植物表达载体，建立了磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻的遗传转化体系，并获得了表达抗菌肽的转化藻株。　　具体研究内容和结果如下：　　1．合成HeM基因序列，构建了毕赤酵母表达载体。将表达载体电转化至毕赤酵母，经过组氨酸缺陷型培养基筛选和PCR验证，获得了成功转化抗菌肽HeM的酵母菌种。经过甲醇诱导表达优化后，利用Tris-Tricine-SDS-PAGE进行目的蛋白检测，证明甲醇能够诱导HeM在毕赤酵母菌株中分泌表达产生HeM抗菌肽，抑菌实验结果表明，基因工程酵母的分泌总蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。　　2．通过对小球藻进行纯化培养及抗生素敏感实验确定30mg/L的G418作为椭圆小球藻基因工程的筛选标记。构建了抗菌肽HeM植物表达载体，利用磁性纳米颗粒作为载体，构建磁性纳米颗粒-表达载体复合物，在磁场作用下转化至椭圆小球藻原生质体，建立了磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻转化体系，并将抗菌肽HeM基因转化至椭圆小球藻中，通过G418抗生素筛选、PCR、RT-PCR和Tris-Tricine-SDS-PAGE检测，不同水平检测结果表明抗菌肽HeM基因成功转入椭圆小球藻中并进行了表达，对转基因小球藻蛋白进行抑菌性检测，抑菌实验结果表明，小球藻转化子细胞总蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。　　综上所述，本研究通过抗菌肽HeM在毕赤酵母中成功转化表达，初步探索了抗菌肽表达效果，随后基于纳米技术构建了磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻遗传转化体系，获得了含有抗菌肽的基因工程藻株，实现了抗菌肽HeM在椭圆小球藻中的有效表达，为抗病饵料微藻的开发与应用打下了重要基础。

关键词： 半夏   耐旱基因ER   HMGR   IAP   耐盐性   次生代谢产物   夏季休眠  

摘要： 半夏(Pinellia ternata（Thunb.）Breit)是一种传统中药,被广泛用作各种草药配方的主要成分。半夏药用部位是根茎,具有多种药理活性,可用于治疗肿瘤、炎症、咽痛、咳嗽、恶心呕吐、痴呆、失眠、哮喘、子痫、肥胖、高血压、高血糖、高尿酸血症、过敏性鼻炎以及祛除痰、脾、腹中湿气。半夏次生代谢产物含量丰富,其中萜类化合物、生物碱和苯丙烷的比例较高。但这些化合物的数量和多样性受遗传变异和环境因素的影响。半夏主产地是中国、韩国和日本等东亚国家。它是多年生植物,最初生长在中等温度（15-27~oC）,潮湿阴暗的环境中,例如林中、溪边和路旁。半夏耐受性不强,高温、干旱、盐碱化、疾病和涝灾都会对它的生长造成压力。在中国中部和南部,夏季温度超过35~oC,半夏会进入休眠状态。每年在夏季炎热时段的前后,半夏都有两个典型的生长周期。然而北方地区的半夏种植者更喜欢华中地区的半夏种质资源,因为在凉爽地区收获的块茎种子生长周期更长。因此,本研究的目的是通过基因修饰来改善半夏的农业和商业特性。我们在半夏内过表达了三个基因,即热响应性受体样激酶ERECTA（ER）,甲羟戊酸还原酶（HMGR）和凋亡抑制因子（IAP）,以达到以下目的:1)探索植物生长周期的变化,（2）提高转基因品系中次生代谢产物的含量（3）分别提高转基因半夏植物对干旱和盐胁迫的耐受性。通过农杆菌介导的转化产生过表达ER,HMGR和IAP的转基因品系,并在Ca MV35S启动子的转录控制下组成性表达。来自所选转基因品系的RNA的RT-q PCR分析证实了转基因植物中相应转基因的表达水平显着提高。为了进行耐热性研究,将ER转基因品系（Ca MV35S::ER和Ca MV35S::HMGR+Ca MV35S::ER）在培养箱中以高温（35~oC/40~oC）处理或在室外小钵中生长,通过测量农艺性状分析植物生长性能。结果表明,转基因植物显示出比带有空载体的对照植物（EV）更强的耐热性（P<0.05）。与EV相比,转基因品系叶片保持绿色并且健康生长,而对照植物出现叶片坏死、萎黄,生长发育迟缓和叶脉加深。生理生化分析也证实了转基因植物具有显著的耐热性。在室外试验中,转基因基因型植株夏季高温休眠中断,存活率为84%-95%。除转基因系ER118外,转基因基因型植株的块茎重量均显著提高（P<0.05）。夏季休眠中断的ER分子机制仍需进一步研究。同样,IAP过表达的转基因半夏植物表现出更强的抗旱和抗盐胁迫能力。从转基因品系中诱导的悬浮培养物与从对照植物中诱导的相比,存活时间更长,即对0.2 g/L Na Cl胁迫处理的耐受力更强。约67.1%-77.4%的转基因品系细胞在胁迫下存活了48小时,在此期间,仅30.34%的EV对照品系细胞存活。相对于对照植物,经过0.2 g/L甘露醇处理的转基因幼苗还表现出更好的抗干旱能力,这可以通过明显的延迟枯萎,更高的枝条生物量,更少的氧化损伤和增强的活性氧清除酶活性来证实。在代谢物含量调查中,选择并分析了6条HMGR上调系（Ca MV35S::HMGR和Ca MV35S::HMGR+Ca MV35S::ER,各3条）。与对照植物相比,转基因植物中香树烯-4、10-二醇和4、8、13-环十四碳三烯-1、3-二醇,1、5、9-三甲基-12-（1-甲基乙基）-萜类生物活性化合物的含量显著提高。同样,在转基因基因型中,光合色素（叶绿素a,b和类胡萝卜素）,总蛋白含量和HMGR酶活性的水平也明显高于对照。总之,长期进化导致的半夏夏季休眠被单个热响应基因ER强力清除,HMGR改善了代谢物含量。IAP还增强了对盐和干旱胁迫的耐受性。因此,本研究最终有助于产生具有商业价值的化学型耐环境胁迫的新半夏。

关键词： 大肠杆菌   基因工程疫苗   重组蛋白   戊型肝炎疫苗   人乳头瘤病毒疫苗   脑膜炎球菌疫苗  

摘要： 大肠杆菌具有生长快速、培养成本低、遗传背景清楚等特点,已被广泛地应用于重组蛋白类药物的表达和生产。近年来,几种基于大肠杆菌表达的基因工程疫苗已投入市场(戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、脑膜炎球菌疫苗等)或进入临床研究(流感A型疫苗、疟疾疫苗、炭疽疫苗等),显示了大肠杆菌表达系统在疫苗研发中良好的应用前景。本文综述了大肠杆菌原核表达系统在基因工程疫苗研究中的应用与策略优化,包括已上市或进入临床疫苗的概述、大肠杆菌表达系统用于疫苗生产的可优化策略(二硫键形成、糖基化以及内毒素去除等),为大肠杆菌重组表达策略改进和基因工程疫苗的研发提供参考。

关键词： Bacillus (Bacteria)Genetic engineeringShikimic acidAromatic compounds--SynthesisMetabolites--Synthesis  

摘要： Numerous widely-used chemicals, such as adipic acid, are produced from hydrocarbons that come from petroleum. Consumption of petroleum contributes to global climate change and ocean acidification, which has created a great need for the development of petroleum independent chemical synthesis methods. Recently, considerable interest has turned toward using methanol as a feedstock for chemical synthesis because of its abundance, ease of purification, and lack of ties to the food industry. Adipic acid precursor cis,cis-muconic acid has been biosynthesized in a variety of production hosts, but it has not been biosynthesized using a methanol feedstock. In this work, groundwork was laid for genetically engineering the thermophilic, methylotrophic bacterium Bacillus methanolicus MGA3 for cis,cis-muconic acid production from methanol via the shikimate pathway. The first enzyme in the shikimate pathway is 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase. This enzyme has been shown to play an important role in the regulation of carbon flow into the pathway. B. methanolicus MGA3 DAHP synthase isozymes AroG1 and AroG2 were characterized. Both isozymes were found to be Type Iβ DAHP synthases, with AroG1 being unregulated at the protein level and AroG2 being allosterically regulated by the aromatic amino acid precursors chorismate and prephenate. Additionally, methods for storing and screening B. methanolicus shikimate pathway mutants were developed. The established storage method allows B. methanolicus to be mutagenized in large batches and subsequently stored as spores. Agar plate growth medium recipes were developed for germinating B. methanolicus spores and phenotypic screening of mutants.

关键词： 胚胎干细胞   白血病抑制因子   表观遗传   DNA甲基化   LIF依赖   动物模型  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)是从着床前胚胎的内细胞团中分离获得的一种具有无限增殖能力和不同胚层分化能力的细胞。自从1981年首次建立小鼠多能性胚胎干细胞以来，人们一直在优化ESCs体外培养体系。目前为止存在以下几种具有代表性的培养体系：饲养层细胞/血清、血清/LIF、BMP4/LIF和2i/L(GSK3抑制剂CHIR99021，MEK1/2抑制剂PD0325901和LIF)。2i/L培养体系是目前使用最为广泛的一种ESCs培养体系，它主要通过经典的WNT，FGF/ERK和JAK/STAT3信号通路来调节ESCs的na?ve多能性。据报道WNT，FGF/ERK和JAK/STAT3信号通路中的任何两种信号通路的联合使用均足以维持胚胎干细胞的自我更新能力。然而，尚不清楚WNT，FGF/ERK和JAK/STAT3信号通路中是否存在一种信号通路的单独使用就可以维持ESCs的多能性和自我更新能力。　　在本研究中，我们为了确定ESCs自我更新过程中哪个信号通路起关键的作用，重点探讨了JAK/STAT3信号通路。探究单独使用LIF能否维持小鼠胚胎干细胞的体外自我更新能力;同时建立LIF依赖性小鼠新型胚胎干细胞系(L-ESCs);分析其多能性维持及嵌合体发育能力;揭示其基因表达特征、DNA甲基化水平和组蛋白修饰状态等，获得如下研究结果：　　1.建立LIF依赖性胚胎干细胞(L-ESCs)　　首先，我们以实验室已建立的新型胚胎干细胞(ASCs)和2i/L-ESCs为材料，ASCs和2i/L-ESCs用只含有LIF的培养液进行培养。结果显示，单独使用LIF可维持小鼠ESCs多能性，并建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系，我们将其命名为L-ESCs。而且L-ESCs具有与2i/L-ESCs类似的多能性特征，可贡献嵌合体胎儿的各个组织，并得到健康的嵌合体小鼠。下面的分子特征分析实验如未特殊说明均使用从2i/L-ESCs转换获得L-ESCs为材料开展实验研究。　　2.L-ESCs的分子特征分析　　通过转录组测序、全基因组DNA甲基化测序和组蛋白修饰等分析结果表明，我们获得的L-ESCs具有与2i/L-ESCs类似的多能性基因表达水平，而且从整体基因表达上，L-ESCs处于2i/L-ESCs和S/L-ESCs的中间状态;L-ESCs具有较高的整体DNA甲基化水平和印记基因DNA甲基化水平;同时，L-ESCs中整体H3K27me3水平比2i/L-ESCs和S/L-ESCs高。这表明L-ESCs具有与2i/L-ESCs和S/L-ESCs不同的基因表达水平、DNA甲基化水和组蛋白修饰状态。　　***甲基化对L-ESCs多能性维持起重要的作用　　为了研究DNA甲基化从ASCs和2i/L-ESCs向L-ESCs转换过程和L-ESCs自我更新过程中的作用，我们在ASCs和ESCs中分别敲除Dnmt3a和Dnmt3l后探讨向L-ESCs转变的过程。研究结果显示，Dnmt3a和Dnmt3l的缺失显著降低ASCs和2i/L-ESCs向L-ESCs转换效率;此外，我们把已建立的L-ESCs用DNA甲基转移酶抑制剂处理发现，抑制DNA甲基化水平后L-ESCs很难维持其自我更新能力;但是，DNA甲基转移酶抑制剂处理后的2i/L-ESCs多能性未受影响。以上结果说明，DNA甲基化对L-ESCs的获得和自我更新能力起重要的作用。　　通过以上研究，我们单独使用LIF培养条件下获得了一种新型DNA甲基化水平较高的胚胎干细胞系，即L-ESCs。如此简单的ESCs体外培养体系将为ESCs的分子机制研究提供理论依据。

关键词： 人胚胎干细胞   胎盘   滋养干细胞   BMP4  

摘要： 目的用BMP4诱导hESC分化为滋养干细胞样细胞后持续扩增,建立hESC来源的滋养干细胞系并鉴定其特征。方法无饲养层条件下用10ng/ml浓度的BMP4诱导单细胞hESC细胞系H9分化为滋养干细胞样细胞,通过添加EGF,Wnt信号激动剂,TGFβ、HDAC及ROCK信号抑制剂的培养基维持细胞增殖传代,运用免疫荧光、流式等方法检测CTB标志物CDH1、EGFR、P63、TFAP2C、CDX2、和TEAD4,单核滋养细胞标志物GATA3,滋养细胞共同标志物KRT7,EVT标志物HLA-G,STB标志物SDC1,hESC的标志物OCT4的表达情况,计算TS建系过程中CDH1和KRT7的阳性细胞率,绘制细胞增殖曲线,并通过NRG1+Matrigel或Forskolin使TS分别向EVT及STB分化。结果BMP4诱导hESC分化四天的细胞光镜下呈现单核的扁平的滋养干细胞样形态,此时CDH1、EGFR,KRT7的阳性细胞率分别为81.00%,58.00%和75.67%,证明此分化体系的效率较高。之后该细胞能在TS medium中良好适应。传至第三代的细胞CDH1的阳性比例为88.08%,KRT7的阳性比例为91.38%,表达GATA3,P63,TFAP2C,CDX2和TEAD4,不表达HLA-G,HCG和OCT4,并且可以同时向EVT、STB样细胞分化,证明获得了高纯度的TS细胞。但是随着培养时间的延长,TSP5的EGFR阳性率降为12.5%,CDH1及KRT7阳性比例也出现下降,但仍有约60%的细胞表达CTB的标志物。之后,在TS传代至第七代时细胞增殖能力明显减弱,几乎检测不到CDH1和KRT7的表达。结论BMP4诱导hESC模型可以获得增殖能力有限的滋养干细胞,之后仍需要进一步优化此分化模型的培养体系。同时需要进一步鉴定我们获得的TS究竟属于滋养细胞发育的何种阶段。