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关键词： 二硫化钼   纳米孔   分子动力学模拟   吸附取向   DNA测序  

摘要： 近年来,基因测序在疾病预测和治疗上显示出巨大的应用价值,发展高效的基因测序技术具有重要意义。目前,固态纳米孔测序被认为是最具潜力的新一代测序方法,其中,二维单层二硫化钼纳米材料因具有优异的电子性能和机械性能、易制备、以及价格低廉等特点而备受关注,被认为是非常有前途的可用于基因测序的纳米材料。针对固态纳米孔DNA测序低分辨率的问题,本论文利用分子动力学模拟的方法,探索了DNA在二硫化钼表面的吸附行为,并基于DNA在二硫化钼表面的吸附取向,进一步探索了在电压和牵引力两种作用模式下,电压、纳米孔直径、牵引力和电荷等因素对利用二硫化钼纳米孔DNA测序的影响,并通过分子模拟获得了最佳二硫化钼纳米孔测序模型,对实验提供了有益的指导。本论文具体结论如下:1、从分子水平探讨了不同初始取向的DNA在二硫化钼表面的吸附行为,研究结果表明,初始构型为水平和垂直的DNA体系均倾向于垂直吸附在二硫化钼表面,且DNA在二硫化钼表面的吸附取向不受DNA双链的顺序和长度影响。其原因是DNA两侧的磷酸根与二硫化钼中的硫原子存在较强的静电斥力,导致DNA无法水平吸附在二硫化钼表面,且DNA在范德华力的作用下倾向于通过端部的残基吸附在二硫化钼表面。该部分研究证明,DNA的吸附取向行为有利于二硫化钼纳米孔的DNA测序。2、基于DNA取向的研究,本论文进一步探讨了电压和纳米孔直径对DNA通过二硫化钼孔道时离子电流的影响,揭示了电压和纳米孔直径对DNA测序的影响。研究结果表明,DNA链通过二硫化钼纳米孔的时间随着电压的增加而减小,且单个碱基通过纳米孔的时间也随着电压的增加而减少。此外,DNA通过二硫化钼纳米孔的几率随着孔径的增大而增大。3、最后,本论文还探讨了牵引力和二硫化钼的原子电荷分布对DNA测序的影响。研究表明,二硫化钼纳米孔测序的单碱基分辨率随着牵引力的增加而降低。同时,测序的分辨率随着二硫化钼的原子电荷的增加而减少。在最佳外界因素的二硫化钼模型下,纳米孔能够有效区分四种不同类型的碱基,实现高分辨率的单碱基测序。

关键词： 人体胚胎干细胞   可专利性   知名形象   法律保护   专利法  

摘要： 现如今，人体胚胎干细胞的医疗价值越来越多的被人们所挖掘出来，其在医疗领域的相关技术使得人们的健康得到了更多的保障。由于专利法并没有对人体胚胎干细胞发明客体范围作出具体限定，部分人体胚胎干细胞发明得不到专利法的有效保护。近年来，人类胚胎干细胞技术的发展越来越成熟，而专利法对于该领域的保护受到相应挑战。关于人体胚胎干细胞相关发明是否应当被纳入专利法保护范围的现实案件也逐渐变多，理论与实务的摩擦接连不断，而新的《专利审查指南》也对人类胚胎干细胞相关内容作出新的修改。　　在《专利法》指导下，人体胚胎干细胞发明客体地位该如何认定，应当从多个方面去考虑。人体胚胎干细胞专利客体所引发的问题归根结底是对人类道德伦理的挑战，而道德又是一种社会意识形态，是人们共同生活及其行为的准则和规范，也是对人们行为的一种潜在约束，而行为道德标准也会随着社会的发展而产生相应的变化;人体胚胎干细胞研究领域的现有政策反映了一国对该领域所秉持的支持或者反对的态度。而政策的支持与否，将会对该领域的未来发展产生重大的影响;通过一国在人体胚胎干细胞研究领域的立法和判例能够看出该国家对此研究领域是保持开放的态度，亦或者是保守态度。究其根本，是因为不同国家有着不同社会背景、历史文化、宗教信仰等。而这些立法与判例又能够为我国认定胚胎干细胞发明客体地位所借鉴。　　我国最新修订《专利审查指南》将部分人体胚胎干细胞发明纳入了专利法保护的范围，但是仍有许多发明得不到有效的保护。人体胚胎干细胞领域研究是人类生命健康持续发展的新福祉。为使得更多的人体胚胎干细胞发明得到合理的保护，确保人体胚胎干细胞的的正确使用，应当尽快完善我国人体胚胎干细胞发明客体地位以及加快人类胚胎干细胞发明立法进程。

关键词： DNA测序   基因   sanger测序法   技术分析  

摘要： DNA测序技术发明于20世纪70年代,经过40多年的发展,现已成为分子生物学领域最常用的 DNA研究方法 之一.本文对第一、二、三代的DNA测序技术进行介绍,着重阐述其原理及主要的测速仪器名称,以及应用的主要领域.在此对DNA测序关键技术进行分析比较,为今后进行相关研究提供理论基础.

关键词： PEDV   间接ELISA   灭活疫苗   主动免疫保护   被动免疫保护  

摘要： 猪流行性腹泻病毒(PEDV)是世界范围内导致猪只产生腹泻的主要病原体之一,尤其近十年来PEDV造成了养猪行业巨大的经济损失。PEDV对各个年龄段的猪均有很高的感染率,能够引起猪只产生腹泻、脱水等症状,尤其能够引起7日龄以下的仔猪高发病率以及高死亡率。目前对PEDV防控最有效的方式是疫苗免疫,免疫形式包括主动免疫和被动免疫。对成年猪防控PEDV的措施主要为主动免疫,对幼龄仔猪防控PEDV的方式主要为被动免疫。因此,本研究以30日龄仔猪作为研究对象,通过实验猪的主动免疫效果来筛选重组灭活疫苗佐剂的种类,探索灭活疫苗的注射剂量;以妊娠母猪及其所产仔猪作为研究对象,初步探究PEDV 15A灭活疫苗的被动免疫效果。有效的疫苗免疫后可以诱导机体产生特异性的抗体,为能够监测实验室的新型重组疫苗诱导动物机体产生特异性IgG抗体的水平,本研究首先建立了检测PEDV IgG抗体的间接ELISA方法。以原核表达并纯化的PEDV S1蛋白片段(139aa)作为包被抗原,以羊抗猪IgG-HRP作为二抗,将每步反应程序优化并进行特异性、敏感性以及重复性试验。特异性试验显示该方法对TGEV、PoRV和PDCoV常见致猪腹泻病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验显示该方法能检测到稀释800倍的PEDV IgG阳性血清;重复性试验显示不同时间包被的试剂盒检测相同样品变异系数均小于10%。为了探究本研究室研制的PEDV重组灭活苗的佐剂类型,本研究选用21只30日龄的仔猪分成6组:DMEM组(3)、氢氧化铝佐剂组(3)、201佐剂组(4)、15A佐剂组(4)、Gel 02佐剂组(4)和715佐剂组(3)。通过肌肉注射灭活苗,免疫两次,第二次与第一次间隔两周。免疫后监测各组猪只IgG抗体水平变化,发现15A佐剂组实验猪抗体水平明显高于其他佐剂组,因此选择15A佐剂用于后续研究。为了探究灭活苗制剂的剂量与IgG抗体水平之间的剂效关系,本研究选用17只30日龄的仔猪分成6组:DMEM组(2)、0.6mL制剂组(3)、1mL制剂组(3)、2mL制剂组(3)、4mL制剂组(3)和8mL制剂组(3)。通过肌肉注射,免疫两次,第二次与第一次间隔两周。免后监测各组猪只IgG抗体水平变化,发现8mL组抗体水平明显高于其他组,2mL和4mL组抗体检测也呈阳性但是值略低,0.6mL和1mL分别有1只和2只抗体检测呈阳性。因此,在实验的剂量范围内存在明显的剂效依从关系。为了评估灭活苗制剂对于初生仔猪的被动免疫保护作用,本研究选用8只妊娠母猪分成两组:免疫组(4)和未免疫组(4)分别用灭活疫苗制剂和DMEM进行了产前30天和15天的肌注免疫。产后初生仔猪采食初乳4天后,免疫组随机挑选8只仔猪作为免疫攻毒组;未免疫组随机挑选8只仔猪作为未免疫攻毒组;在免疫组和未免疫组母猪产的其他仔猪中随机挑选13只仔猪作为哺乳期间抗体水平监测组。免疫攻毒组和未免疫攻毒组同时攻入肠毒株PEDV-XS12,临床观察显示免疫攻毒组仔猪攻毒后出现腹泻,但5天内未出现死亡,剖检可见部分肠段出现病变;未免疫攻毒组仔猪攻毒后出现严重腹泻,随后很快脱水,食欲不振,精神萎靡,发病2天内全部死亡,剖检结果可见肠壁组织病变严重,小肠充气变薄。仔猪PEDV抗体检测结果显示IgG抗体水平的高低与仔猪攻毒后的状态有显著的相关性,虽然可能因为攻毒毒株毒力太强及仔猪哺乳时间较短等因素导致所有实验猪发病,但是免疫攻毒组的仔猪生理状态在攻毒早期明显好于未免疫攻毒组。说明实验室制备的PEDV灭活疫苗制剂经肌肉注射母猪能够产生较好的主动免疫效果,仔猪在采食初乳后可以呈现明显的被动免疫保护。

关键词： 孤雌生殖   人类胚胎干细胞   专利适格性   人胚胎   社会公德  

摘要： 传统人类胚胎干细胞(HESC)技术不可避免需要破坏人胚胎才能获取HESC。随着干细胞技术的发展,开始出现回避伦理争议的新技术。其中,孤雌生殖HESC技术通过孤雌激活人卵母细胞,无需精子参与就能形成孤雌囊胚,从中获取HESC。大多数国家认为该技术回避了传统技术破坏胚胎的伦理争议,并且具有重大的医学价值。随着科学和伦理的发展变化,2019年11月我国新修正的《专利审查指南》放宽了HESC技术的专利审查标准,但仅仅规定了“利用未经体内发育的受精14天以内的人胚胎”获取HESC的相关发明不违背社会公德,可以授予专利。却未提及孤雌生殖HESC技术在我国能否具备专利适格性的问题。因此,本文将对该新技术的专利适格性问题进行研究。首先,介绍孤雌生殖HESC技术相比其他技术的优势。分析2016年我国知识产权局判定孤雌囊胚属于人胚胎,孤雌生殖HESC技术违背社会公德,因而不具备专利适格性而引发的争议案例。指出2019年《专利审查指南》修正后依然未能解决争议问题。其次,通过分析传统HESC技术与孤雌生殖HESC技术专利适格性审查中具有代表性的司法案例,梳理新旧技术发展的脉络,考察干细胞技术发达的美、欧、中、澳等国家对新旧两类技术的专利适格性认定,同时从传统技术的专利审查中获取对新技术有益的借鉴经验。再次,从我国利益平衡、伦理道德、干细胞产业政策导向和产业发展需要等方面出发,为论证我国应当授予孤雌生殖HESC技术专利权保护的正当性和必要性提供依据。最后,得出孤雌生殖HESC技术在我国具备专利适格性的结论。我国对该新技术的专利审查经验尚不成熟。笔者结合我国的实际情况,以前文作为基础和铺垫,为我国《专利审查指南》提供相应的完善建议。

关键词： 胚胎干细胞   岩藻糖基化   分化机制  

摘要： 细胞分化是一个复杂的生物过程，也一直是科学研究的热点问题。干细胞分化调控机制的研究可以为再生医学、发育缺陷治疗以及药物筛选等提供良好的理论支持。近年来，关于干细胞的研究越来越多，特别是诱导多能干细胞的出现使相关领域经历了巨大变革，而关于分化进程的调控机制仍存在着诸多未解之谜。　　在生物体内，岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)将岩藻糖供体(GDP-fucose)链接到蛋白N-糖链末端或氨基酸(丝氨酸或苏氨酸)残基上。越来越多的研究表明，岩藻糖基化在疾病发生、细胞分化、细胞间识别通讯等方面发挥着越来越重要的作用。例如，血型疾病、炎症和肿瘤的发生总会伴随着岩藻糖基化的急剧上升或下降。岩藻糖基化缺陷的小鼠表现出存活率低、发育不完全等缺陷。　　本文主要介绍岩藻糖基化在小鼠胚胎干细胞E14.1分化过程中发挥的作用以及分化过程中岩藻糖基化差异蛋白分离鉴定方法的建立。首先，我们对维甲酸(RA)诱导小鼠胚胎干细胞分化作用进行了验证。其次，我们利用岩藻糖类似物—6-叠氮岩藻糖(6-azide-Fuc)和凝集素，对细胞分化过程中岩藻糖基化的变化趋势进行了检测。实验发现，在RA诱导小鼠胚胎干细胞(E14.1)分化过程中，岩藻糖基化呈现先上升后下降的变化趋势。岩藻糖基化相关酶同样在分化过程中发生变化。我们发现，岩藻糖基转移酶mFUT8以及岩藻糖供体合成相关酶岩藻糖合成酶(FX)、岩藻糖焦磷酸化酶(FPGT)的敲低，会导致小鼠胚胎干细胞E14.1在RNA水平上出现初步分化趋势，而细胞表型以及碱性磷酸酶(AP)染色检测结果显示细胞并未发生分化，表明单独抑制岩藻糖基化水平仅能影响部分基因转录，但无法诱导小鼠胚胎干细胞细胞发生分化。接着，我们进行了岩藻糖基化相关酶敲低的诱导分化实验。蛋白质印迹(WB)结果表明单独敲低相关酶，并不会改变干性因子蛋白水平，而抑制细胞岩藻糖基化水平可以加速小鼠胚胎干细胞RA诱导分化进程，且加速幅度与岩藻糖基化抑制水平相关，敲低从头合成关键酶FX对细胞岩藻糖基化水平抑制最大，能够最大幅度的加速细胞分化进程。上述结果表明，岩藻糖基化确实能够影响细胞干性状态，调控细胞分化进程。　　接下来，我们建立了一个分离鉴定分化过程中岩藻糖基化差异蛋白的方法，我们给细胞喂养6-azide-Fuc进行代谢标记，然后添加RA进行诱导分化，分别收集RA诱导0天、2天的细胞分成两组，裂解得到蛋白，通过点击化学与带有炔烃的生物素进行偶联，然后用链霉亲合素微珠特异性结合糖基化蛋白，使用胰酶水解成肽段。收集上清液分别加入甲醛、氰基硼氢化钠与氘代甲醛、氰基硼氘化钠进行二甲基标记，然后混合成一管进行冻干，质谱分析。根据质谱结果，筛选出分化前后差异蛋白锌指核仁蛋白(LYAR)和DNA转录结合因子(Rb1cc1)。其中LYAR在维持胚胎干细胞稳态中具有重要作用。而Rb1cc1在心脏发育、肌肉分化等过程中发挥作用。　　综上，本课题将岩藻糖基化与干细胞分化联系在一起，为细胞分化调控提供了新的研究方向，为细胞分化过程中关键性岩藻糖基化蛋白的分离鉴定提供了新的方法。

关键词： 子宫腺肌病   在位内膜   表观遗传学   DNA甲基化  

摘要： 研究目的:子宫腺肌病是常见的妇科疾病,目前发病机制仍不清楚,被大部分学者广泛接受的理论是子宫内膜向子宫肌层内陷侵袭和生长引起。既往研究发现子宫腺肌病在位内膜在分子水平上存在多种异常。部分学者研究发现表观遗传学参与到子宫腺肌病的发病机制中,但对于子宫腺肌病在位内膜表观遗传学方向的研究目前国内外报道仍较少。DNA甲基化是表观遗传学研究的重要范畴之一,既往研究表明子宫腺肌病在位内膜中DNA甲基转移酶异常表达,但尚未对子宫腺肌病在位内膜DNA甲基化图谱进行全面的了解。因此,我们进行本研究探索子宫腺肌病在位内膜DNA差异甲基化图谱及筛选差异甲基化区域相关基因,为后续研究提供备选位点。研究方法:收集在北京协和医院行全子宫切除手术的6例子宫腺肌病患者的在位内膜及3例正常内膜,进行全基因组DNA甲基化测序和转录组测序,通过生物信息学分析的方法,得到两组间差异甲基化区域(DMR)和差异基因,进一步对上述结果进行联合分析,从而筛选出候选差异甲基化基因。研究结果:子宫腺肌病在位内膜较正常对照内膜有1443个差异甲基化区域,其中230个差异甲基化区域预测为基因调控区域,127个为相对高甲基化区域,相关基因182个;103个为相对低甲基化区域,相关基因146个。转录组测序中两组间检测到差异基因1217个,子宫腺肌病在位内膜组表达上调的差异基因926个、表达下调的差异基因291个。联合分析得到调控区域差异甲基化且差异表达的蛋白编码基因11个,这些基因GO功能富集在中胚层发育调节、细胞与细胞间连接、Wnt蛋白结合等,KEGG信号通路富集在Wnt信号通路、Hippo信号通路等。其中差异甲基化水平与基因表达水平呈负相关的蛋白编码基因5个:FM02、TP63、CADM2、DLG2、CCDC178。子宫腺肌病在位内膜组中,TP63、DLG2、CCDC178基因调控区域相对低甲基化、基因表达水平上调,结合基因功能阐述及既往研究,这3个基因在细胞增殖、凋亡、分化、迁移、炎症反应、纤维化等方面发挥作用。结论:本研究联合全基因组DNA甲基化测序和转录组测序技术,首次构建了子宫腺肌病在位内膜DNA差异甲基化图谱,筛选出与子宫腺肌病发病机制相关的差异甲基化基因:TP63、DLG2、CCDC178,为后续子宫腺肌病表观遗传发病机制研究提供新的备选位点。

关键词： 细胞分化   肝脏细胞   生物人工肝   胚胎干细胞   人工肝装置   成纤维细胞  

摘要： "走近科学"是本刊科研项目科普化报道的传统栏目,从本期开始,我们选择一批上海市获得国家及上海市科技奖励的成果进行报道。本篇报道的是2018年度自然科学奖一等奖"项目细胞属性转变的基础和应用研究",该项目由中国科学院上海生命科学研究院惠利健团队获得。

关键词： 全基因组重测序   BAC文库   ZW染色体DNA候选片段   性别分子标记  

摘要： 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要养殖蟹类,因为雌性蟹的‘蟹黄’具有较高的食用价值深受消费者喜爱,性别机制研究对于生产上性别控制,实现单性化养殖具有重要的应用价值。之前研究结果表明中华绒螯蟹性别决定属ZW/ZZ型,但由于其染色体数目庞大(2n=146)且太小,无法通过染色体核型分析辨别性别染色体,而基因组测序将二倍体序列组装成单倍体序列也无法将ZW性别染色体序列区分开来。本文利用全基因组重测序方法鉴定出ZW性染色体DNA候选片段,然后以性染色体候选片段筛选BAC文库,从而获得较长的性染色体序列,不仅可以分离鉴定中华绒螯蟹性别分子标记还有助于性染色体基因组序列组装,为后续研究性染色体进化以及性别相关基因奠定基础。之前本研究组完成了中华绒螯蟹全基因组测序,并构建了高密度遗传连锁图谱,通过性别QTL关联分析显示第48号连锁群(LG48)为性别连锁群,其上包括146个性别连锁SNP(single nucleotide polymorphism)标记。这些SNP分布在基因组的27个scaffolds上,本文随机选取20个scaffolds,设计了共70个性别分子标记候选用于筛选雌雄差异片段。为了获取中华绒螯蟹ZW染色体DNA候选片段,同时利用二代测序技术对1个雌蟹(ZW)、2个雄蟹(ZZ)个体的全基因组进行重测序,获得的reads分别与雌蟹参考基因组的scaffolds比对,统计覆盖到scaffolds的雌雄reads比率参数CQ(染色体熵),理论上CQ=2(1.7～2.3)的scaffolds为Z染色体DNA候选片段,CQ=0(0～0.3)的scaffolds为W染色体DNA候选片段。48号性别连锁群的CQ分析结果显示,共有51个Z染色体CQ候选片段(分布于18个scaffolds)和80个W染色体CQ候选片段(分布于15个scaffolds);随机挑选40个Z染色体CQ候选片段,利用q PCR验证Z染色体DNA候选片段在雌、雄DNA中的拷贝数,结果显示共有5个CQ片段显示在雄与雌DNA中的拷贝数比例约2:1,其余35个CQ片段接近1:1,表明Z、W性染色体之间同源序列较多,性染色体可能处于早期分化阶段。对CQ=0的80个W候选片段设计特异性引物,以10个雌性和10个雄性个体的DNA为模板进行PCR扩增,成功获得了一条仅在雌性个体基因组扩增的W特异性条带(560bp)。为了获取与此W对应的Z染色体同源候选片段,在W特异序列两侧设计引物,在雌性个体中扩增出两条带(1156bp和820bp),而在雄性个体中仅有一条带(1156bp)。序列分析结果显示,中华绒螯蟹的性别特异性序列有70%的同源性,表明中华绒螯蟹存在明显的性别特异性分化。雌性特异性片段有3个缺失区和108个核苷酸位点突变。雄性相关片段仅缺失2-bp和1-bp。q PCR结果表明1156bp的DNA片段在雄与雌DNA基因组的拷贝数比例约2:1,从而进一步证明了获得的雄性纯合片段来自Z,而雌性杂合片段分别来自ZW。为了验证性别分子标记是否存在不同地理种群差异,从辽河、长江、黄河、闽江、广西合浦等5个地方采集各20尾绒螯蟹雌雄个体,提取基因组DNA为模板进行PCR扩增,结果均显示雌性个体出现两条DNA带(1156bp和820bp)而在雄性个体中仅出现一条DNA带(1156bp),从而表明分子标记稳定并且适用于我国中华绒螯蟹不同种群,再次证实了中华绒螯蟹性别决定机制为雌性异配型(ZW),雄性同配型(ZZ)。与此同时为了验证该标记是否也适合种间性别检测,挑选20个日本绒螯蟹雌雄个体进行PCR验证,结果显示无雌雄差异的条带,说明此标记不适用于日本绒螯蟹,但另一个W特异的分子标记(560bp)能够适用。为了获取更长的Z、W染色体DNA片段以便进行功能基因注释,本文进一步以其为探针筛选了中华绒螯蟹BAC基因组文库。以各混合池BAC质粒DNA为模板,用分步PCR方法对401块一级混合池和520块二级混合池三维交叉筛选,获得了Z、W染色体候选片段共7个阳性单克隆;并对一个W候选片段的阳性克隆(P282E21)进行Pac Bio测序及基因注释,获得了一条45388bp的W染色体DNA序列,与基因组对应的scafold共线性比对相似度高达95%,初步分析了W染色体的结构并预测到了6个功能基因。

关键词： 人胚胎干细胞   人神经干细胞   分化   SB431542   DMH1   脑缺血   重复经颅磁刺激   人神经干细胞   神经功能   重复经颅磁刺激   人神经干细胞   存活   增殖   分化   神经环路  

摘要： 目的为了获得足够数量的h NSCs,采用单层分化培养方法,利用化学小分子将h ESCs分化为可用于移植的h NSCs。方法采用单层分化培养方法,将h ESCs接种到经放射的小鼠胚胎成纤维细胞(radiative mouse embryonic fibroblasts,r MEFs)饲养层细胞上,加入SMAD信号通路抑制剂的化学小分子DMH1、SB431542,隔天换液,贴壁培养6天后,用dispase消化传代,按照1:2比例接种,继续培养6天,在贴壁培养12天后悬浮培养,在分化18-20天之后,将神经球消化成单个细胞,一部分贴壁到多聚鸟苷酸/层粘黏蛋白(PLO/Laminin)包被的盖玻片上继续培养,剩余细胞移植到大鼠体内。在细胞分化的不同阶段,用免疫荧光的方法检测相关功能标志物Foxg1、Otx2、Sox1、Nestin、Ki67、Pax6、Tuj1、Map2、Synapsin等的表达。结果1.在SMAD信号通路抑制剂化学小分子DMH1、SB431542的作用下,持续诱导h ESCs 10天,可出现典型的玫瑰花簇样的神经上皮细胞,该细胞可表达前脑标志物Foxg1、Otx2和神经上皮细胞的标志物Sox1、Pax6。2.免疫荧光染色结果表明,在神经前体细胞阶段,细胞向背侧前脑的方向进行分化,表达前脑神经干细胞的标志物Ki67、Nestin、Foxg1,以及背侧前脑的标志物Pax6。3.细胞在体外贴壁培养1个月,即分化50天后,可分化为成熟的神经元,该神经元为谷氨酸能神经元,细胞发出神经丝并且可表达突触蛋白的标志物Synapsin。结论通过单层分化培养方法,在分化的特定时期加入SMAD信号通路抑制剂化学小分子DMH1、SB431542,可将h ESCs在体外诱导分化为前脑背侧的h NSCs,最终可分化为成熟的谷氨酸能神经元,并具有在细胞间形成突触连接的能力。目的观察r TMS联合h NSCs移植对脑缺血大鼠运动功能障碍的影响,同时对其机制进行初步探讨。方法选择体重230-250 g的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,将造模成功的大鼠随机分成四组:(1)对照组(vehicle):移植细胞培养基;(2)h NSCs移植组(h NSCs):大鼠纹状体移植2.5×105个h NSCs;(3)r TMS治疗组(r TMS):大鼠纹状体注射等量的细胞培养基,给予r TMS治疗;(4)h NSCs+r TMS联合治疗组(h NSCs+r TMS):大鼠纹状体移植2.5×105个h NSCs,同时给予r TMS的治疗。在大鼠造模成功后的第4天移植细胞,24 h后给予r TMS的刺激,连续干预28天,同时各组大鼠每天注射免疫抑制剂环孢素A(10 mg/kg)。在造模前、细胞移植前、细胞移植后的不同时间点,通过抓力计、抓绳实验、提尾实验检测大鼠行为学的变化,在所有动物完成行为学检测后,一部分大鼠用10%水合氯醛深麻醉,断头新鲜取材,用蛋白印迹法western blot检测相关蛋白BDNF、Trk B和p-Trk B的变化,另外一部分大鼠深麻醉后,用生理盐水、4%多聚甲醛灌注取材,组织切片后用尼氏染色、免疫荧光染色法分别检测大鼠脑梗死体积及患侧SVZ区NSCs增殖情况。结果1.成功建立了SD大鼠MCAO模型,并进行了h NSCs移植和r TMS的治疗,各组大鼠生存率分析结果表明,vehicle组、h NSCs组、r TMS组和h NSCs+r TMS组之间大鼠存活率无统计学意义(P>0.05)。2.各组大鼠梗死体积检测结果显示:与vehicle组相比,h NSCs+r TMS组大鼠皮质宽度指数值显著增大(P<0.05)。尼氏染色结果显示,与vehicle组相比,h NSCs+r TMS组大鼠脑组织的梗死体积明显减小,且有统计学意义(P<0.05)。3.动物行为学检测结果显示:在抓力计实验测试中,h NSCs+r TMS组与vehicle组、h NSCs组、r TMS组相比,大鼠偏瘫侧抓力显著提高(P<0.001,h NSCs+r TMS vs vehicle;P<0.001,h NSCs+r TMS vs h NSCs;P<0.01,h NSCs+r TMS vs r TMS);r TMS组与vehicle组相比,大鼠偏瘫侧抓力的恢复有统计学意义(P<0.01)。在抓绳实验中,h NSCs+r TMS组与vehicle组、h NSCs组相比,大鼠前肢抓力明显提高(P<0.001,h NSCs+r TMS vs vehicle;P<0.01,h NSCs+r TMS vs h NSCs);r TMS组与vehicle组相比,大鼠前肢抓力的恢复