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关键词： 蓝藻   生物钟   节律性   温度补偿   基因工程  

摘要： 蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942(*** PCC 7942)是研究生物钟节律性的最简单模式生物之一,其基因组中绝大多数基因的转录活动都受到内源生物钟的调控。Kai ABC基因簇编码了该种蓝藻生物钟核心震荡器的基本分子组件,在蓝藻生物钟节律性的分子调控过程中起着至关重要作用。温度补偿特性是所有已知生物钟模型的基本属性之一,人们在以蓝藻*** PCC 7942为对象的生物钟节律性研究中发现,温度补偿属性的产生与维持往往与Kai基因家族的功能紧密相关。本实验室在前期工作中筛选得到一个Kai ABC基因簇序列完好,但生物节律性温度补偿属性表型为温度条件型的蓝藻突变体nktc1(Non-Kai Thermo-regulatory Component 1)。本论文以实验室保存的蓝藻*** PCC7942的nktc1突变体为对象采取基因工程方法对其温度补偿异常表型的分子机制进行了初步探究。本论文的具体研究内容如下:1.首先基于基因组测序和基因克隆的方法确定了nktc1的突变位点。相关实验结果表明nktc1突变体的准确突变位点是蓝藻基因组中的Synpcc 7942＿0644(即CikA基因)与Synpcc 7942＿0095(即RpaA基因)等2个单碱基置换位点,并且均导致了各自编码产物蛋白的1个氨基酸错义突变。其中被命名为nktc-cik A的突变位点可以导致野生型CikA蛋白中559位Phe突变为Ser;被命名为nktc-rpaA的突变位点可以导致野生型RpaA蛋白中118位Ala突变为Thr。2.接着使用基因工程方法,分别构建nktc-cik A突变位点的单基因突变重构藻株nktc-cik A-m和nktc-rpaA突变位点的单基因突变重构藻株nktc-rpaA-m,以及nktc-cik A突变位点原位回复藻株19T-cik A-R和nktc-rpaA突变位点原位回复藻株19T-rpaA-R,还构建了nktc-cik A突变位点异位回复藻株NS-CikA-R、nktc-rpaA突变位点异位回复藻株NS-RpaA-R和2个突变位点异位组合回复蓝藻株系NS-CikA-RpaA-R等7种转基因蓝藻株系;3.以前述通过基因工程方法构建的7种转基因藻株、野生型蓝藻S149和nktc1为对象,对各蓝藻藻株进行低温驯化处理后,分别利用RT-q PCR和Western blot方法对KaiC基因的表达节律及KaiC蛋白的磷酸化状态节律性进行检测,结果显示:低温驯化处理野生型蓝藻S149、nktc-cik A-m、nktc-rpaA-m及NS-RpaA-R既可以在转录水平上有效驯化中KaiC基因转录的生物钟节律性相位,也可以在翻译后修饰水平上有效驯化KaiC蛋白磷酸化修饰状态的生物钟节律性相位。但是nktc-cik A-m周期长度变短;nktc-rpaA-m与NS-RpaA-R周期长度变长。而蓝藻nktc1、NS-CikA-R、NS-CikA-RpaA-R既不能在转录水平上有效驯化KaiC基因的转录节律性相位,也不能在翻译后修饰水平上有效驯化其KaiC蛋白磷酸化状态的生物钟节律性相位。低温驯化处理19T-CikA-R与19T-RpaA-R藻株并不能牵引KaiC蛋白磷酸化修饰状态的节律性相位,但都可以在转录水平上有效驯化中KaiC基因转录的生物钟节律性相位。其中19T-CikA-R中节律性的周期长度变短;19T-RpaA-R周期长度变长。4.初步分析了CikA和RpaA等2个基因在蓝藻生物节律性温度补偿属性调控中可能的功能。基于现有实验的结果,论文初步确定CikA基因和RpaA基因及其各自对应的表达产物可能通过2条不相同的下游通路影响了*** PCC 7942生物钟温度调控过程。其中CikA基因可能参与了该种蓝藻生物钟温度调控的负反馈调控过程,而RpaA基因则可能参与了蓝藻生物钟温度调控的正反馈调控过程。

关键词： 石斑鱼   小球藻   病毒性神经坏死病   褶皱臂尾轮虫   混合饲料  

摘要： 石斑鱼是一种富含多种矿物质元素和维生素,深受消费者喜爱的海水食用鱼,也是我国东南沿海(福建、广东、海南)等地区重要水产养殖鱼类。近年来,在人工养殖石斑鱼过程中深受虹彩病毒病、肠炎、寄生虫病等多种疾病困扰,其中尤以病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN)最为严重,该病在损害养殖户利益的同时也极大阻碍了我国水产养殖业的发展。VNN主要爆发于海水鱼类的育苗期间即幼鱼期和稚鱼期,是由病原神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)入侵鱼体,导致患病鱼行为异常,运动失衡,厌食绝食,最终死亡的一种大危害性、高发生率的病毒性疾病。距今为止,尚未发现有特效药物、有效疫苗或比较好的防治手段去预防或治疗该病,故到目前为止石斑鱼的养殖工作仍然受到很大的阻碍。因此本研究利用转基因微藻混合海水鱼饲料,投喂石斑鱼使其从幼苗阶段就开始获得持续性抗原免疫,来预防病毒性神经坏死病。本研究已从以下方面进行:生物饵料的筛选、纯化、保种、大规模培养;使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR表达载体转化入小球藻中,经筛选、DNA鉴定后选出转基因小球藻。先利用转基因小球藻配合海水鱼饲料制作混合饲料投喂石斑鱼,而后进行攻毒实验,并对其预防效果进行评价。研究结果如下:1、采用平板划线法将小球藻保存于固体TAP培养基,并通过逐级扩大培养法进行扩大培养。使用封闭式光生物反应器养殖小球藻,共获得纯净无污染的小球藻液1500L,将生产得到的小球藻用于石斑鱼混合饲料的制作。2、培养纯净无污染的轮虫作为石斑鱼养殖中的生物饵料,从养殖用水盐度、pH、饵料投喂量方面确定了“S”型褶皱臂尾轮虫养殖条件。经本研究结果显示养殖用水盐度20～30时,轮虫种群密度、日平均增殖率达到最大。盐度10～20时,种群密度随盐度升高而增加,当盐度低于10,随盐度降低轮虫增殖效率逐渐下降,盐度低于5轮虫彻底死亡;当pH在7.5～8.5范围时,种群密度、日平均增殖率达到最大值;在盐度、pH、温度等条件适宜情况下,本实验所设置的各个投喂量梯度中维持轮虫培养液中小球藻密度在5×106个/mL以上获得最大种群密度,故得出结论投喂间隔越短、投喂量越大,轮虫种群增长速率越快,最终可以达到的种群密度也会略有上升。3、使用电击转化法将pMaa7IR/DGNNVIR重组载体转入小球藻中,电击条件为:转化电压800V～1600V,脉冲长度032μs,脉冲间隔200ms,脉冲次数90次,电击2～3次;使用10μg/mL巴龙霉素固体TAP培养基进行筛选,并对已筛选过的小球藻进行DNA鉴定,最终获得8株转基因小球藻,对转基因小球藻进行扩大培养,共获得1500L转基因小球藻液。4、将采收的小球藻藻液离心,刮取藻泥,按藻泥:饲料(1:1)比例制作混合饲料,最终制得950g的混合饲料颗粒。使用混合饲料连续投喂石斑鱼,饲养10天后进行攻毒实验。将已经确定病毒拷贝数的病毒提取液(24copies/μL),使用腹腔注射的方法进行攻毒。攻毒过后从分子水平、细胞学水平、生物学水平进行效果评价。结果显示在攻毒48h后实验组石斑鱼眼、脑组织内病毒含量相比于对照组石斑鱼分别降低了 51.70%、48.47%、53.02%;攻毒48h后取石斑鱼眼、脑组织,制作组织切片可清晰看到鱼眼视网膜、脑组织开始出现空泡化病理变化;攻毒后第2、4、6、10、14天对各组石斑鱼取样测定石斑鱼体内神经坏死病毒拷贝数,结果表明,实验组石斑鱼体内病毒增长趋势、病毒拷贝数要低于对照组;攻毒14天后统计最终成活率。最终成活率:DGNNVRNAi1混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%,DGNNVRNAi2混合饲料组相较于对照组提高了 22.0%,DGNNVRNAi3混合饲料组相较于对照组提高了 26.0%。综上所述,经实验结果分析表明转pMaa7IR/DGNNVIR基因小球藻在预防石斑鱼神经坏死病方面有一定作用,可以有效地抑制病毒在石斑鱼体内增殖。

关键词： 全能性   2-细胞样细胞   染色质三维结构   拓扑关联结构域   染色质环   增强子   CTCF   cohesin  

摘要： 在配子受精后,表观遗传上不同的亲本基因组向全能性方向重编程,随后启动合子基因组激活(ZGA)事件。在小鼠中,ZGA在2-细胞(2C)时期达到峰值,其特征是激活例如Zscan4簇等2-细胞特异性基因和内源性逆转录病毒MERVL的转录。ZGA事件后,细胞的分化潜能逐渐受到限制,全能性的分子特征曾被认为是合子和最早期卵裂胚胎所独有的。小鼠胚胎干细胞(ESC)来源于囊胚时期的内细胞团,因其具有能够发育成所有三胚层细胞的能力而被视为多能性细胞,但其几乎不对胚胎外组织的形成有任何贡献。然而体外培养的小鼠ESC中,有极小部分(0.2%-5%)细胞具有全能性,或者说扩展的多能性,它们具有同时向胚胎组织和胚外组织分化的能力。此类细胞被称为2-细胞样细胞(2CLC)。2CLC的发现为研究早期胚胎以外的全能性和ZGA的分子调控提供了有利的实验工具。为了探究染色质三维结构在调控细胞潜能中的作用,我们使用小鼠ESC中的多能性至全能性转变作为模型,定义了松散的3D基因组构象在建立全能性中的作用。通过使用低细胞起始量组学技术,我们绘制了全能2CLC和多能ESC的全基因组染色质三维构象图谱(Hi-C),以及它们的转录组(RNA-seq),染色质可及性(ATAC-seq)和组蛋白修饰图谱(ChIP-seq)。这个丰富的数据集使我们能够研究多能到全能状态转换过程中染色质状态和基因表达的动力学。我们发现,自发的2C样转变期间,ESC的染色质结构变得更加松散,染色质环整体减弱,这不仅包括拓扑关联结构域(TAD)边界环,还包括ESC增强子(特别是超级增强子)及其邻近基因启动子之间的染色质环。两种染色质环的丢失导致TAD边界环的绝缘性和ESC特异的增强子/超级增强子活性下降,进而引起多能基因(如Oct4、Sox2和Nanog)的转录下调。我们还观察到了 ESC向2CLC转变过程中2C增强子的形成。在2C样转变过程中,上调基因(如Nelfa)倾向于具有ESCTAD边界,将它们与相邻的2C增强子分开。因此,破坏ESC中的TAD边界环可能会促进在ESC中偶发激活的2C增强子与附近2C基因的启动子之间的接触,从而促进它们的表达,进而完全激活2C样转录程序。随后,我们进一步证明了松散的染色质结构和全能性获得之间的因果关系。在ESC中破坏染色质架构蛋白CTCF或cohesin以破坏两种染色质环,可以促进2C样转变。综上所述,染色质三维结构在调控细胞潜能中具有关键作用。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   多能性   LIF   诱导   基因组  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)是一种来源于3.5天囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)的多能性干细胞,具有无限自我更新能力。自从1981年第一次建立小鼠ESCs以来,ESCs体外培养体系一直是科学研究的热点之一。2008年科研人员开发化学成分明确的2i/LIF(Mek1/2和Gsk3b的抑制剂,简称2i;LIF:白血病抑制因子)培养体系。该培养体系主要通过调节经典的WNT、FGF/ERK和JAK/STAT3等信号通路来维持小鼠ESCs的na?ve多能性,但是这三种小因子中的某一种成分可以维持小鼠ESCs的自我更新和na?ve多能性并不清楚。在这里,我们主要研究应用LIF能否建立L-ESCs细胞系,并鉴定其细胞的特性。首先在2i/LIF培养体系中去掉2i,观察单独使用LIF能否维持小鼠ESCs多能性,其次建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系,我们将其命名为L-ESCs,对其细胞特性、多能性、体外分化和体内发育潜能等方面进行鉴定。实验结果如下:1.建立LIF依赖性新型小鼠胚胎干细胞系本实验用LIF培养体系对6种2i/LIF培养的ESCs(2i/L-ESCs)进行16次诱导,均成功建立L-ESCs细胞系。而且,L-ESCs的形态学特征和单细胞形成克隆能力均与2i/L-ESCs相似。2.L-ESCs的多能性鉴定通过碱性磷酸酶染色、实时荧光定量PCR和免疫荧光染色等一系列实验,鉴定L-ESCs具有与2i/L-ESCs相似的多能性特征,部分细胞保留有2-cell胚胎时期的特征;更重要的是,核型分析发现,与2i/L-ESCs相比,L-ESCs的染色体组成更为稳定。3.L-ESCs的体外分化和体内发育潜能鉴定L-ESCs具有体外分化为中胚层、内胚层和外胚层的能力,并且分子检测发现具有较强的三胚层标记基因和蛋白质表达;在体内发育潜能上,L-ESCs能形成畸胎瘤、可贡献E13.5胎儿及其生殖嵴。综上所述,只添加LIF培养体系能够维持小鼠ESCs的自我更新和多能性及体内发育能力。该研究及进一步对L-ESCs的重组机制及后天修饰的研究,为未来ESCs的临床应用会提供一个很好的理论与技术支撑。

关键词： 基因工程   基因编辑   遗传学   新兴技术   科技伦理   风险防控   genetic engineering   gene editing   emerging technologies   technological ethics   risk prevention and control  

摘要： 面对带来难于预测后果的新兴技术的迅速发展，现代伦理需要增加一种“提前性”，即加强动机溯源和后果预测。基因工程因为涉及人类的生命、特性和遗传方面的改造，关系尤其重大。在这方面，理想的尤其是完美主义的目的也许并不能带来好的结果，而人们出于现实的复杂动机的、用于人体尤其是生殖细胞的基因编辑实验更是风险巨大。防范这些风险不能只寄希望于科学家的自律，更需要政府加强法律的监管。这同时也迫切需要现代伦理为之提供原则的理据，归纳分析各种行为可能的动机和预防的手段，包括恰当地认识人的本性和人在宇宙中的位置。

关键词： 对分课堂   互联网   线上课程   基因工程  

摘要： 基因工程是生物技术的重要组成部分,其知识体系庞大,内容艰涩难懂,学生学习起来有困难。为满足"一流课程"建设的需求,实施信息化教学,提高基因工程教学效果,本研究将对分课堂和原有的线上线下混合教学模式结合,并在基因工程课程中进行教学实践。期末以线上成绩、考试成绩、期末总评与问卷反馈等方面考查对分课堂引入基因工程教学中的教学效果。结果显示,引入对分课堂后,学生的线上成绩、考试成绩、期末测评成绩均极显著高于未采用对分课堂学生的学习成绩,表明对分课堂的教学模式可提高基因工程教学效果。调查反馈显示,97.7%的学生对这种教学模式比较满意,95.2%的学生愿意继续采用该教学模式学习。以上结果显示,对分课堂这种教学模式可满足基因工程一流课程的教学需求,提高教学质量。

关键词： 胎儿游离DNA   锚定多重PCR   二代测序   无创性产前诊断   β-地中海贫血  

摘要： 目的探索β-地中海贫血的无创性产前检测技术,利用孕妇血浆胎儿游离DNA和父亲外周血开发一种对胎儿进行非侵入性产前诊断的临床应用研究。进一步探讨孕妇血浆胎儿游离DNA对胎儿β-地中海贫血非侵入性产前诊断的临床应用价值。方法从海南医学院第一附属医院产前诊断中心就诊的孕妇中,收集了10例夫妇双方携带非同型的β-地贫突变基因的志愿者家系,经孕妇和她的丈夫双方知情同意后签署知情同意书。在妊娠17周至28周时经腹穿刺羊膜腔抽取羊水这一常规的有创性产前检测的方法,应用反向斑点杂交技术检测出羊水细胞的β-地中海贫血基因型,判断有无携带父源性β-地中海贫血突变基因,将此作为金标准;采用乙二胺四乙酸二钾采血管采集孕妇静脉血10ml,同时采集丈夫静脉血2ml,提取孕妇血浆胎儿游离DNA及夫妇双方DNA,应用锚定多重PCR联合二代测序(高通量测序)技术,经过对比计算得出孕妇血浆胎儿游离DNA中是否存在父源性β-地中海贫血突变基因,将其与上述金标准进行对比分析,比较两者的一致性,从而验证应用锚定多重PCR联合二代测序法在孕妇血浆胎儿游离DNA中无创性产前检测胎儿β-地中海贫血的准确性和稳定性。结果1、在10例夫妇非同型β-地中海贫血的高危家系的孕妇血浆胎儿游离DNA中应用锚定多重PCR联合二代测序法经对比计算得出,4个β-地中海贫血高危家系的胎儿存在父源性β-地中海贫血突变基因,其余6个β-地中海贫血高危家系的胎儿不存在父源性β-地中海贫血突变基因。2、存在父源性β-地中海贫血突变基因的4个胎儿,其羊水细胞的β-地中海贫血基因型均遗传了来自其父亲的β-地中海贫血的突变基因;而其余6个胎儿不存在父源性β-地中海贫血突变基因的胎儿,其羊水细胞β-地中海贫血基因型中均没有遗传来自其父亲的β-地中海贫血的突变基因。结论1、应用锚定多重PCR联合二代测序法这一无创性产前检测技术,经对比计算分析后得出胎儿游离DNA中是否存在父源性β-地中海贫血的突变基因,其判断与运用反向斑点杂交技术检测羊水细胞的β-地中海贫血父系遗传结果相一致;2、锚定多重PCR联合二代测序技术是一种无创性产前检测β-地中海贫血的方法,在夫妇携带非同型的β-地中海贫血突变基因的高危家系中,可用于胎儿重型β-地中海贫血的排除。

摘要： 6月16日,中国科学院上海巴斯德研究所与江苏中慧元通生物科技有限公司（简称"江苏中慧元通生物"）就新冠病毒肺炎（COVID-19）基因工程疫苗（毕赤酵母）在全球范围内的研发、生产和商业转化签署合作协议。根据协议,上海巴斯德所疫苗学与抗病毒策略研究团队将与江苏中慧元通生物项目团队联合攻关,发挥上海巴斯德所的疫苗创新优势和江苏中慧元通生物的疫苗

关键词： 转基因作物   生物安全   Bt蛋白   蜘蛛   共生菌  

摘要： 转基因作物的全球化种植减轻了害虫的危害,其对环境的安全性评估一直受到关注亦。棉田中存在众多害虫天敌,蜘蛛便是其中重要一种,而Bt是否对蜘蛛有影响却鲜有报道。本研究首先明确了棉田蜘蛛类群并鉴定了其共生菌组成,而后建立了Pardosa astrigera饲养方法并评价了多种Bt蛋白对其潜在影响。主要研究结果如下:棉田蜘蛛类群鉴定与共生菌分析。在Bt棉(L280,Cry2Ab)整个生长季节,蜘蛛群落丰度最低在5月(0.28%),最高在8月(30.39%),10月回落至12%。采用陷阱法、直捕法共采集到13342只蜘蛛,鉴定到27个种,其中优势种为草间钻头蛛Hylyphantes graminicola(68.56%)和茶色新圆蛛Neoscona theisi(19.98%)。棉田蜘蛛体内微生物群落组成和结构与物种类型相关,相对丰度最高的依次为Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes,最丰富的菌属是Wolbachia。***饲养方法建立。比较了不同饲养空间、供食昆虫、人工饲料组成对***的成活率、繁殖力等的影响:活体昆虫组合(果蝇、豌豆蚜和棉蚜)饲养,成蛛存活率最高,达46%;液态人工饲料(牛奶和蛋黄)条件下,5龄若蛛存活率较低,为33%;玻璃管(50 m L)饲养时,其存活率仅为38%,塑料杯(250 m L)饲养时,其存活率显著提高,达66%。Bt蛋白对***的安全性评估。用取食不同浓度Bt蛋白(Cry2Aa、Cry1Fa)后的棉铃虫幼虫饲喂***,发现这两种Bt蛋白对其存活率、生长发育、发育历期、体重均无显著影响。而阳性对照呋虫胺(dinotefuran)显著影响其存活,3.29g/m L剂量下,存活时间小于5天。Bt蛋白对***共生菌的影响评估。Cry2Aa和Cry1Fa处理改变了其微生物群落组成,且不同处理差异显著。相对于对照组,处理组某些菌未被检测到,而可检测到某些雄蛛或雌性特有菌,如Wolbachia,Clostridium sensu stricto 1,Gluconacetobacter,Glutamicibacter,Lactococcus,Aureimonas,Comamonas。在属水平上,除取食Bt的雌蛛外,Corynebacterium 1丰度最高。Cry1B蛋白对***生物学的影响。***用果蝇饲养,定期补充含Cry1B的水。成人成蛛、2龄若蛛的存活率、体重增量,雌雄蜘蛛交配时间、卵囊产卵、卵囊脱落、蜘蛛幼体孵化率,2龄若蛛共生菌多样性等均未受到显著影响,而阳性对照组呋虫胺(dinotefuran),成人成蛛、2龄若蛛在5天、3天内全部死亡分别。处理组成蛛、对照组雄蛛体内分别未检测到Jeotgalicoccus、Lactobacillus。除对照组雌蛛外,Corynebacterium 1的丰度较高。其中,在属水平,Acinetobacter丰度最高。综上,饲喂3种Bt蛋白后,Pardosa astrigera的体内微生物多样性和丰富度均受到影响,而存活率、发育历期、繁殖力等数据又显示Bt蛋白对蜘蛛安全。因此,需要进一步深入评估种水平上Bt蛋白对蜘蛛细菌共生菌的影响。

关键词： 酿酒酵母醛酮还原酶   葡萄糖脱氢酶   基因工程   双酶剪接体  

摘要： 随着现代生物工程技术的发展,利用生物酶催化生产复杂化合物在实际生产领域种发挥了越来越重要的作用。而在诸多手性分子中,双酮、双醛、醛酮类化合物占据了一席之地,如重要的降血脂药物他汀等。酿酒酵母醛酮还原酶(Gre2)是一种常见的醛酮还原酶,它对许多醛酮类物质都具有良好的催化能力,尤其是将双醛、双酮、醛酮类物质。通过Gre2,能够高效的催化产生手性药物中间体或者药物有效分子。而葡萄糖脱氢酶(GDH)是一种生物体内非常常见并且广泛用于酶催化工艺中的蛋白酶。它广泛参与了多种辅酶/还原性辅酶(NADP/NAPDH)依赖性酶催化体系。通过向其他酶供氢使得反应持续高效进行。在本论文中,首先通过基因工程技术,将Gre2与GDH基因一同连接在质粒表达载体上并转化进入感受态大肠杆菌内,利用菌落PCR技术以及酶切验证确认连接完成,诱导大肠杆菌表达双酶剪接体蛋白,双酶剪接体蛋白能够通过内含肽剪接效应在胞内完成自剪接过程,获得Gre2-GDH剪接体酶蛋白,证明能够在大肠杆菌中进行表达并发生自剪接形成稳定的双酶系统。在双酶剪接体表达系统的基础上,充分利用磷酸缓冲液与锌离子的配位效应,完成双酶蛋白的剪接工作,获得双酶剪接体。并利用扫描电镜(SEM),能谱分析(EDS),二维红外(2D-IR)等手段研究双酶剪接体的表征,用气象色谱(LC)探究该体系的酶活与催化能力。酶催化实验表明,与游离混合双酶相比较,双酶剪接体Gre2-GDH的效率提高了 2倍多。通过在PBS中与锌配位作用,对双酶剪接体Gre2-GDH进行了固定。固定酶对保持了游离双酶剪接体Gre2-GDH的活性。